粗糙脈孢菌絲切蛋白的純化及微絲解聚活性分析

黃 璐， 陳菁秋， 孫海濤， 李艷紅， 陳志玲

(首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 北京 100048)

微絲骨架作為細(xì)胞骨架的重要成員，最顯著的特征是其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，通過眾多肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的調(diào)控，完成微絲的解聚、聚合、重排、成束等，進(jìn)而調(diào)控生物體內(nèi)許多極為重要的生命活動(dòng)，如細(xì)胞極性的建立和維持、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移、信號(hào)傳導(dǎo)等[1]。

絲切蛋白(cofilin)/肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)普遍存在于真核生物中，是一類含量豐富、分子質(zhì)量較小的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，它既能夠與單體肌動(dòng)蛋白(G-actin)結(jié)合，使G-actin從微絲(F-actin)上解離下來，也能夠切割F-actin，加速F-actin的踏車行為，進(jìn)而在actin動(dòng)態(tài)周轉(zhuǎn)中發(fā)揮重要作用。從20世紀(jì)80年代首次利用DEAE纖維素層析柱從雞胚的腦組織中分離純化得到cofilin后，至今陸陸續(xù)續(xù)從其他物種中分離得到160余種編碼cofilin/ADF家族成員的基因。cofilin/ADF家族包括：cofilin、脊椎動(dòng)物ADF或destrin、植物ADF、depactin和actophorin。目前已知所有真核生物中至少含有1種cofilin/ADF異型體，如釀酒酵母、線蟲、苔蘚的基因組中均含有1個(gè)編碼cofilin/ADF的基因，擬南芥基因組中含有11個(gè)編碼ADF的基因[2-3]。有研究報(bào)道，利用siRNA技術(shù)下調(diào)腎COS-7成纖維細(xì)胞系中內(nèi)源cofilin的表達(dá)水平后，抑制了細(xì)胞凋亡；腺苷酸環(huán)化酶1在小鼠卵母細(xì)胞成熟過程中通過調(diào)節(jié)actin的組裝發(fā)揮作用，下調(diào)其表達(dá)水平紡錘體的遷移明顯減慢，胞質(zhì)分裂異常，而同時(shí)上調(diào)cofilin表達(dá)水平后，可部分挽救腺苷酸環(huán)化酶1下調(diào)引起的表型缺陷[4-5]。突變導(dǎo)致的cofilin功能失活對(duì)線蟲、果蠅和釀酒酵母來說是致死的[6]，由此可見，cofilin對(duì)真核生物的生命活動(dòng)是至關(guān)重要的。

通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)等手段對(duì)cofilin家族成員與actin的相互結(jié)合研究發(fā)現(xiàn)，位于cofilin N端的幾個(gè)氨基酸殘基和α-3螺旋對(duì)其與actin的結(jié)合和F-actin解聚的活性是必須的，cofilin N端序列相似性不高，但是其中的絲氨酸殘基高度保守。當(dāng)將絲氨酸突變后，其F-actin解聚能力受到影響[6-7]。

粗糙脈孢菌是低等真核生物，其菌絲形態(tài)發(fā)生表現(xiàn)為典型的極性生長(zhǎng)模式，在快速生長(zhǎng)的菌絲細(xì)胞中，微絲骨架發(fā)揮著重要的作用。Virag等[8]通過對(duì)粗糙脈孢菌進(jìn)行紫外線照射，并結(jié)合細(xì)胞松弛素A篩選獲得了第一個(gè)actin突變株actin1，此突變株在F-actin的分布、菌絲的分枝模式和形態(tài)等方面均表現(xiàn)出與野生型明顯的差異。利用GFP-lifeact報(bào)告基因觀察到粗糙脈孢菌菌絲細(xì)胞內(nèi)存在肌動(dòng)蛋白環(huán)(actin rings)、微絲(F-actin)和肌動(dòng)蛋白斑點(diǎn)(actin patches)，并且F-actin介導(dǎo)菌絲細(xì)胞頂端區(qū)域物質(zhì)的運(yùn)輸[9]。作為肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族中重要成員的粗糙脈孢菌cofilin(NcCof)，可能通過調(diào)節(jié)actin的動(dòng)態(tài)組裝過程來控制菌絲的形態(tài)發(fā)生。通過對(duì)NcCof進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用大腸桿菌原核系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，純化獲得NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D) 蛋白，并對(duì)其F-actin解聚活性進(jìn)行分析，為后續(xù)闡明NcCof調(diào)控actin動(dòng)態(tài)特性的分子機(jī)制以及NcCof在菌絲生長(zhǎng)發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

