新冠病毒S蛋白RBD突變侵染性增強(qiáng)潛在分子作用機(jī)制

劉巨釗， 楊玉萍， 徐建波， 呂鴻昌， 陳俊宇， 張春椿， 崔 琦

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,杭州 310053; 2. 北京郵電大學(xué) 現(xiàn)代郵政學(xué)院(自動化學(xué)院),北京 100876)

在南非發(fā)現(xiàn)的B.1.351毒株出現(xiàn)E484K突變體，使新冠病毒的傳播性和毒性均得到增強(qiáng)[1]。2021年4月，印度分離到毒株B.1.617，其特點(diǎn)是同時擁有兩個氨基酸殘基的突變(L452R和E484Q)[2]。目前通過不同手段已經(jīng)從新冠病毒中解析得到20種蛋白，包括16種非結(jié)構(gòu)蛋白和4種結(jié)構(gòu)蛋白。4種結(jié)構(gòu)蛋白為刺突蛋白(spike,S)、包膜蛋白(envelope,E)、膜蛋白(membrane,M)和核衣殼蛋白(nucleocapsid,N)[3]。新冠病毒侵染人體細(xì)胞的過程是由S蛋白與人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(hACE2)相互作用介導(dǎo)的。S蛋白包括S1和S2兩部分[圖1(b)]，S1包括N末端(N-terminal,NTD)和受體結(jié)構(gòu)域(receptor-binding domains,RBD)直接與hACE2發(fā)生作用[圖1(a)]，S2蛋白用于促進(jìn)膜融合[4]。目前大量研究都圍繞著病毒或相關(guān)蛋白進(jìn)行各種抗體或抑制劑的設(shè)計[5-6]。同時有研究和病例表明，RBD突變能夠顯著增強(qiáng)新冠病毒對宿主細(xì)胞的侵染能力，但其具體分子作用機(jī)制尚不夠明確。

新冠病毒是一種RNA病毒，與非典病毒均屬于冠狀病毒，具有易變異、傳播性強(qiáng)、毒性強(qiáng)等特點(diǎn)，二者不同的是，新冠病毒對溫度的適應(yīng)性更強(qiáng)[7]。在可預(yù)見不遠(yuǎn)的將來，新冠病毒將進(jìn)一步發(fā)生突變，其突變方向可能與流感病毒類似，趨于傳播性更強(qiáng)、毒性更弱的方向；或者與埃博拉病毒類似，趨向于傳播性更強(qiáng)、毒性也更強(qiáng)的方向都未可知。唯一可確定的是新冠病毒將持續(xù)產(chǎn)生突變，所以找到目前突變體的抑制劑，以及疫苗的研發(fā)將是相關(guān)研究領(lǐng)域的重中之重。

本研究從分子動力學(xué)和蛋白質(zhì)對接的角度，針對新冠病毒S蛋白RBD部分的突變?nèi)胧?，通過揭示RBD突變增強(qiáng)與hACE2的分子作用機(jī)制，進(jìn)而證明484號氨基酸殘基通過與hACE2形成鹽橋相互作用，同時也通過影響484附近直接與hACE2作用的氨基酸殘基，適度增強(qiáng)二者的親和力，可能導(dǎo)致新冠病毒的傳播性增強(qiáng)，而研究尚未開展新冠病毒突變體對抗體中和作用的相關(guān)工作，這部分內(nèi)容需要后續(xù)進(jìn)一步研究。不同于以往圍繞著基因到蛋白的研究形式，研究直接從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能入手，為今后的抑制劑研究提供新方法，并為相關(guān)病毒的突變研究提供新思路。

1 材料與方法

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文件的獲取。S蛋白、S蛋白RBD與hACE2復(fù)合體結(jié)構(gòu)直接從蛋白銀行(Protein Data Bank,PDB)獲取。其中S蛋白為病毒RBD晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 7BZ5)[8]，復(fù)合體構(gòu)象為RBD與hACE2復(fù)合體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 6M17)[9]。

