用于長(zhǎng)期神經(jīng)元放電記錄的一體化可步進(jìn)植入式神經(jīng)電極

張曦昊 詹 陽(yáng)

1(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)納米科學(xué)技術(shù)學(xué)院 蘇州 215127)

1 引 言

人類大腦約有 1 000 億個(gè)神經(jīng)元，它們之間通過(guò)復(fù)雜的動(dòng)作電位傳遞信息[1]。大腦作為人體復(fù)雜的器官之一，人們對(duì)其功能和作用機(jī)制的了解依然不足，大腦的功能機(jī)制研究仍是當(dāng)今熱門的科研領(lǐng)域之一[2-4]。近年來(lái)，自由活動(dòng)的清醒動(dòng)物的大腦中，各個(gè)相關(guān)腦區(qū)群體神經(jīng)元的活動(dòng)規(guī)律成為神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。在體多通道電生理技術(shù)是記錄神經(jīng)活動(dòng)的一種重要手段，該技術(shù)憑借其諸多優(yōu)勢(shì)已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究中[5-7]。在動(dòng)物清醒、自由活動(dòng)的狀態(tài)下，利用在體多通道電生理技術(shù)不僅可以觀察目的腦區(qū)神經(jīng)元的活動(dòng)狀態(tài)，使記錄的神經(jīng)元信號(hào)和正常生理狀態(tài)下一致，還可以記錄具體腦區(qū)的數(shù)百個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)[8-10]。一般來(lái)說(shuō)，研究人員使用在體多通道電生理技術(shù)，同時(shí)記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的電生理數(shù)據(jù)和行為學(xué)數(shù)據(jù)，以探究動(dòng)物特定行為下的腦區(qū)活動(dòng)情況。該技術(shù)主要包括電極的設(shè)計(jì)與組裝、電極埋植、電生理數(shù)據(jù)記錄以及電生理數(shù)據(jù)分析等步驟[11]。

近年來(lái)，為提升實(shí)驗(yàn)精度，提高實(shí)驗(yàn)效率，3D 打印的驅(qū)動(dòng)及輔助裝置已應(yīng)用于神經(jīng)電極的植入實(shí)驗(yàn)中[12-13]。用于神經(jīng)記錄的微絲探針也出現(xiàn)了集成度更高的絞合方法[14]，本文將新的集成度較高的電極支架制作方法應(yīng)用于多通道在體記錄中。雖然新型神經(jīng)電極已經(jīng)在精度[15]、器件化[16]、柔性化及功能化[17-21]等方面取得了很大的進(jìn)展，但本文所使用的方法仍具有價(jià)格低廉、制作方便等優(yōu)勢(shì)，新型電極如 neuropixels 售價(jià)在萬(wàn)元左右，本文的電極則采用四電極技術(shù)[22]，單個(gè)制作成本僅 500 元左右。在多通道在體記錄的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，電極的制作是關(guān)鍵步驟，而電極支架作為電極的主體部分尤為重要，其具有支撐、黏附連接器、組裝電極絲和步進(jìn)的作用。在傳統(tǒng)方法中[23]，電極支架的制作需要 PCB板、銅柱、環(huán)氧樹脂等材料，部件較為零散。針對(duì)其制作過(guò)程存在步驟煩瑣、一體化程度低、精度不高等問題，本文提出了一種新的電極支架制作方法，使得電極支架一體化程度和精度更高，重量更輕，節(jié)省了制作時(shí)間。此外，本文還進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究的動(dòng)物飼養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)(受理號(hào):SIAT-IRB-170811-NS-ZY-A0367)。實(shí)驗(yàn)選用年齡為 8～13 周的 C57BL/6J 雄鼠(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。動(dòng)物飼養(yǎng)在小鼠中央排風(fēng)通氣籠盒系統(tǒng)中，人為控制小鼠生活的燈光環(huán)境為 12 h 光照/12 h 黑暗。小鼠飼養(yǎng)房間內(nèi)的光照強(qiáng)度為 15～20 lux(光照時(shí)間為 8:00～20:00，自動(dòng)控制)，設(shè)施內(nèi)設(shè)定溫度為(23±2)℃，濕度為 40%～70%。

2.2 電極支架制作方法

為簡(jiǎn)化電極支架的制作流程，本文嘗試了新的電極支架制作方法。新的支架結(jié)構(gòu)采用光敏樹脂-國(guó)產(chǎn) 9400，用以替換傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)中的印制電路板(Printed Circuit Boards，PCB 板)與銅柱。在傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)中，需要手動(dòng)將 PCB 板與銅柱進(jìn)行組裝，然后用氧樹脂膠熱封，具體操作可參考馬曉宇等的方法[23]。由于手工制作過(guò)程較為煩瑣，且可能導(dǎo)致誤差，因此本文利用 3D 打印技術(shù)重新設(shè)計(jì)制作了電極支架。

