QuEChERS前處理技術在動物產(chǎn)品獸藥殘留檢測中的運用分析

王生華，康 平，熊永莉，洪維暉，伍 君，彭桂萍，雷 彬

（荊門市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，湖北 荊門 448000）

1 QuEChERS 前處理技術運用

QuEChERS 前處理技術是近年來在國際上最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術，因簡便、環(huán)保、低能耗、快速、安全可靠是當前樣品前處理的發(fā)展趨勢。樣品前處理是指樣品的制備、待測物的提取、凈化及濃縮等一系列過程。目前，動物樣品中獸藥殘留的前處理方法主要包括：基質(zhì)固相分散萃?。∕SPD）、分散固相萃取技術（DSPE）、固相萃取法（SPE）、液液萃取法（LLE）、固相微萃?。⊿PME）與 QuEChERS 萃取法等。這些方法所用有機溶劑量大，用檢測人員和環(huán)境不太友好，我們想借助QuEChERS 前處理在農(nóng)產(chǎn)品檢測中的優(yōu)勢，實驗用于動物樣品的前處理，驗證是否實現(xiàn)優(yōu)化動物樣品檢測方法的目的。

2 QuEChERS 前處理技術步驟

QuEChERS 前處理技術主要分為酸化乙腈的液液萃取過程和基質(zhì)分散固相萃取凈化過程兩個步驟。該方法的研究熱點及難點是通過改進提取溶劑和凈化填料的組分，以取得最佳的提取和凈化效果。其主要步驟如圖1。

圖1

2.1 萃取過程

提取溶劑：為了準確地測定動物樣品中殘留獸藥的含量，合適的提取溶劑的選擇尤為關鍵。乙腈極性范圍較寬，組織穿透能力較強，對蛋白質(zhì)、脂肪類化合物的提取率很低，對多數(shù)目標化合物有較好的溶解性和較高的提取效率；乙酸乙酯的極性相對較弱，毒性較低，二者均是較為理想的提取溶劑，加入一定體積分數(shù)的甲酸或者乙酸可以破壞基質(zhì)的組織結(jié)構，目標物質(zhì)在酸性環(huán)境下較易從組織結(jié)構中游離出來。

除水劑：提取溶劑除了能將待測物提取出來，同時也能提樣品中的水分，水分的存在使待測物部分溶于水中，與提取溶劑形成競爭關系，所以需要選擇合適的除水劑除去肌肉組織中的水分。常用除水劑有氯化鈉、無水硫酸鈉、硫酸鎂等，根據(jù)待測物的性質(zhì)單獨使用或復配使用。氯化鈉通過分層來除水，無水硫酸鈉、硫酸鎂通過吸水除水；硫酸鈉吸水快，水容量大，容易失水，在干燥體系易形成動態(tài)平衡，使干燥難以徹底，故只可作為初步吸附；無水硫酸鎂吸附相對較慢，只能形成二結(jié)晶水，但吸附相對徹底，不適合用來吸附含水量較大的體系，且價格稍貴，不適合大批量使用。

2.2 凈化過程

樣品經(jīng)提取溶劑、除水劑處理后，已經(jīng)除去部分的脂肪、蛋白質(zhì)以及水分等干擾物，提取溶劑除了能提取目標化合物和水分，同時也能提取樣品組織中的其他雜質(zhì)，想要有效地除去雜質(zhì)，同時不吸附目標化合物，凈化條件的選擇也顯得至關重要。QuEChERS 常用的凈化方式為：常用凈化劑、QuEChERS 凈化柱。

QuEChERS 方法中常用凈化劑：QuEChERS 的常用凈化劑包括：C18、PSA、GCB、酸性氧化鋁、硅藻土、-NH2凈化劑、中性氧化鋁；根據(jù)樣本和待測物的性質(zhì)選用單用或復配。PSA 含有2個氨基，能有效吸附糖類、脂肪、色素和其他極性有機酸。C18 有十八烷基官能團，能吸附脂肪等非極性干擾物，C18E 為封尾的 C18 凈化劑填料，是疏水性較強的硅膠基體凈化劑，對非極性化合物具有出色的保留特性，對大多數(shù)有機物都有保留；GCB 對平面結(jié)構分子有很強的親和性，故能有效地去除色素和甾醇，同時也會吸附具有平面結(jié)構的獸藥。硅藻土有很強的吸油率，能有效地除去脂肪。

3 QuEChERS 前處理技術應用實例

隨著 QuEChERS 技術的不斷改良，該技術在檢測領域已普遍運用。我們以豬肉中磺胺藥物殘留檢測為例，用檢測機構常用的國標方法與QuEChERS 技術檢測方法進行比較，在QuEChERS 技術檢測方法中優(yōu)化提取溶劑，確定除水劑及其用量，探究不同凈化劑的凈化效果，發(fā)現(xiàn)前處理過程操作簡單、耗時短、有機溶劑用量少、成本低，為動物產(chǎn)品中獸藥殘留檢測工作提供一定的參考。

QuEChERS 技術實驗過程：

3.1 前期準備

3.1.1 試樣制備

實驗用的豬肉樣品隨機購于各大商超市，樣品制備參照國標動物產(chǎn)品樣品處理方法。經(jīng)均勻搗碎后，樣品分成兩份，分別裝入干凈自封袋內(nèi)，一份作為試樣，一份作為留樣，保存于-20℃。

