仙茅苷對抗PTSD誘導(dǎo)的小鼠海馬炎癥反應(yīng)機(jī)制

姬曼曼， 張崢嶸， 朱國旗

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室， 合肥 230012)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Post-traumatic stress disorder,PTSD)，是指個體遭遇重大創(chuàng)傷性事件后導(dǎo)致個體延遲出現(xiàn)和(或)持久存在的一種精神障礙，PTSD患者由恐懼引發(fā)心理應(yīng)激，以恐懼消退異常為典型特征[1]，并伴有抑郁、焦慮等特征。世界上超過70%的成年人在他們一生中的某個時候經(jīng)歷過創(chuàng)傷事件，大約6%的創(chuàng)傷暴露個體會發(fā)展成PTSD[2]。目前，臨床上尚無有效的治療措施控制PTSD的發(fā)展進(jìn)程，多采用以藥物治療為主，同時輔以心理治療，但是只有少數(shù)的抗焦慮和抗抑郁藥物被批準(zhǔn)用于PTSD的治療[3]。

適度的神經(jīng)炎癥有助于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷修復(fù)，過度強(qiáng)烈或持續(xù)的神經(jīng)炎癥會破壞神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能障礙[4]，并參與阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)[5]、PTSD[6]、抑郁[7-8]等疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，PTSD患者的促炎細(xì)胞因子水平(IL-1β、TNF-α、IFN-γ以及炎癥刺激的CRP)明顯高于健康個體[9]，且這些促炎標(biāo)志物的嚴(yán)重程度和發(fā)生PTSD的可能性呈正相關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)在神經(jīng)炎癥、免疫應(yīng)答等過程中起關(guān)鍵性作用[10]，也參與突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶[8]。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)在細(xì)胞凋亡和炎癥中發(fā)揮重要作用[11]。NLRP3活化可激活Caspase-1，促使IL-6、TNF-α釋放入血，透過受損的血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，誘導(dǎo)腦內(nèi)細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)精神疾病的產(chǎn)生[8]。有研究表明，NF-κB可通過調(diào)控NLRP3的表達(dá)來激活NLRP3炎癥小體[12]。因此，NF-κB調(diào)控NLRP3炎癥小體可能是預(yù)防或治療PTSD的重要靶點(diǎn)。

仙茅苷(Curculigoside,CUR)是仙茅的主要成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明仙茅苷具有抗炎[13]、抗氧化[14]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[15]，保護(hù)中樞神經(jīng)細(xì)胞[16]，改善學(xué)習(xí)記憶能力[13]等功效。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷可增加BDNF/TrkB表達(dá)促進(jìn)恐懼消退[17]，并改善電刺激應(yīng)激小鼠抑郁的癥狀及抑制記憶退化的作用[18]。但關(guān)于仙茅苷對小鼠PTSD樣行為的影響及其作用的機(jī)制尚不清楚。因此，本實驗建立改良的單次延長應(yīng)激和電擊(Single prolonged stress and electrical stimulation,SPS&S)小鼠模型，探討仙茅苷對小鼠PTSD樣行為的作用，以及對海馬炎癥方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

30只成年雄性C57BL/6小鼠(日齡5周；體重：20～25 g)，飼養(yǎng)于溫度為22 ℃±2 ℃，相對濕度為45%～65%的房間中，經(jīng)12 h的明/暗循環(huán)，可隨意飲水和攝食。實驗動物購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號：SCXK9(皖)2016-0009]，實驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)(中國合肥)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥材與試劑

仙茅苷(HPLC≥98.0%)購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；NF-κB、NLRP3、Caspase-1和β-Actin抗體購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TNF-α和IL-1β ELISA檢測試劑盒購自江萊生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SPS&S小鼠模型建立與分組

C57小鼠適應(yīng)一周后建立SPS&S模型，實驗流程如下：束縛2 h、強(qiáng)迫游泳20 min、休息15 min后,用異氟烷麻醉至意識模糊、重復(fù)兩次，清醒后進(jìn)行足部電擊(2 mA，2 s)。刺激結(jié)束后將小鼠放回籠中。實驗隨機(jī)分為5組(n=6)：正常對照組、SPS&S模型組、CUR(5、10、20 mg/kg)組。CUR組在造模24 h后開始進(jìn)行腹腔注射給藥(5、10、20 mg/kg，每天1次)，正常對照組和SPS&S模型組腹腔注射等量的生理鹽水，連續(xù)給藥14 d。在最后一天給藥后對小鼠進(jìn)行條件恐懼、曠場和高架十字迷宮實驗(圖1)。