突變體的構(gòu)建。RBD突變體手動修改蛋白質(zhì)突變位點(diǎn)，并使用Swiss Model[10]以野生型S蛋白為模板，進(jìn)行同源建模。

分子動力學(xué)(MD)模擬。使用GROMACS 2018.8版本進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，以一個裝有TIP3P水分子和平衡離子的八面體盒子為中心，應(yīng)用周期邊界條件進(jìn)行模擬。系統(tǒng)能量采用10 000步的最陡下降算法，并通過運(yùn)行時間為100 ps的NVT平衡和NPT平衡來實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)平衡后進(jìn)行MD模擬[11]。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)對接。使用HADDOCK[12]網(wǎng)絡(luò)服務(wù)版本對RBD與hACE2進(jìn)行對接。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBD與hACE2之間的結(jié)合關(guān)系

選擇分辨率為0.29 nm的復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)(PDB ID 6M17)進(jìn)行研究。hACE2是一種跨膜蛋白，其N末端為膜外肽酶結(jié)構(gòu)域(peptidase domain,PD)和C末端為Collectrin樣域(collectrin-like domain,CLD)。S蛋白RBD直接與hACE2的PD相結(jié)合，對晶體結(jié)構(gòu)[圖1(a)，圖2]進(jìn)行分析，此二者之間關(guān)系是以氫鍵為主的極性相互作用。

(a)SARS-CoV-2刺突蛋白/ACE2的復(fù)合體(紫色和橙色為刺突蛋白；深綠色和桃紅色為hACE2)。(b)紅色為S蛋白RBD。(c)～(e)RBD視圖、內(nèi)側(cè)視圖、外側(cè)視圖。圖1 RBD與hACE2的復(fù)合體結(jié)構(gòu)Figure 1 The structure of RBD and hACE2

從圖2可以看出，RBD與hACE2之間存在多個氫鍵相互作用，在分子層面上表現(xiàn)為RBD與PD二者結(jié)合能力較強(qiáng)，在蛋白質(zhì)層面上導(dǎo)致S蛋白與hACE2具有較強(qiáng)的親和力，從而可能導(dǎo)致新冠病毒的傳播性更強(qiáng)。氫鍵數(shù)量導(dǎo)致兩個蛋白之間作用緊密，與Gan等[13]研究結(jié)果相一致，也有研究者測定了RBD與hACE2復(fù)合體的能量，為3.0 kJ/mol±0.2 kJ/mol，解離常數(shù)KD=1.3 nmol/L，這些都表明RBD對hACE2的親和力較強(qiáng)[14]。其中，根據(jù)殘基間氫鍵數(shù)量可以分為3類(表1)：兩個氨基酸殘基之間存在兩條氫鍵；一個氨基酸與另外兩個氨基酸之間分別存在一條氫鍵；兩個氨基酸之間存在一條氫鍵。兩個蛋白間相互作用根據(jù)氫鍵類型可以分為3類：殘基之間存在O—H—O型氫鍵；殘基之間存在O—H—N型氫鍵，其中H34較為特殊，是Y453上的苯環(huán)酚羥基中的O通過H與H34上的咪唑環(huán)中的N形成氫鍵；其余氫鍵類型為非殘基之間存在氫鍵。其中O—H—N型氫鍵數(shù)量較O—H—O型多。這種分類方式參考了相關(guān)報道中K417、E484、N501氨基酸殘基是RBD與hACE2之間的關(guān)鍵作用中心[15]。

(a)(c)SARS-CoV-2嵌合受體結(jié)構(gòu)域與其受體hACE2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。(b)(d)直接作用的氨基酸殘基以棍棒表示的特寫平面[青色(F鏈)，刺突蛋白；紫色(B鏈)，hACE2]。圖2 hACE2與RBD結(jié)合區(qū)域氫鍵作用關(guān)系Figure 2 Diagram of hydrogen bond interaction in the binding region of hACE2 and RBD