蛋白表達(dá)載體pGEX-KG-NcCof、pGEX-KG-NcCof (S4A)、pGEX-KG-NcCof (S4D)、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株BL21(DE3)由本課題組保存；Glutathione-Sepharose beads和Thormbin購(gòu)自Sigma公司， IPTG購(gòu)自Merck公司； 其他試劑均購(gòu)自北京江晨文軒生物科技有限責(zé)任公司。

溶液配方：PBS pH 7.4、10×ME pH 8.0、10×KMEI pH 8.0、G-buffer pH 8.0參考Jiang等[10]方法。

1.2 方法

1.2.1 NcCof蛋白理化特性、序列保守性及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件ProtParam (http:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)NcCof蛋白的氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。從Uniprot(https:∥www.uniprot.org/)網(wǎng)站檢索和下載酵母(Saccharomycescerevisiae)、小鼠(Musmusculus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、人(Homosapiens) 的cofilin序列，利用Clustal X軟件和ESPript進(jìn)行不同物種cofilin氨基酸序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用SWISSMODEI (http:∥swissmo del.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pGEX-KG-NcCof、pGEX-KG-NcCof(S4A)、pGEX-KG-NcCof (S4D)質(zhì)粒分別通過熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。第二天按1∶100接種擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600=0.6～0.8時(shí)，加入0.4 mmol/L IPTG 16 ℃誘導(dǎo)16 h。

1.2.3 NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白的純化

誘導(dǎo)完成后，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集菌體，然后用25 mL PBS重懸菌體，超聲破碎儀破碎細(xì)胞，細(xì)胞懸濁液4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集上清液。將上清液與用PBS處理后的Glutathione-Sepharose beads 4 ℃結(jié)合1 h，之后轉(zhuǎn)移至親和層析柱，控制流速0.6 mL/min。50 mL PBS沖洗層析柱，洗去未結(jié)合的非特異性雜蛋白，在層析柱中保留2 mL PBS 溶液。

向?qū)游鲋屑尤?0 U的Thormbin，封住層析柱兩端，4 ℃搖床消化過夜。次日收集流出液，即為切掉GST標(biāo)簽的目的蛋白溶液。將目的蛋白溶液于4 ℃ 1 mmol/L Tris-HCl pH 7.5緩沖液中透析，超濾管濃縮。留取樣品10 μL待15% SDS-PAGE檢測(cè)。其余蛋白分裝至Ep管，液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱。

5種不同來源的cofilin/ADF序列比對(duì)(Uniprot ID分別為NcCof: V5IPJ8；ScCof: Q03048；Mm:P18760；AtADF1: Q39250；HuCof: P23528 )。#為預(yù)測(cè)活性位點(diǎn)。 圖1 不同來源Cofilin的氨基酸序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Figure 1 Structural sequence alignments of NcCof and representative examples of cofilins

1.2.4 兔肌動(dòng)蛋白的提取與純化

首先制備兔骨骼肌丙酮粉，然后利用離心、鹽析、分子篩和透析等方法進(jìn)行肌動(dòng)蛋白純化[10]。

1.2.5 高速共沉淀實(shí)驗(yàn)分析NcCof蛋白的微絲解聚活性

參考Jiang等[10]方法進(jìn)行高速共沉淀。所有蛋白及所用溶液4 ℃、75 000 r/min，離心35 min，取上清液，Bradford測(cè)定蛋白濃度。室溫條件下聚合10 μmol/L的F-actin，然后將F-actin 30 μL與NcCof蛋白加入Ep管中，再加入10×KMEI 10 μL，用G-buffer補(bǔ)足至總體積為100 μL。反應(yīng)體系中的蛋白以只加入F-actin或只加入NcCof蛋白為對(duì)照。F-actin和NcCof工作濃度分別為3、20 μmol/L。30 ℃孵育0.5 h。4 ℃，75 000 r/min，離心30 min。分別吸取上清液和沉淀進(jìn)行15% SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.6 高速共沉淀實(shí)驗(yàn)分析NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白的微絲解聚活性

參考1.2.5節(jié)方法，只是反應(yīng)體系中NcCof、NcCof (S4A)和NcCof (S4D)蛋白分別設(shè)置一系列濃度梯度：0、5、10、15 μmol/L。SDS-PAGE檢測(cè)后，Image J軟件分析蛋白條帶豐度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，利用軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NcCof的理化特性、序列保守性及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