圖1 實驗流程Figure 1 Experimental protocol

1.2.2 條件恐懼實驗

第14天給藥結(jié)束1 h后，進(jìn)行恐懼消退實驗，條件恐懼實驗分為適應(yīng)期、訓(xùn)練期、再暴露期和消退期4個階段。給藥后開始實驗：(1)第1天為適應(yīng)期。每只小鼠在恐懼箱里適應(yīng)5 min。(2)第2天是訓(xùn)練期。將小鼠置于恐懼箱中5 min，給予3次足底電擊(1.0 mA，持續(xù)2 s，每次電擊間隔73～74 s)。(3)第3天為再暴露。將小鼠重新放置在恐懼箱中，暴露15 min，不給予足底電擊。記錄每只小鼠在15 min內(nèi)的凝滯時間，并統(tǒng)計最初5 min的凝滯時間。(4)第4天為恐懼記憶消退。小鼠放入恐懼箱中5 min，沒有足底電擊，記錄5 min內(nèi)的凝滯時間。每只小鼠測試完后，用75%乙醇擦洗恐懼箱以去除背景氣味。

1.2.3 曠場實驗(Open field test,OFT)

將小鼠放入曠場實驗專用敞箱的中心方格內(nèi)，觀察實驗小鼠5 min內(nèi)的自發(fā)活動。使用自動分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技)比較各組之間的中央?yún)^(qū)域停留時間、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動路程與運(yùn)動總路程。完成每只小鼠實驗后均用酒精棉球擦拭敞箱，以除去小鼠余留的信息，避免影響下次測試結(jié)果。

1.2.4 高架十字迷宮實驗(Elevated plus maze test,EPMT)

將小鼠從高架十字的中央格面向開放臂放入其中，通過軟件記錄5 min內(nèi)進(jìn)入開臂、閉臂的次數(shù)和滯留時間，并計算相應(yīng)的百分比，同時觀察小鼠的焦慮樣狀態(tài)。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)

行為學(xué)結(jié)束后，將各組小鼠斷頭取血，離心獲取血清。按照ELISA試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中的IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。

1.2.6 心臟灌流和HE染色

小鼠經(jīng)麻醉后開胸暴露心臟，在左心室的位置插管，快速灌注PBS至流出液變清亮后換4%多聚甲醛繼續(xù)灌注。完畢后，取出腦組織用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定過夜，用30%蔗糖溶液脫水48 h。冷凍切片(厚度：20 μm)，進(jìn)行常規(guī)HE染色。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)

選用異氟烷吸入麻醉，誘導(dǎo)含量為3%，麻醉完全后迅速斷頭取腦，在冰盤上迅速分離出兩側(cè)海馬組織，加適量的RIPA研磨提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western Blot常規(guī)操作，用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品并將其轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后將膜放入含有對應(yīng)抗體的稀釋液(1∶1 000)中，分別是NF-κB、NLRP3、Caspase-1和β-actin，4 ℃孵育過夜。洗滌后加入1∶10 000稀釋的二抗孵育2 h，洗滌。ECL顯色，曝光。使用Image J軟件分析目標(biāo)條帶及內(nèi)參條帶的光密度值。總蛋白的相對含量用其與內(nèi)參蛋白的比值表示。

1.2.8 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 仙茅苷促進(jìn)PTSD小鼠恐懼消退

條件性恐懼記憶實驗結(jié)果表明，足底電擊可誘導(dǎo)小鼠形成條件性恐懼記憶。選用再暴露前5 min表示小鼠的恐懼記憶，結(jié)果顯示，各組之間小鼠的凝滯時間沒有顯著差異[圖2(a)，F(xiàn)(4,25)=0.562 7，P>0.05]，表明CUR給藥后不會影響小鼠恐懼記憶的形成。但是在恐懼消退24 h后(實驗流程中D25)，CUR(10和20 mg/kg)組小鼠的凝滯時間顯著低于模型組[圖2(b)，F(xiàn)(4,25)=13.80，P<0.05]。結(jié)果表明，CUR給藥促進(jìn)了小鼠的恐懼記憶的消退。

(a)再暴露前5 min的凝滯時間；(b)消退24 h后的凝滯時間。#為P<0.05,vs.正常組；* 為P<0.05,vs.SPS&S組。圖2 仙茅苷促進(jìn)SPS&S小鼠的恐懼消退Figure 2 CUR facilitates fear memory extinction in SPS&S mice

2.2 仙茅苷改善PTSD小鼠焦慮樣行為

通過曠場實驗及高架十字迷宮實驗測定動物的焦慮樣行為。曠場實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，SPS&S小鼠在中心區(qū)域停留時間[圖3(a)，F(xiàn)(4,25)=21.40，P<0.05]和中心區(qū)域內(nèi)運(yùn)動距離[圖3(b)，F(xiàn)(4,25)=9.063，P<0.05]顯著減少。與SPS&S模型組小鼠相比，給予CUR的PTSD小鼠在中心區(qū)域停留時間和中心區(qū)域內(nèi)運(yùn)動距離顯著增加(P<0.05)。CUR給藥后不影響小鼠曠場實驗中的總路程[圖3(c)，F(xiàn)(4,25)=9.063，P>0.05]，表明CUR的抗焦慮作用與小鼠的自發(fā)活動無關(guān)。