表1 RBD與hACE2相互作用(根據(jù)氫鍵分類)

相同類型的氫鍵，可以使用氫鍵的鍵長來衡量其鍵能。O—H—O型中，鍵長最長、最短分別為0.306 6 nm和0.263 9 nm，且由于RBD上N487與hACE2的Q24和Y83之間存在兩條氫鍵，其鍵能理論上更高；O—H—N型中，鍵長最長、最短分別為0.336 3 nm和0.270 6 nm。同時，發(fā)現(xiàn)N487緊鄰?fù)蛔兒罂蛇m度增強(qiáng)RBD與hACE2親和力的484位點(diǎn)，且N487與A475之間還存在氫鍵，故提出假設(shè)，484突變能夠影響周圍其他與hACE2作用的RBD殘基。研究表明，RBD結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定，突變只會在少數(shù)關(guān)鍵氨基酸殘基上發(fā)生，如K417、L452、E484和N501。這些氨基酸突變能夠一定程度上增強(qiáng)RBD與hACE2的親和力，同時還能夠降低與中和抗體的作用能力[4]。484突變可適度增強(qiáng)新冠病毒的傳播性，之后研究將通過MD模擬手段，圍繞484號氨基酸突變對周圍氨基酸的影響進(jìn)行進(jìn)一步探討。

2.2 484突變對蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響

從氨基酸突變對整體蛋白質(zhì)親疏水、帶電性的改變上能夠一定程度上分析出突變對蛋白質(zhì)性質(zhì)有影響。圖3(a)～(c)是蛋白質(zhì)的疏水表面，能一定程度上衡量蛋白質(zhì)局部的親疏水性，疏水性突變可能會對蛋白質(zhì)內(nèi)部造成一定影響[16]。圖3(d)～(f)則是此部分蛋白質(zhì)表面隨突變產(chǎn)生的電荷性質(zhì)變化。蛋白質(zhì)局部的電荷種類，能夠一定程度上衡量局部帶電能力[17]。從電荷變化的角度分析，E是酸性氨基酸帶負(fù)電，K是堿性氨基酸帶正電，Q是酰胺氨基酸不帶電。大量病例證明，新冠病毒的突變株中，侵染性強(qiáng)弱順序為E484

(a)～(c)經(jīng)疏水處理后的表面顏色；(d)～(f)經(jīng)靜電勢處理后的表面顏色；(a)(d)S蛋白(WT和E484)；(b)(e)S蛋白K484突變(E484K)；(c)(f)S蛋白Q484突變(E484Q)。圖3 通過疏水和靜電勢對野生型WT及突變刺突蛋白進(jìn)行分析Figure 3 WT and mutation spike protein by hydrophobic and electrostatic potential