對(duì)NcCof蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析表明，其理論等電點(diǎn)為5.36，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為17.180 7 ku，富含絲氨酸(S)、丙氨酸(A)、谷氨酸(E)和賴氨酸(K)，154個(gè)氨基酸中含酸性氨基酸(D+E)24個(gè)，堿性氨基酸(R+K)21個(gè)。對(duì)cofilin氨基酸序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同來源的cofilin氨基酸序列一致性并不高，NcCof與ScCof氨基酸一致性為39%，與AtCof氨基酸一致性為34%，N末端絲氨酸殘基(NcCof S4)高度保守。它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件非常相似，均由6個(gè)β-折疊和5個(gè)α-螺旋組成(圖1)。 對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)結(jié)果表明，組成NcCof的6個(gè)β-折疊中，β-2、β-3、β-4和β-5折疊片處于反平行狀態(tài)，β-1和β-3為平行β折疊片，β-5和β-6為平行β折疊片，5個(gè)α-螺旋圍繞在β折疊片周圍(圖2)，這些特征屬于典型的cofilin/ADF折疊模式。

圖2 NcCof的三級(jí)結(jié)構(gòu)Figure 2 Ribbon diagram of the NcCof structure

2.2 NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白的純化

為了分析NcCof是否具有解聚F-actin的活性，在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析純化，Thormbin切掉GST標(biāo)簽后獲得NcCof、NcCof(S4A)和NcCof (S4D)蛋白，SDS-PAGE結(jié)果表明，在17 ku處有清晰的目的條帶，與預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量大小一致(圖3)。

M：Marker；1：NcCof； 2：NcCof (S4A)；3：NcCof (S4D)。圖3 NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果Figure 3 SDS-PAGE analysis of purified NcCof and mutantproteins (S4A,S4D)

2.3 高速共沉淀分析NcCof蛋白的F-actin解聚活性

高速共沉淀技術(shù)是研究肌動(dòng)蛋白及其結(jié)合蛋白相互作用的一種常用經(jīng)典手段，在高速離心力作用下，F(xiàn)-actin分子質(zhì)量大，以沉淀形式存在，而G-actin分子質(zhì)量小，存在于上清液中，通過比較沉淀和上清液中肌動(dòng)蛋白的比例檢測(cè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白在actin聚合/解聚中的功能。

在只加F-actin的對(duì)照中，G-actin幾乎只出現(xiàn)在沉淀中，只加NcCof的對(duì)照中，NcCof只出現(xiàn)在上清液中，而在加入F-actin和NcCof的實(shí)驗(yàn)組中，沉淀和上清液中均有兩種蛋白存在(圖4)，表明NcCof既能夠與F-actin結(jié)合，也能夠與G-actin結(jié)合，并且具有解聚F-actin的活性。

1、2：對(duì)照組(只加actin，1為上清液；2為沉淀)。3、4：實(shí)驗(yàn)組，加actin和NcCof(3為上清液；4為沉淀)。5、6：對(duì)照組，只加NcCof(5為上清液；6為沉淀)。圖4 NcCof與F-actin的高速共沉淀結(jié)果Figure 4 F-actin depolymerizing activity of NcCof detected by high-speed co-sedimentation

2.4 NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白的F-actin解聚活性分析

為進(jìn)一步分析NcCof對(duì)微絲解聚活性的影響是否與濃度有關(guān)，同時(shí)也為了研究NcCof N端絲氨酸(S4)對(duì)其活性影響，通過高速共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D) 3種蛋白的微絲解聚活性進(jìn)行分析，在F-actin量完全相同的情況下，分別加入不同濃度的NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖5(a)所示，上清液中G-actin的含量隨著體系內(nèi)NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白濃度的增加而增加，沉淀中G-actin的含量則相應(yīng)減少，進(jìn)一步用Image J定量分析，發(fā)現(xiàn)NcCof(S4A)與NcCof解聚F-actin的活性差別不明顯，而NcCof (S4D)解聚F-actin的活性隨著濃度的升高(10 μmol/L和15 μmol/L)明顯弱于NcCof[圖5(b)]。數(shù)據(jù)表明，NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)這3種蛋白均具有使F-actin解聚的活性，而且具有濃度梯度效應(yīng)。

(a)高速共沉淀檢測(cè)不同濃度NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)的F-actin解聚活性，上清液(S，supertnatant)和沉淀(P,pellet)中G-actin的SDS-PAGE；(b)定量分析不同濃度NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)的F-actin解聚活性。實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，圖中給出的是平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，經(jīng)t檢驗(yàn)，* 為P<0.05，** 為P<0.01。圖5 高速共沉淀分析NcCof及突變蛋白的F-actin解聚活性Figure 5 Comparison of F-actin depolymerizing activity of NcCof and mutant proteins by high-speed co-sedimentation assay

