香蕉果酒接種發(fā)酵和自然發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌菌落變化及有機(jī)酸代謝特征

楊 瑩，但 霞，管敬喜，李杰民，何雪梅，葉冬青*，孫 健*

香蕉果酒接種發(fā)酵和自然發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌菌落變化及有機(jī)酸代謝特征

楊 瑩1,2,3，但 霞2,3，管敬喜2,3，李杰民1,2,3，何雪梅1,2,3，葉冬青1,2,3*，孫 健1,2,3*

1. 廣西農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧 530007；2. 廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；3. 廣西香蕉保鮮與加工工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530007

香蕉營(yíng)養(yǎng)豐富、活性物質(zhì)含量高，可作為深加工產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)原料。香蕉果酒是香蕉精深加工產(chǎn)品中的重要一類。由于香蕉果漿碳水化合物含量較高、酸度低、糖分高，其釀造過(guò)程中適宜各種微生物的生長(zhǎng)繁殖，特別是乳酸菌數(shù)量的變化與酸類物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)。乳酸菌群落的變化容易增加發(fā)酵過(guò)程的風(fēng)險(xiǎn)，造成香蕉酒揮發(fā)酸含量超標(biāo)、品質(zhì)低下等不良結(jié)果。因此明確香蕉果酒發(fā)酵過(guò)程中自然存在的乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律及其對(duì)有機(jī)酸代謝的影響，可為精準(zhǔn)調(diào)控發(fā)酵過(guò)程、提高產(chǎn)品質(zhì)量提供理論依據(jù)。試驗(yàn)設(shè)置商業(yè)酵母Lalvin K1TM接種發(fā)酵過(guò)程（K1）與香蕉果汁自然發(fā)酵過(guò)程（SF）2組對(duì)比，采用實(shí)時(shí)定量PCR方法和高效液相色譜法對(duì)香蕉汁接種發(fā)酵（K1）與自然發(fā)酵過(guò)程（SF）中酵母菌、乳酸菌的生長(zhǎng)規(guī)律以及有機(jī)酸的含量變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明：2種發(fā)酵處理下，酵母菌和乳酸菌的生長(zhǎng)規(guī)律有差異；K1酵母菌主導(dǎo)的發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌的生長(zhǎng)受到顯著抑制，最大生長(zhǎng)量?jī)H為4.0×106CFU/mL，而酵母菌生物量為1.2×107CFU/mL；在自然發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌與酵母菌的生長(zhǎng)周期完全錯(cuò)開，但對(duì)乳酸菌的生物量無(wú)顯著影響，乳酸菌與酵母菌的生長(zhǎng)量分別達(dá)到1.0×107CFU/mL和1.6×107CFU/mL。2種發(fā)酵過(guò)程均表明，酵母菌和乳酸菌的生長(zhǎng)存在競(jìng)爭(zhēng)與抑制關(guān)系；有機(jī)酸代謝主要與乳酸菌菌落數(shù)量相關(guān)，不同有機(jī)酸的總體變化趨勢(shì)一致；在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸含量逐漸增加，乙酸含量呈先增后降的趨勢(shì)，二者在自然發(fā)酵樣品中的累積量均高于接種發(fā)酵；檸檬酸、蘋果酸、酒石酸含量整體呈下降趨勢(shì)。

