高效液相色譜法測定保健食品中泛酸的不確定度評定

蔡良平，劉光蘭

湯臣倍健股份有限公司 (珠海 519040)

泛酸又名維生素B5，化學(xué)式為C9H17NO5，是一種水溶性維生素，因廣泛存在于動植物中而得“泛酸”之名。由于所有的食物都含有維生素B5，所以幾乎不存在缺乏問題[1,2]。泛酸幾乎存在于所有活細(xì)胞中，且在其細(xì)胞內(nèi)可以通過酶促反應(yīng)合成。泛酸是體內(nèi)檸檬酸循環(huán)、膽堿乙?；⒑铣煽贵w等代謝所必需的中間物[3,4]。因此，泛酸在體內(nèi)可作用于正常的上皮器官如神經(jīng)、腎上腺、消化道及皮膚，提高動物對病原體的抵抗力[5]，維生素B5及其衍生物還可以減輕抗生素等藥物引起的毒副作用，參與多種營養(yǎng)成分的吸收和利用[6-8]。

目前泛酸的檢測方法主要有高效液相色譜法、微生物法、實臉動物法、放射免疫法[9-11]，本次研究則是使用高效液相色譜法，參照J(rèn)JF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[12]及JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，根據(jù)GB 5009.210—2016[13-15]對泛酸含量的檢測，并對其各分量的不確定度進(jìn)行評估。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品(含量97.5%,擴展不確定度為1%)，SIGMA；乙腈(HPLC)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；磷酸二氫?AR)，廣東廣試試劑科技有限公司；多種維生素片；一級水。

1260型高效液相色譜儀(附帶紫外檢測器)，安捷倫科技有限公司；色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，安捷倫科技有限公司；XP205型電子天平，梅特勒-托利儀器有限公司；ELMA P300H型超聲波清洗器，德國ELMA。

1.2 方法

1.2.1儀器條件

色譜柱C18,柱長250 mm,內(nèi)徑4.6 mm,粒徑5 μm。檢測波長210 nm；流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液∶乙腈=95∶5(v/v)；流速1.0 mL/min；柱溫28 ℃±0.5 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品10.27 mg至100 mL容量瓶中，在室溫條件下，用水超聲溶解，放至室溫，定容至刻度，搖勻待用，濃度為0.099 41 mg /mL。

1.2.3供試品溶液配制

取適量以上試樣研磨并混勻，精密稱取0.5 g研磨均勻的樣品，置于具塞錐形瓶中，加入適量的水超聲提取20 min，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，為待測供試品溶液。

2.2.4數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中泛酸含量的計算如下：

X=V×C/M×0.92×K

式中：X為試樣中泛酸含量，mg/100 g；M為樣品質(zhì)量,g；V為樣品定容體積，mL；C為樣品濃度，mg/mL；0.92為泛酸鈣轉(zhuǎn)換為泛酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)；K為為單位轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值100。

2 結(jié)果與討論

2.1 不確定度各分量的來源與分析

依據(jù)全實驗過程及圖1所示的不確定度來源分析，主要有以下幾個不確定度來源：試樣重復(fù)性測定引入的不確定度ur(x1)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x2)；試樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3)；儀器(高效液相色譜儀)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x4)；標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x5)。

圖1 泛酸供試品含量測定的不確定度各分量直觀圖

根據(jù)試驗實際情況，選用線性模型公式，計算相對不確定度，合成公式如下：

2.2 不確定度各分量的評估

2.2.1測量重復(fù)性引入不確定度的測定

按GB 5009.210—2016第二法對定值樣品泛酸含量進(jìn)行測定，重復(fù)測10次，測定結(jié)果見表1。此重復(fù)測量屬于A類不確定度。

表1 多種維生素片樣品中泛酸的含量重復(fù)測定10次結(jié)果

按貝賽爾公式計算出試驗標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

在實際檢測過程中，測定供試品中泛酸含量2次時，取算術(shù)平均值為其檢測結(jié)果，所以重復(fù)性測定引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度的測定

3.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量本身引入的不確定度ur(x3.3.2.1)

3.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在稱量過程中引入的不確定度ur(x3.3.2.2)

3.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋和定容過程引起的不確定度ur(x3.3.2.3)

經(jīng)分析評估，溶液定容主要引入的不確定度為：50 mL容量瓶(A級)。環(huán)境溫度和玻璃容器對液體的體積有影響，會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制過程中的偏差。按均勻分布及最大允許誤差來處理，K為包含因子，分別計算各分量的不確定度。

3.3.2.3.1 50 mL單標(biāo)線容量瓶校準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3.3.2.3.1)

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：ur(x3.3.2.3.1)=0.028 8/50=0.000 576

3.3.2.3.2 校準(zhǔn)溫度、溶液溫度之間的差異引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3.3.2.3.2)

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x3.3.2.3.2)=0.261/50=0.005 21

50 mL A級單標(biāo)線容量瓶的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由上面分析可得，泛酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.3泛酸試樣引入標(biāo)準(zhǔn)不確定度的測定

3.3.3.1 試樣稱量過程中引入的不確定度ur(x3.3.3.1)

樣品稱量時的相對不確定度為：ur(x3.3.3.1)= 0.000 029 g/0.5=0.000 058 g

3.3.3.2 樣品定容引起的不確定度ur(x3.3.3.2)

溶液稀釋過程引起的不確定度主要是50 mL容量引入的不確定度。

3.3.3.2.1 50 mL單標(biāo)線容量瓶校準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3.3.3.2.1)

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x3.3.3.2.1)=0.028 9/50=0.000 576

3.3.3.2.2 校準(zhǔn)溫度、溶液溫度之間的差異引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x3.3.3.2.2)

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：ur(x3.3.3.2.2)=0.261/50=0.005 21

50 mL容量瓶產(chǎn)生的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

由上面分析可得，泛酸樣品引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.4高效液相色譜儀引入不確定度的測定

高效液相色譜儀引入的不確定度分量評定ur(x3.3.4)

3.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生不確定度的測定

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線信息

標(biāo)準(zhǔn)曲線信息見表2，線性方程為y=mx+b，即y= 4 009.929 26x+0.532 715，相關(guān)系數(shù)(R)為1.000 00。

標(biāo)準(zhǔn)曲線引入不確定的公式如下：

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。根據(jù)各分量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度值，進(jìn)行合成，則有：

表3 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度一覽表

各測量不確定度的統(tǒng)計直方圖如圖2所示。

圖2 各測量不確定度的統(tǒng)計直方圖

試樣測定平均值為388.9 mg/100 g，則泛酸測定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ucr(x)=x×ur(x)=19.05×0.026=10.1 mg/100 g

3.5 擴展不確定度

取置信概率p=95%,k=2，擴展不確定度等于包含因子與合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的乘積，則泛酸含量的擴展不確定度U95=k×ucr(x) =0.052 mg/100 g。因此，本次測定的泛酸試樣的平均含量為(388.9±20.2) mg/100 g

3 結(jié)論

從各測量不確定度的統(tǒng)計直方圖可以看出，試樣中泛酸含量測定引入的不確定度因素中，影響比較大的則是方法標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，影響較小的是樣品和色譜儀本身所產(chǎn)生的不確定度。此結(jié)果與本實驗操作過程是符合的，提示我們在使用此方法檢測泛酸含量的過程中，需注意標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，選用高級別容量瓶，同時還應(yīng)該對我們的分析天平以及高效液相色譜儀進(jìn)行定期的校準(zhǔn)與維護(hù)保養(yǎng)。并要求檢測人員熟練掌握方法要求各個步驟的操作，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。