2.3 分子動力學(xué)模擬結(jié)果

為了研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的空間動態(tài)變化，選擇未突變的新冠病毒S蛋白(PDB ID: 7BZ5)進(jìn)行100 ps的MD實(shí)驗[21]。圖4(a)是經(jīng)MD優(yōu)化后的部分RBD蛋白空間結(jié)構(gòu)，標(biāo)記并使用球棍模型展示出E484、N487和Y489殘基及所在位置。圖4(b)中展示的是MD中RBD每個α-C原子的波動均方根(root mean squareuctuations,RMSF)，可以發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的RMSF值波動均很小，表明模擬準(zhǔn)確可靠，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定[22]。雖然其中331～348，360～372波動較大，但由于不是RBD與hACE2相結(jié)合的部位，所以對結(jié)果影響較??；而475～487亦有較大波動，說明這部分二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，同時在475～487有兩個極短的β折疊(473～474、488～489)，是由于其缺少束縛造成的。值得注意的是，盡管475～489氨基酸殘基波動較大，但對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性并無影響[23]。因此，這部分活躍的結(jié)構(gòu)在RBD與hACE2相結(jié)合的過程中，可能起著尤為重要的作用。圖4(c)可以看出，RBD部分野生型(黑色)的484突變成K(紅色)或Q(藍(lán)色)，在E484K突變體中增強(qiáng)其活躍性，而在E484Q突變體中則相反。突變后不論是降低還是增強(qiáng)這個位點(diǎn)的活躍性，均處于一個較小(±0.05 nm)的波動范圍內(nèi)。MD結(jié)果表明，484突變對N487的影響是極為明顯的，E484K、E484Q突變均能顯著降低N487的活躍性。N487是RBD與hACE2相互作用的一個重要氨基酸殘基，484突變顯著降低其活躍性，一定程度上能夠增強(qiáng)兩個蛋白相互作用的穩(wěn)定性。同時，A475也是一個RBD與hACE2相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，在野生型E484上，A475有較強(qiáng)的活躍性，當(dāng)產(chǎn)生E484K、E484Q突變體時，A475的活躍性明顯降低，其中E484K突變對A475活躍性的影響程度幾乎沒有(<0.1 nm)，而E484Q突變對A475的活躍性影響十分顯著(>0.04 nm)。

(a)RBD上E484、N487、Y489的球棍圖；(b)(c)MD模擬中RBD和475～489的RMSF值。圖4 RBD的MD模擬Figure 4 MD simulation of RBD

通過MD模擬發(fā)現(xiàn)484發(fā)生K、Q突變，均對RBD上A475與hACE2相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基有降低活躍程度的影響。其中E484Q突變比E484K突變對A475和N487活躍性的影響更加明顯，說明在原子層面上，E484K、E484Q突變影響了N487和A475這兩個與hACE2作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，并降低了兩者的活躍程度，從而增強(qiáng)了Y489和A475與hACE2的結(jié)合能力。

MD分析結(jié)果證明475～489包含關(guān)鍵氨基酸，與文獻(xiàn)報道一致，有類似研究表明，K417、L455、A475、G476、E484、Q498和V503均為關(guān)鍵氨基酸。同時證明，484突變有助于增強(qiáng)RBD與受體的結(jié)合能力[24]。此外，K417、E484和N501是一種逃逸突變，能夠在改變RBD與受體結(jié)合的同時增強(qiáng)其侵染性[25]。更好的抗體設(shè)計方向應(yīng)該是與hACE2競爭同RBD的結(jié)合，并與關(guān)鍵突變殘基K417、E484和N501接觸有限。更多關(guān)鍵氨基酸的發(fā)現(xiàn)，都有助于為治療新冠病毒的藥物設(shè)計提供重要的理論參考。

2.4 蛋白質(zhì)對接結(jié)果

為進(jìn)一步證明S蛋白RBD的E484突變可適當(dāng)增強(qiáng)RBD與hACE2的親和力，導(dǎo)致其傳播性增強(qiáng)的潛在分子作用機(jī)制，使用蛋白質(zhì)對接的手段，從兩個蛋白質(zhì)相互作用的角度加以論證。

從表2中可以看出，在蛋白質(zhì)對接結(jié)果中，K484和Q484均比E484的打分更低，說明兩者結(jié)合能更高，RBD與hACE2之間連接更緊密，且Q484>K484，說明Q484突變體的RBD與hACE2之間的結(jié)合能力較K484突變體更強(qiáng)，這與新冠病毒傳染能力Q484>K484>E484結(jié)果一致。對接模擬結(jié)果中靜電力為主要作用力，范德華力、去溶劑能為次要作用力。這與PDB數(shù)據(jù)庫中大量冷凍電鏡觀測到的結(jié)果相一致，說明模擬結(jié)果一定程度上具有可靠性，能夠進(jìn)一步證明之前提出的假設(shè)。