2.3 有限元分析

有限元分析是利用數(shù)學(xué)近似的方法對(duì)真實(shí)的物理系統(tǒng)(幾何和載荷工況)進(jìn)行模擬。利用相互作用的元素(即單元)，就可用有限數(shù)量的未知量去逼近無(wú)限未知量的真實(shí)系統(tǒng)[24]。將電極支架的結(jié)構(gòu)信息導(dǎo)入有限元分析軟件 ANSYS 中，依托實(shí)驗(yàn)材料設(shè)置參數(shù)(表 1)，即可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬仿真。

表1 9400 樹脂材料參數(shù)Table 1 9400 resin material parameters

2.4 埋置電極手術(shù)

為驗(yàn)證電極的實(shí)用性，本文進(jìn)行了相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。如圖 1(a)所示，向小鼠腹腔注射60 mg/kg 體重劑量的 1% 戊巴比妥鈉，用以麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠。待動(dòng)物進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后，去除頭部皮毛，剪開頭皮，將實(shí)驗(yàn)小鼠固定在立體定位儀上，涂上眼膏，調(diào)平小鼠腦袋，確定海馬 3 區(qū)(CA3)的坐標(biāo)(A/P:－2.06 mm；M/L:2.30 mm)并用黑色油性筆標(biāo)記后，用顱鉆鉆開電極洞。在前囟前和后囟后面分別鉆一個(gè)孔，將連有地線和參考線的顱釘擰入顱骨。在顱骨中縫兩側(cè)合適的位置分別鉆一個(gè)洞，以制作電極支架的基層，并將顱釘旋入顱骨。先用 502 膠水固定顱釘，待 502 膠水凝固后，用牙科水泥將 4 顆顱釘包裹起來(lái)形成環(huán)形基座。用尖鑷挑破電極洞內(nèi)的硬腦膜，本次記錄腦區(qū)為 CA3，調(diào)整電極位置，電極置入深度為 2.35 mm。用液體石蠟和固體石蠟混合物將電極洞封住，然后利用比例適當(dāng)且均勻混合的牙科水泥，將環(huán)形基座和電極支架的下層板粘合在一起，待牙科水泥變硬后，將顱骨和連接器的地線、顱骨和連接器的參考線分別焊接在一起。在整個(gè)電極支架的四周緊密包圍上銅網(wǎng)，并在銅網(wǎng)上涂上稀釋的牙科水泥，待牙科水泥完全凝固后，用膠帶將整個(gè)電極支架纏繞起來(lái)，露出連接器，防止蘇醒后的小鼠破壞電極絲，且可避免灰塵進(jìn)入，電極埋植完成后的小鼠如圖 1(b)所示。將小鼠放在加熱墊上等待蘇醒，待小鼠恢復(fù)一周后，對(duì)小鼠進(jìn)行電生理信號(hào)記錄。

圖1 電極埋植手術(shù)展示圖Fig. 1 Electrode implantation operation display

2.5 神經(jīng)元在體記錄

本實(shí)驗(yàn)使用的記錄設(shè)備為美國(guó) Plexon 公司的128 通道在體電生理記錄系統(tǒng)。每根電極記錄的神經(jīng)放電信號(hào)經(jīng)微電極放大器放大后分為兩路，一路負(fù)責(zé)記錄神經(jīng)元的胞外動(dòng)作電位(采樣頻率為 40 kHz)，另一路負(fù)責(zé)記錄局部腦區(qū)的場(chǎng)電位(采樣頻率為 1 kHz)。上機(jī)觀察時(shí)，應(yīng)根據(jù)所觀察腦區(qū)的場(chǎng)電位特征和神經(jīng)元放電特征，決定是否推進(jìn)記錄電極。在步進(jìn)電極的操作中，控制每次步進(jìn)的距離為 50 μm 左右，每次電極推進(jìn)后，等候數(shù)小時(shí)再進(jìn)行下次推進(jìn)，以防止腦組織形變回彈而錯(cuò)過(guò)記錄腦區(qū)。通常電極經(jīng)過(guò)的地方神經(jīng)元會(huì)失活，因此記錄電極只進(jìn)不退。