3.1.2 主要儀器（生產(chǎn)廠家僅為參考）（見表1）

表1

3.1.3 實驗試劑和耗材（生產(chǎn)廠家僅為參考） （見表2）

表2

3.1.4 標準物質(zhì)（見表3）

表3

3.1.5 溶液配制方法

（1）0.1%甲酸乙腈溶液：0.1ml 甲酸溶于 99.9ml 乙腈。

（2）0.5%甲酸乙腈溶液：0.5ml 甲酸溶于 99.5ml 乙腈。

（3）乙腈飽和正己烷溶液：1：1 的乙腈與正己烷充分混合均勻，取上層待用。

（4）獸藥標準中間溶液：分別準確量取一定體積的獸藥標準儲備液用色譜純甲醇定容，混勻后制成濃度為10μg/ml 的標準中間液，-18℃條件下可存放 3 個月。

（5）獸藥標準工作液：準確量取一定量的獸藥標準中間溶液于容量瓶，用色譜純甲醇定容至刻度，配制成的 1μg/ml 標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3.1.6 標準曲線制作

溶劑標準曲線：準確量取適量標準工作液，用 20%的甲醇水（v/v）稀釋成 5、10、20、50、100、200ng/ml 的混合標準工作液，供LC-MS/MS 測定。

3.1.7 色譜條件

色譜柱：waters色 譜 柱（150mm×2.1mm，5μm）；柱溫：40℃；流速：0.4ml/min；進樣體積 5μL；流動相 A：0.1%甲酸水溶液，流動相 B：甲醇，梯度洗脫。離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子模式，噴霧電壓：3500 V，掃描模式：多反應監(jiān)測（MRM）。

（1）結(jié)果計算 樣品中各獸藥計算公式如下，計算結(jié)果需扣除空白值。

式中：

Xi——樣品中某一獸藥的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；ci——樣品制備液中獸藥的濃度，單位為納克每毫（ng/ml）；V——最終定容體積，單位為毫升（ml）；

2——稀釋倍數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，單位為克（g）。

（2）回收率計算 樣品中某一獸藥的回收率公式如下：

式中：

Ri——樣品中某一獸藥的回收率，單位為（%）；

Xi加標——某一獸藥加標后試樣測得的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

Xi——樣品中某一獸藥的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；Mi——某一獸藥實際加入樣品中的含量，單位為微克每千克（μg/kg）。

3.2 實驗方法

3.2.1 提取劑單因素實驗

以乙腈0.1%甲酸乙腈、乙酸乙酯作為單因素條件，將磺胺類獸藥在豬肉中加標濃度設為 100ng/ml，以回收率為衡量指標，考察上述提取液對磺胺常用4 種獸藥的提取效果。

試樣前處理

（1）提取

稱取陰性豬肉（是指已檢測未含有上述 4 種獸藥的豬肉）5 g（精確至 0.01g）肌肉組織于 50 ml 離心管中，加入 2 ml 乙腈飽和正己烷；加入 10 ml 不同提取溶劑（① 乙腈；② 0.1%甲酸乙腈；③ 乙酸乙酯），立即渦旋1min（2500rpm），充分混合均質(zhì)，超聲 10 min，5000 r/min 離心 5 min。

（2）濃縮

準確移取5 ml 中間層提取液于氮吹管中，40℃氮吹至干，用 20%的甲醇水（v/v）定容至1 ml，渦旋，過 0.22μm 有機濾膜，供 LC-MS/MS 測定。

（3）測定

利用設置的色譜條件和質(zhì)譜條件，將樣品溶液進行測定，外標法定量，定量離子采用豐度最大的二級特征離子碎片。

3.2.2 除水劑單因素實驗

（1）提取

稱取陰性豬肉 5g（精確至0.01g）肌肉組織于50 ml 離心管中，加入2ml乙腈飽和正己烷；加入10ml 0.5%甲酸乙腈，加蓋立即渦旋1min（2500rpm），充分混合均質(zhì)，超聲10min。

（2）脫水（考察以下 2 種情況）

加入不同的除水劑，加蓋渦旋 1min（2500rpm），充分混合均質(zhì)，超聲5min，5000r/min 離心5min；

① 2g 氯化鈉、2g 無水硫酸鈉、2g 無水硫酸鎂；② 硫酸鈉（2g、4g）；

③加1g無水硫酸鈉+1g無水硫酸鎂、加2g無水硫酸鈉+2g無水硫酸鎂

（3）濃縮

準確移取5ml 中間層提取液于氮吹管中，40℃氮吹至干，用 20%的甲醇水（v/v）定容至1ml，渦旋，過0.22μm 有機濾膜，供 LC-MS/MS 測定。

（4）測定

利用設置的色譜條件和質(zhì)譜條件，將樣品溶液進行測定，外標法定量，定量離子采用豐度最大的二級特征離子碎片。

通過實驗結(jié)果證明，一是QuEChERS 方法和國家標準的檢測成本對比，QuEChERS 方法試劑成本65元，常規(guī)方法試劑成本212元，降低檢測成本為69.3%。二是檢測方法回收率同國標方法比對，QuEChERS 方法回收率能達到70%～95%，國標的方法結(jié)果在55%～90%。三是分析速度快，能在30min 內(nèi)完成6個樣品的處理。四是溶劑使用量少，污染小，價格低廉。五是操作簡便，無需良好訓練和較高技能便可很好地完成。六是樣品制備過程中使用很少的玻璃器皿，裝置簡單。

QuEChERS 技術在動物產(chǎn)品檢測中不同程度存在受基質(zhì)效應干擾樣品檢測分析問題，影響樣品的準確度、精密度、檢出限和定量限，也會因檢測過程中化學試劑含有毒有害物質(zhì)，影響檢測人員身體健康等問題。在檢測操作中要充分評估各種風險，確保數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。