3 討論與結(jié)論

肌動(dòng)蛋白解聚因子的同源結(jié)構(gòu)域(actin-depolymerizing factor homology domains,ADF-H)廣泛存在于真核生物細(xì)胞中，目前發(fā)現(xiàn)ADF/cofilin、GMF(glia maturation factor)、coactosin 、Anp1/drebrin和twifilin這5個(gè)家族的蛋白中包含此結(jié)構(gòu)域[11-12]。Goroncy等[12]對(duì)小鼠的GMF β、GMF γ、coactosin、twifilin和人的HIP-55(類drebrin蛋白) 的ADF-H結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上氨基酸的序列相似性僅有約20%，但是高級(jí)結(jié)構(gòu)卻非常相似。中間有5個(gè)β-折疊，其中的4個(gè)反平行，第5個(gè)與第4個(gè)平行排列，并被至少4個(gè)α-螺旋圍繞。研究對(duì)粗糙脈孢菌NcCof的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，它含有6個(gè)β-折疊和5個(gè)α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，5個(gè)α-螺旋圍繞在β-折疊片層周圍，具有已報(bào)道的ADF-H結(jié)構(gòu)域的典型特征。不同物種Cofilin/ADF的功能位點(diǎn)比較保守，對(duì)cofilin/ADF家族成員的序列分析發(fā)現(xiàn)，它們?cè)贜末端存在一未形成有序結(jié)構(gòu)的區(qū)段，并且N末端5個(gè)氨基酸殘基組成的短肽片段對(duì)和G-actin的結(jié)合非常重要，在這一短肽片段中，其中高度保守的絲氨酸殘基(動(dòng)物中為S3，植物中為S6，酵母中為S4)對(duì)cofilin/ADF發(fā)揮活性尤為關(guān)鍵[13-15]。定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)及活性氨基酸位點(diǎn)功能的有力手段，對(duì)重組表達(dá)的雞cofilin進(jìn)行體外活性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)cofilin(S3A)保持切割微絲能力，而cofilin(S3D)則幾乎失去了與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的能力和切割活性，并且S3可被磷酸化[14]。Huehn[7]和Elam等[16]分別利用冷凍電鏡等技術(shù)對(duì)人cofilin S3D與actin復(fù)合體的研究表明，cofilin S3D的結(jié)合使肌動(dòng)蛋白發(fā)生了空間上輕微的傾斜，并且cofilin S3D 的N末端與肌動(dòng)蛋白脫離，推測(cè)是cofilin S3D的微絲解聚活性改變的原因。煙草NtADF S6突變?yōu)镈后，在花粉管細(xì)胞中，可看到GFP-NtADF與F-actin共分布，而NtADF(S6D)則不能，并且體外生化實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)NtADF(S6D)與F-actin的結(jié)合能力明顯下降[15]，Lappalainen 等[6]的研究則表明，與哺乳動(dòng)物和植物不同，酵母cofilin S4不發(fā)生磷酸化，但是S4是cofilin和actin結(jié)合和發(fā)揮解聚活性的重要位點(diǎn)。NcCof的第4位氨基酸(S4)高度保守，對(duì)NcCof(S4)點(diǎn)突變后，通過親和層析純化得到NcCof、NcCof(S4A)和NcCof(S4D)蛋白，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，三者均具有解聚F-actin的活性，只是NcCof(S4D) 解聚活性明顯減弱，但并未喪失解聚能力，表明NcCof具有傳統(tǒng)的cofilin/ADF解聚F-actin活性，而且其中S4可能是NcCof發(fā)揮活性的重要位點(diǎn)，并且存在其獨(dú)特的調(diào)節(jié)機(jī)制。動(dòng)物細(xì)胞中，LIM激酶和TES激酶可磷酸化cofilin，植物細(xì)胞中，鈣調(diào)蛋白激酶CDPK調(diào)控ADF的磷酸化[4,17]，粗糙脈孢菌中是否存在與動(dòng)物或植物相似的機(jī)制目前還不清楚，后續(xù)可通過定點(diǎn)突變對(duì)NcCof的其他保守位點(diǎn)以及磷酸化調(diào)控進(jìn)行研究，還可通過環(huán)境pH、PIP2以及氧化脅迫對(duì)NcCof的調(diào)控研究，從而進(jìn)一步探討NcCof調(diào)控actin動(dòng)態(tài)特性的分子機(jī)制,為闡明粗糙脈孢菌的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供依據(jù)。

致謝：感謝清華大學(xué)黃善金教授在實(shí)驗(yàn)過程中給予指導(dǎo)。