3 結(jié)果與討論

3.1 新型電極支架的設(shè)計(jì)與組裝

本文提出的新型電極支架是在馬曉宇等[23]的電極結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)需求，重新進(jìn)行了設(shè)計(jì)。對(duì)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后整體建模，使得新電極支架的一體化程度更高，并利用光固化打印機(jī)批量制作電極支架。本文對(duì)電極支架的制作步驟亦進(jìn)行了優(yōu)化，使其組成部件更少，如圖 2 所示。其中，圖 2(a)為改進(jìn)前使用 PCB 板、銅柱的電極支架結(jié)構(gòu)，圖 2(b)為本文采用新技術(shù)的支架結(jié)構(gòu)。改進(jìn)前的結(jié)構(gòu)，需要手動(dòng)將銅柱鑲嵌入 PCB板中，并用環(huán)氧樹脂膠熱封連接處，過(guò)程煩瑣復(fù)雜。本文新設(shè)計(jì)的電極支架結(jié)構(gòu)如圖 3 所示，其包括上層蓋板結(jié)構(gòu) C 和下層主體部分。該支架通過(guò) 4 根圓柱連接電極支架下層的兩層板，使結(jié)構(gòu)更加牢固，當(dāng)受力時(shí)，在豎直方向上產(chǎn)生的應(yīng)變更小。圖 4 為部件組裝過(guò)程示意圖，圖 5 為初步完成組裝的電極支架實(shí)物圖，其中，孔洞的大小和位置可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整，該支架還可用于光電極的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中。

圖2 電極支架組件新舊對(duì)比圖Fig. 2 Comparison of old and new electrode holder assembly

圖3 電極支架結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 3 Schematic diagram of electrode structure

圖4 部件組裝示意圖Fig. 4 Component assembly diagram

圖5 電極支架實(shí)物圖Fig. 5 A finished electrode array

在電極組裝過(guò)程中，如圖 3 所示，首先將螺母放在 B 板的 d 孔上，將螺絲從 A 板上層穿過(guò) a孔螺母后，從 B 板的 d 孔穿出，將硅管粘滯在一起后穿過(guò) AB 板的 b、e 孔洞，與螺母用卡夫特強(qiáng)力 AB 膠粘滯在一起，此時(shí)，從 A 板的 a 孔上使用螺絲刀轉(zhuǎn)動(dòng)螺絲，可觀察到隨著螺絲刀的順逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)，螺母帶著硅管上下移動(dòng)；其次，將 C板直接通過(guò)對(duì)應(yīng)的孔洞蓋在 A 板上端，與圓柱連接的孔洞處用 502 膠水粘封后，將連接器用 AB膠粘在 AC 板的側(cè)邊；再次，使用鉑銥電極絲制作四電極，穿入預(yù)先粘滯在一起的硅管中，將電極絲尖端過(guò)火去除絕緣部分后，繞在連接器的引腳上，用銀漆點(diǎn)涂每個(gè)引腳，使電極絲與連接器之間的連接更加緊密，再將地線分別焊接在連接器的最末端對(duì)角線處；最后，使用 1∶1 混合均勻的 AB 膠封裝連接器、電極絲、地線即可。

3.2 模型受力分析

本小節(jié)將模擬步進(jìn)過(guò)程中支架結(jié)構(gòu)可能發(fā)生的變化，并對(duì)其進(jìn)行分析。在步進(jìn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員對(duì)電極支架施加一個(gè)力轉(zhuǎn)動(dòng)螺絲，以達(dá)到步進(jìn)的效果。若模擬支架的結(jié)構(gòu)發(fā)生形變，那么可能影響實(shí)驗(yàn)中腦區(qū)定位的準(zhǔn)確性，因此，本文對(duì)該情況下支架可能發(fā)生的形變進(jìn)行了模擬。在步進(jìn)過(guò)程中，螺絲刀向下轉(zhuǎn)動(dòng)步進(jìn)螺絲時(shí)可能會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)施加一個(gè)力，施力過(guò)程可以模擬為:在 a 孔邊緣的螺帽處施加一個(gè)圓環(huán)形法向的壓力的過(guò)程。電極支架的結(jié)構(gòu)材料為 9400 樹脂，具體參數(shù)如表 1所示。當(dāng)步進(jìn)壓力F＝1 N 時(shí)，模擬支架結(jié)構(gòu)可能發(fā)生的形變?nèi)鐖D 6 所示。結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)上層板在壓力作用下，沿負(fù)Z軸方向的最大形變?yōu)?.013 mm(圖 7)。在體多通道電生理記錄實(shí)驗(yàn)中，對(duì)帶有電極的小鼠施加的步進(jìn)壓力通常較小，以防止對(duì)動(dòng)物造成不可逆的損傷。當(dāng)壓力為 1 N時(shí)，支架結(jié)構(gòu)形變很小，幾乎不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。在以往使用的電極中，下層結(jié)構(gòu)是用環(huán)氧樹脂將銅柱和 PCB 板粘合而成，結(jié)構(gòu)連接處使用熱封的環(huán)氧樹脂膠水，膠水的用量、熱封溫度、膠水的配比等都會(huì)影響整體結(jié)構(gòu)參數(shù)。此外，將零散部件結(jié)合在一起的一體化程度較低，且連接處力學(xué)參數(shù)不能確定，不便進(jìn)行力學(xué)分析，而改進(jìn)后的結(jié)構(gòu)一體化優(yōu)勢(shì)可避免上述問題。