表2 蛋白質(zhì)對接得分

對接結(jié)果表明，將RBD與hACE2之間的氫鍵分為3類，在K484和Q484中，氫鍵集2與氫鍵集3之間差別不大，且與野生型E484相似。相比冷凍電鏡結(jié)果，分子模擬的結(jié)果在氫鍵長度上具有一定誤差，但是在相對長度上較為一致，也能一定程度反映出氨基酸突變對RBD與hACE2之間相互作用關(guān)系。

484發(fā)生突變時，N487-Q24和N487-Y83之間的氫鍵也有一定的改變，且E484K和E484Q突變相比野生型都能縮短N(yùn)487-Q24和N487-Y83之間的氫鍵距離(表3)。在蛋白質(zhì)對接過程中，3種RBD均只有484號位點(diǎn)發(fā)生變化，且研究證明484號氨基酸殘基通過鹽橋與hACE2相互作用。因此可以進(jìn)一步證明，在蛋白質(zhì)的活性中心484號位點(diǎn)可作用并影響487號位點(diǎn)，從而影響RBD與hACE2的結(jié)合力，表現(xiàn)為E484K和E484Q均能一定程度上增強(qiáng)新冠病毒的侵染能力。

(a)SARS-CoV-2嵌合結(jié)構(gòu)域與hACE2(6VW1)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)；(b)WT模型；(c)K484模型；(d)Q484模型。與直接作用的氨基酸殘基以棍棒表示，所有結(jié)構(gòu)都在相同的方向上。圖5 ACE2與黏附蛋白RBD相互作用表面Figure 5 ACE2 and stick protein RBD interaction surface

表3 RBD與hACE2間氫鍵(WT,E484K,E484Q)

分子對接結(jié)果為找出關(guān)鍵氨基酸殘基并設(shè)計和開發(fā)疫苗或抗體提供研究思路，其中K417、L452、L455、F456、E484、G485、F486、F490和Q493均可作為關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行研究[26]。相關(guān)研究設(shè)計了25種S蛋白，對研究結(jié)論進(jìn)行補(bǔ)充，E484K突變對病毒傳播的影響表現(xiàn)在能夠抵抗抗體的中和作用[27]。盡管從MD模擬及蛋白質(zhì)對接的角度均能一定程度上表明，484號位點(diǎn)的兩種突變型影響RBD與hACE2直接作用關(guān)系，但是進(jìn)一步結(jié)果仍需要試驗證明。

3 討論與結(jié)論

研究通過分子模擬的手段對RBD的484號位點(diǎn)進(jìn)行研究，解釋了484突變能適度增強(qiáng)新冠病毒傳播性且直接作用于hACE2的動力學(xué)特征，從模擬的角度揭示新冠病毒484突變增強(qiáng)其侵染性的潛在分子作用機(jī)制。

新冠病毒S蛋白上RBD部位是一個重要的靶點(diǎn)。圍繞其設(shè)計抑制劑是目前較為主流的研究思路。但是在圍繞靶點(diǎn)設(shè)計抑制劑的過程中，往往都把思路集中于研究活性中心，而忽略掉一些不在活性中心，但是能夠影響活性中心的氨基酸殘基。以往針對新冠病毒抑制劑的相關(guān)研究中，忽略了475～489這幾個氨基酸殘基，在突變體中這幾個氨基酸殘基的變化，對病毒的侵染性有明顯增強(qiáng)作用，所以在未來抑制劑的設(shè)計中，這是一個值得考慮的區(qū)域。

E484K對新冠病毒侵染性的增強(qiáng)能力有限，約為野生型的1.4倍，N501Y突變對新冠病毒侵染性增強(qiáng)能力可達(dá)7倍以上，可圍繞N501Y突變進(jìn)一步研究[28]。結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)果表明，K417N、E484K突變能夠消除抗體的中和能力[29]，K417、E484和N501是一種逃逸突變，通過改變與抗體的結(jié)合能力的同時，還能夠增加侵染性[25]，后續(xù)工作應(yīng)盡可能圍繞K417、N501以及多突變蛋白進(jìn)行展開。