高架十字迷宮實驗中，與正常對照組相比，SPS&S模型小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比減少(P<0.05)，與SPS&S組相比，給予CUR(10、20 mg/kg)的PTSD小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比顯著增加[圖3(d)，F(xiàn)(4,25)=6.592，P<0.05]。

(a)曠場實驗中心區(qū)域停留時間；(b)曠場實驗中心區(qū)域內(nèi)運(yùn)動距離；(c)曠場實驗運(yùn)動總路程；(d)進(jìn)入高架十字迷宮開放臂次數(shù)百分比。#為P<0.05,vs.正常組；* 為P<0.05,vs.SPS&S組。圖3 仙茅苷改善SPS&S模型小鼠焦慮樣行為Figure 3 CUR improves anxiety-like behaviors in SPS&S mice

2.3 仙茅苷改善PTSD小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理變化

海馬CA1區(qū)HE染色顯示正常對照組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞膜完整，結(jié)構(gòu)正常，變性細(xì)胞數(shù)量較少；而PTSD模型小鼠與正常對照組相比，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，胞質(zhì)溶解，排列紊亂，細(xì)胞之間距離顯著增寬；CUR(20 mg/kg)給藥后小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性細(xì)胞數(shù)量減少，排列較為整齊。見圖4。

(a)海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞HE染色圖；(b)海馬組織CA1區(qū)變性細(xì)胞統(tǒng)計圖(50 μm2)。#為P<0.05,vs.正常組；* 為P<0.05,vs. SPS&S組。圖4 仙茅苷改善PTSD小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病理變化Figure 4 CUR ameliorates the pathological changes in the CA1 regions of the hippocampus of PTSD mice

2.4 仙茅苷下調(diào)PTSD小鼠血清中TNF-α及IL-1β水平

與正常對照組相比，SPS&S模型組小鼠血清TNF-α[圖5(a)，F(xiàn)(4,20)=13.38，P<0.05]及IL-1β[圖5(b)，F(xiàn)(4,20)=12.81，P<0.05]水平明顯升高；與SPS&S模型組相比，CUR(10、20 mg/kg)血清中TNF-α及IL-1β水平顯著降低(P<0.05)。

(a)TNF-α的水平；(b)IL-1β的水平；#為P<0.05,vs.正常組；* 為P<0.05,vs.SPS&S組。圖5 仙茅苷下調(diào)PTSD小鼠血清中TNF-α及IL-1β水平Figure 5 CUR reduces the levels of serum TNF-α and IL-1β in PTSD mice

2.5 仙茅苷抑制PTSD小鼠海馬組織中NF-κB、NLRP3和Caspase-1表達(dá)

與對照組相比，SPS&S模型小鼠海馬區(qū)NF-κB、NLRP3及Caspase-1蛋白的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與SPS&S模型組相比，CUR(10、20 mg/kg)給藥后明顯降低海馬組織中NF-κB[圖6(b)，F(xiàn)(4,15)=4.411]、NLRP3[圖6(c)，F(xiàn)(4,15)=20.64]及蛋白Caspase-1[圖6(d)，F(xiàn)(4,15)=5.386]的表達(dá)(P<0.05)。

(a)代表性蛋白印跡條帶；(b)NF-κB表達(dá)結(jié)果；(c)NLRP3表達(dá)結(jié)果；(d)Caspase-1表達(dá)結(jié)果。#為P<0.05,vs.正常組，* 為P<0.05,vs.SPS&S組。圖6 仙茅苷抑制PTSD小鼠海馬組織中NF-κB、NLRP3和Caspase-1表達(dá)Figure 6 CUR inhibits the expression of NF-κB,NLRP3 andCaspase-1 in the hippocampus of PTSD mice