乳酸菌；菌落變化；有機(jī)酸代謝；香蕉果酒

果酒是以水果為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而成的低度飲料酒，而乳酸菌是天然參與到果酒發(fā)酵中的重要菌群。乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖與代謝產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵過(guò)程及產(chǎn)品品質(zhì)都具有極其重要的影響。乳酸菌應(yīng)用于果蔬汁發(fā)酵，可以提高發(fā)酵汁中總酚、多糖、黃酮類化合物含量以及抗氧化活性[1-4]；利用多種酵母與乳酸菌混合發(fā)酵葡萄酒可以增加葡萄酒酚類物質(zhì)含量與香氣成分[5-6]?？梢?，乳酸菌和酵母菌共同參與發(fā)酵對(duì)果汁（酒）的感官品質(zhì)具有積極顯著的影響。但在發(fā)酵過(guò)程中菌種生長(zhǎng)的拮抗與促進(jìn)作用同時(shí)存在，在馬奶酒中，乳酸菌發(fā)酵液可以促進(jìn)酵母菌的生長(zhǎng)，但酵母菌發(fā)酵液只對(duì)糞腸球菌的生長(zhǎng)及其產(chǎn)酸能力有促進(jìn)作用，對(duì)堅(jiān)強(qiáng)腸球菌完全無(wú)促進(jìn)作用[7]；葡萄酒中，商業(yè)酵母Lalvin K1TM、Enoferm M2TM、Lalvin QA23TM抑制乳桿菌的生長(zhǎng)，但Lalvin 4600TM等商業(yè)酵母對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)無(wú)影響[8]；荔枝酒中酵母的代謝產(chǎn)物可以抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，但同時(shí)接種乳酸菌和酵母卻能共同生長(zhǎng)，并且增加了乙酸異戊酯、芳樟醇、香葉醇等香氣成分的濃度[9]。目前，參與發(fā)酵的菌種生長(zhǎng)互作機(jī)制還不明確，從營(yíng)養(yǎng)角度研究指出乳酸菌在快速繁殖生長(zhǎng)過(guò)程中首先占用了必需氨基酸、維生素等生長(zhǎng)因素，而酵母菌對(duì)生長(zhǎng)因子的吸收速率低于細(xì)菌，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，從而影響其生長(zhǎng)活性[10-11]，也有研究表明乳酸菌可以通過(guò)分泌有機(jī)酸和競(jìng)爭(zhēng)生存空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)，同時(shí)還存在未檢測(cè)到的因子在抑制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，而植物乳桿菌的細(xì)胞壁可以通過(guò)直接接觸抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)[12]。隨著LuxS/AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)（QS）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展，目前研究者從群體感應(yīng)角度來(lái)探討乳酸菌與酵母菌種間的信息交流模式也取得了一定進(jìn)展[13]。由此可見，乳酸菌與酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中的共生機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，還需要針對(duì)不同基質(zhì)開展具體研究。

香蕉是廣西第二大水果，2020年廣西的蕉類面積9.4萬(wàn)hm2，產(chǎn)量337.61萬(wàn)t，產(chǎn)值174.45億元，是廣西重要的作物之一。香蕉屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（）植物，其果肉中含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、鉀、維生素等，同時(shí)含有酚類、類黃酮等活性物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[14-15]。目前我國(guó)香蕉深加工還處于初級(jí)階段，香蕉加工率僅為4.9%，遠(yuǎn)低于菲律賓等香蕉主產(chǎn)國(guó)20%的加工率，香蕉加工業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景[16]。而香蕉果酒總體加工技術(shù)水平較低，一方面是由于香蕉高淀粉、高糖度的果實(shí)特性使得香蕉不具備優(yōu)良的釀造特性[17-18]；另一方面是香蕉果漿豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為酵母菌、乳酸菌等菌群提供了適宜的生長(zhǎng)繁殖條件。香蕉植株上微生物組成豐富，乳酸菌是香蕉果實(shí)上的優(yōu)勢(shì)菌種[19]。香蕉表皮和果漿中還存在植物乳桿菌、戊糖乳桿菌、酪黃腸球菌等乳酸菌[19-21]以及多種內(nèi)生菌[22]，給香蕉酒釀造過(guò)程增添諸多不穩(wěn)定因素。香蕉果酒的發(fā)酵過(guò)程，酵母菌與乳酸菌的生長(zhǎng)互作及代謝互作是決定發(fā)酵是否順利以及香蕉果酒品質(zhì)高低的重要因素。同時(shí)，有機(jī)酸是乳酸菌代謝的主要產(chǎn)物，果酒中的有機(jī)酸不僅對(duì)果酒的風(fēng)味、品質(zhì)、穩(wěn)定性等方面有著很大影響，同時(shí)具有抑制細(xì)菌、增強(qiáng)抗氧化性等重要保健作用[23]。果酒發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的生長(zhǎng)變化與有機(jī)酸的含量及特征密切相關(guān)。因此，探明香蕉果酒發(fā)酵過(guò)程中自然乳酸菌的生長(zhǎng)及其對(duì)果酒有機(jī)酸含量的影響，對(duì)指導(dǎo)高品質(zhì)優(yōu)質(zhì)香蕉果酒的生產(chǎn)工藝的提升具有重要作用。