圖6 F＝1 N 時(shí)支架結(jié)構(gòu)受力示意圖Fig. 6 Simulation diagram for the applied force when F＝1 N

圖7 F＝1 N 時(shí)結(jié)構(gòu)形變效果圖Fig. 7 Simulation of the structural deformation when F＝1 N

3.3 結(jié)構(gòu)質(zhì)量對(duì)比

將本文電極支架與傳統(tǒng)電極支架的質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比，經(jīng)多組稱量后比較可知(圖 8 為其中一次稱量比較的結(jié)果)，與傳統(tǒng)電極支架質(zhì)量[23]相比，本文電極支架的質(zhì)量降低了 60% 左右。支架重量的降低在一定程度上可減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的負(fù)重，從而減少電極質(zhì)量對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)靈活性的影響。

圖8 新舊電極支架質(zhì)量對(duì)比圖Fig. 8 Weight comparison for the traditional electrode and the novel electrode

3.4 信號(hào)記錄

待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后恢復(fù)大約一周，再進(jìn)行后期行為訓(xùn)練或電生理信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始前，將小鼠用毛巾或棉花輕輕握在手心，待小鼠安靜并適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)操作后，將小鼠腦袋上纏繞在電極上的膠布解開，并檢查是否有木屑掉入電極連接器中，做好電極連接器的清理工作。將Plexon 系統(tǒng)的連接器與小鼠頭上的電極連接器相連接，檢查是否連接穩(wěn)定。在正式電生理信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)前 2～3 d，對(duì)小鼠重復(fù)上述操作，保證小鼠在實(shí)驗(yàn)時(shí)能夠自由活動(dòng)。打開 ominiplex(電生理信號(hào)記錄軟件)和 cineplex studio(行為學(xué)視頻記錄)軟件，分別在兩個(gè)軟件中設(shè)置好記錄參數(shù)，點(diǎn)擊開始記錄。圖 9 為截取的一段小鼠電生理活動(dòng)信號(hào)，獲取電生理信號(hào)數(shù)據(jù)后，在 offline sorter 軟件中，對(duì)全波段 wideband 原始數(shù)據(jù)做高通濾波，使用閾值檢測(cè)法，神經(jīng)元放電長(zhǎng)度為 1 400 μs，脈沖間隔為 1 ms，信號(hào)檢測(cè)閾值為 5 SD(standard deviation)。首先，提取滿足檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的信號(hào)，得到神經(jīng)元放電在時(shí)間軸上的集合；然后選擇主成分分析方法提取神經(jīng)元放電的不同特征；最后使用 offline sorter 軟件中的聚類算法k-means，進(jìn)行神經(jīng)元的聚類分析，神經(jīng)元分類的標(biāo)準(zhǔn)參考主成分分析的分類情況和類內(nèi)距離L-ration 以及類間距離 Isolatioin Distance兩個(gè)值的大小。后續(xù)具體分析參考徐佳敏等和Schmitzer-Torbert 等的方法[25-26]。

圖9 使用新型記錄電極得到的神經(jīng)元活動(dòng)信號(hào)Fig. 9 Spiking activities from the tetrode recordings using the novel electrode

4 結(jié) 語(yǔ)

結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)，本文制作出一種用于長(zhǎng)期神經(jīng)元放電記錄的一體化可步進(jìn)植入式神經(jīng)電極支架。該支架簡(jiǎn)化了電極的制作流程，提高了支架結(jié)構(gòu)的精度和一體化程度，提升了實(shí)驗(yàn)效率。此外，還減輕了電極的質(zhì)量，可一定程度上減輕實(shí)驗(yàn)鼠的負(fù)重，減少電極對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠自由活動(dòng)的影響。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該支架可正常記錄小鼠的電生理活動(dòng)。若確定了具體的實(shí)驗(yàn)?zāi)X區(qū)，就可批量制作該電極支架，還可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行定制。通過(guò)改變孔洞的半徑和位置，可同時(shí)記錄不同腦區(qū)的電生理信號(hào)；通過(guò)適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)改變，還可將該電極支架應(yīng)用于光遺傳實(shí)驗(yàn)中。