3 討論與結(jié)論

本研究采用改良的SPS模型來模擬PTSD樣癥狀，在再暴露前5 min，CUR給藥對小鼠的不動時間沒有顯著差異，但在消退24 h后，小鼠的凝滯時間明顯減少。這表明CUR不會影響記憶形成和鞏固，但是可促進(jìn)恐懼記憶的消退。另外，PTSD小鼠在曠場中進(jìn)入中心區(qū)域的運(yùn)動距離和運(yùn)動時間減少，在高架十字迷宮中進(jìn)入開放臂的次數(shù)減少，而CUR給藥可改善小鼠的焦慮樣行為。在CUR給藥組中，CUR(20 mg/kg)組的焦慮樣行為改善程度最為明顯。因此，在后續(xù)病理切片中只選取CUR(20 mg/kg)組進(jìn)行觀察。結(jié)果表明CUR(20 mg/kg)給藥可改善其海馬神經(jīng)細(xì)胞的病理變化。同時，CUR給藥能降低其促炎細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β水平，并抑制NF-κB、NLRP3和Caspase-1的表達(dá)，說明仙茅苷可抑制PTSD小鼠的神經(jīng)炎癥，其焦慮樣行為的改善可能與抑制NF-κB對NLRP3炎癥小體的調(diào)控有關(guān)。PTSD發(fā)生的機(jī)制有很多，已有的報道包括突觸可塑性的破壞和炎癥反應(yīng)等[19]。本研究中，低劑量CUR對炎癥分子有調(diào)控，但不改善PTSD的行為功能，該結(jié)果進(jìn)一步說明PTSD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。

SPS動物促炎細(xì)胞因子的表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶的下降在精神疾病中發(fā)揮直接作用[20-22]。實驗室前期采用SPS模型發(fā)現(xiàn)安神定志方可通過改善海馬mTOR依賴性突觸功能來預(yù)防SPS暴露引起的行為改變[23]，并采用SPS&S模型證明了7,8-二羥基黃酮通過激活BDNF-TrkB信號通路來緩解星形細(xì)胞和突觸異常，從而抑制PTSD小鼠恐懼泛化和焦慮樣行為[24]。本研究表明，SPS&S導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)PTSD樣行為，且小鼠行為的改變伴隨著NF-κB蛋白和促炎細(xì)胞因子的激活。

大腦神經(jīng)炎性是導(dǎo)致PTSD病程發(fā)展的重要原因，大量神經(jīng)炎癥因子的釋放及免疫系統(tǒng)細(xì)胞的激活參與神經(jīng)發(fā)生、突觸可塑性、神經(jīng)元的存活等過程，從而影響學(xué)習(xí)記憶的形成[6,25]，并伴隨著抑郁、焦慮等情緒問題。在嚙齒類動物體內(nèi)外周注射脂多糖會導(dǎo)致大腦恐懼回路區(qū)域的炎癥反應(yīng)增加，特別是杏仁核[26]、前額葉皮質(zhì)[27]和海馬[28]，它們是恐懼消退過程中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。已有研究證明，NLRP3炎癥小體激活在調(diào)節(jié)恐懼記憶和PTSD以及焦慮癥發(fā)展中的關(guān)鍵作用[29]。同時，NLRP3/Caspase-1炎癥小體通路參與調(diào)控AD誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[30]。另外，NLRP3炎癥小體的激活會引起細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Gasdermin D的裂解、促炎細(xì)胞因子IL-1β的產(chǎn)生和小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化[31]，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。而仙茅苷具有抗炎作用，能夠抑制PTSD小鼠NF-κB蛋白的表達(dá)，降低促炎細(xì)胞因子的水平。并有研究表明，經(jīng)典名方二仙湯可抑制AD大鼠NLRP3/ASC/IL-1β通路相關(guān)蛋白的高表達(dá)[32]。仙茅是二仙湯的君藥，而仙茅主要活性成分仙茅苷可能是降低炎癥反應(yīng)的主要成分。

NF-κB作為細(xì)胞中的一個轉(zhuǎn)錄因子家族，是機(jī)體免疫、炎癥等過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可通過對免疫介質(zhì)刺激因子的活化而誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的表達(dá)[33]。研究表明，NF-κB對小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)揮重要作用[11,30]。并且，通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路可以抑制NLRP3炎癥小體的活化[34]。而仙茅苷可下調(diào)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的TNF-α、IL-1β和IL-6水平，并下調(diào)NF-κB與NLRP3的表達(dá)[13]。同時，仙茅苷可通過JAK/STAT/NF-κB信號通路在體內(nèi)外均發(fā)揮抗關(guān)節(jié)炎作用[35]。并且，研究結(jié)果指出在SPS&S模型小鼠海馬中NF-κB與NLRP3蛋白表達(dá)均升高。而CUR給藥后能夠明顯抑制其蛋白表達(dá)量，降低促炎細(xì)胞因子水平。基于以上研究，表明NF-κB調(diào)控NLRP3炎癥小體可能是仙茅苷預(yù)防或治療PTSD的重要靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)仙茅苷能夠改善SPS&S誘導(dǎo)的PTSD小鼠焦慮樣行為，促進(jìn)恐懼記憶的消退，降低炎癥因子的表達(dá)，其作用機(jī)制可能是通過NF-κB調(diào)控NLRP3炎癥小體來抑制PTSD小鼠的神經(jīng)炎癥。本研究尚存在一定的局限性，我們只檢測了海馬區(qū)的炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)，并未涉及其他腦區(qū)；仙茅苷調(diào)控NF-κB的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步確認(rèn)。