本研究采用熒光定量PCR方法監(jiān)測(cè)香蕉果汁在接種釀酒酵母與自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌與乳酸菌的生長(zhǎng)變化情況，使用高效液相色譜法測(cè)定2種發(fā)酵過(guò)程中5種主要有機(jī)酸的含量，研究2種發(fā)酵體系下，乳酸菌與酵母菌的相互作用規(guī)律及其對(duì)香蕉果酒有機(jī)酸含量的影響，以期為香蕉果酒發(fā)酵技術(shù)的改進(jìn)和品質(zhì)提升提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：成熟度良好的市售新鮮香蕉‘威廉斯’。

試劑：商業(yè)酵母菌菌株Lalvin K1TM（法國(guó)拉曼德公司）；果膠酶、淀粉酶購(gòu)于安琪酵母有限公司；蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、乙酸、甲醇等均為色譜純?cè)噭?，?gòu)于國(guó)藥公司。

儀器與設(shè)備：7500 Fast熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；LA-20高效液相色譜儀（日本島津）；色譜柱Shim-pack GIS C18柱（日本島津）；DHG- 9240A恒溫培養(yǎng)箱（上海左樂(lè)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵試驗(yàn) 選擇成熟度良好，無(wú)腐爛變質(zhì)的香蕉，去皮、打漿后，加入100 mg/L果膠酶和80 mg/L淀粉酶于40℃酶解2 h。隨后加入60 mg/L SO2溶液混勻后過(guò)濾壓榨得香蕉清汁。所得香蕉清汁含糖量為195 g/L，可滴定酸為4.75 g/L，pH為4.5。在1 L無(wú)菌三角瓶中加入約600 mL香蕉清汁，接入活化處理后酵母Lalvin K1TM（200 mg/L）啟動(dòng)發(fā)酵，記為K1，香蕉清汁自然發(fā)酵（不接入任何菌種）記為SF，發(fā)酵溫度均為25℃，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。發(fā)酵過(guò)程中每24 h測(cè)定還原糖含量以監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程。

1.2.2 菌落監(jiān)測(cè) 發(fā)酵過(guò)程中每24 h取樣監(jiān)測(cè)乳酸菌和酵母菌落變化。菌落計(jì)數(shù)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，具體方法參考CHAI等[24]的方法。取20 mL發(fā)酵液加入離心管中，8000 r/min離心10 min，菌泥沉淀用生理鹽水洗滌3次，液氮低溫冷凍并置于-80℃冰箱保藏，進(jìn)行熒光定量PCR分析。選擇乳酸菌特異性定量分析引物L(fēng)ac-F （5′-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3′）和Lac-R（5′- ATTYCACCGCTACACATG-3′）對(duì)乳酸菌總量進(jìn)行定量，釀酒酵母（）采用的引物為YEAST-F（5′-GAGTCGAG TTGTTTGGGAATGC-3′）和YEAST-R（5′-TCTCT TTCCAAAGTTCTTTTCATCTTT-3′）[25]。

PCR擴(kuò)增體系：每個(gè)樣本分別用待檢測(cè)基因和內(nèi)參基因進(jìn)行引物擴(kuò)增，采用20 μL體系擴(kuò)增：cDNA 2 μL，qPCR mix 10 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6 μL。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定 發(fā)酵過(guò)程中每24 h取發(fā)酵液，離心取上清液，檢測(cè)還原糖、酒精度、可滴定酸、氨基酸以及有機(jī)酸含量。

還原糖測(cè)定采用DNS法，酒精度測(cè)定采用重鉻酸鉀法（GB 5009.225—2016），酒精度以乙醇的體積百分比表示（/, %）。，可滴定酸測(cè)定采用NaOH滴定法，總氨基酸使用索萊寶氨基酸檢測(cè)試劑盒（BC1570）進(jìn)行測(cè)定。

有機(jī)酸（蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、乙酸）采用高效液相色譜法測(cè)定，具體方法參考李憑等[26-27]的方法，稍作調(diào)整：流動(dòng)相0.01 mol/L NH4H2PO4（3%甲醇水溶液溶解），pH 2.3，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為20 μL。將樣品稀釋20倍，用0.22 μm膜過(guò)濾后進(jìn)行有機(jī)酸測(cè)定。采用外標(biāo)法進(jìn)行各物質(zhì)濃度的計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用One-Way ANOVA法進(jìn)行多組間比較，使用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中酵母菌與乳酸菌生物量的動(dòng)態(tài)變化

接種處理發(fā)酵過(guò)程（K1）中酵母菌和乳酸菌數(shù)量的變化見圖1A，接種的酵母菌始終占據(jù)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，最高生長(zhǎng)量達(dá)到1.2×107CFU/mL，并且在發(fā)酵的前9 d均維持在較高的生長(zhǎng)水平，第10天開始快速下降；乳酸菌數(shù)量第7天開始上升，第8天達(dá)到峰值后逐漸消亡。酵母菌的最大生物量是乳酸菌的4倍。

香蕉清汁自然發(fā)酵過(guò)程（SF）中酵母菌和乳酸菌的變化如圖1B，乳酸菌比酵母菌更先獲得增殖，在第4天開始快速增殖，第7天達(dá)到峰值1.0×107CFU/mL，第8天快速消亡；酵母菌在第8天進(jìn)入較快增殖期，第11天生物量達(dá)到最大，隨后開始快速下降。從圖1B可以看出乳酸菌與酵母菌的生長(zhǎng)周期存在錯(cuò)峰現(xiàn)象，但乳酸菌與酵母菌的最大生長(zhǎng)量基本相當(dāng)。在香蕉汁的自然發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌先進(jìn)行乳酸發(fā)酵，發(fā)酵汁中野生酵母菌在乳酸菌數(shù)量下降后開始迅速增殖。

A: K1; B: SF.

對(duì)比2組處理可以發(fā)現(xiàn)，接種酵母的發(fā)酵過(guò)程與自然發(fā)酵過(guò)程的酵母菌生長(zhǎng)量變化不大，均可達(dá)到107CFU/mL的生物量；但是不同發(fā)酵過(guò)程對(duì)乳酸菌數(shù)量的影響較為顯著，自然發(fā)酵過(guò)程的乳酸菌生物量是接種酵母發(fā)酵過(guò)程的10倍，表明乳酸菌的生長(zhǎng)受接種酵母菌的抑制。另一方面，自然發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌雖然能達(dá)到107CFU/mL的生物量，但其也與酵母菌存在錯(cuò)峰生長(zhǎng)，表明野生酵母菌和乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中也存在相互競(jìng)爭(zhēng)的抑制作用。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中還原糖、酒精度與滴定酸含量的變化

果酒發(fā)酵過(guò)程中，乙醇的產(chǎn)生主要是酵母將果汁中的糖分轉(zhuǎn)變?yōu)榫凭倪^(guò)程。發(fā)酵過(guò)程中每24 h測(cè)定發(fā)酵液還原糖含量、酒精含量監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程。從圖2可以看出，2組處理均可以順利完成發(fā)酵（還原糖含量<2 g/L）。發(fā)酵前期酒精生成趨勢(shì)基本相當(dāng)，K1發(fā)酵過(guò)程中第2～4天酒精含量迅速上升，而SF發(fā)酵過(guò)程中在第4天后開始升高。2組處理中酒精含量的迅速上升與其糖消耗速率一致。SF發(fā)酵過(guò)程中酒精度在第2～6天增長(zhǎng)較慢，與酵母菌的生長(zhǎng)曲線對(duì)應(yīng)。2組發(fā)酵的酒精度均能達(dá)到11%（/）以上，說(shuō)明酵母Lalvin K1TM與野生酵母都可以完成香蕉果酒的釀造。從還原糖的變化趨勢(shì)可看出，由于K1發(fā)酵過(guò)程接種了酵母，對(duì)糖的消耗較快，完成酒精發(fā)酵的時(shí)間相對(duì)較短；而SF發(fā)酵過(guò)程的發(fā)酵前期主要是乳酸菌的增長(zhǎng)，因此還原糖利用比較緩慢。

圖2 不同處理發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量與酒精度的變化

發(fā)酵過(guò)程中，2組發(fā)酵過(guò)程的滴定酸不斷累積（圖3），分別從初始含量4.75 g/L增加到8.66 g/L（K1）和11.06 g/L（SF）。這可能與SF組中乳酸菌受酵母抑制作用較小，生成了更多的酸有關(guān)。

圖3 不同處理發(fā)酵過(guò)程中滴定酸含量的變化

2.3 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

發(fā)酵基質(zhì)中的氮源是微生物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。酵母和乳酸菌在增殖過(guò)程中都需要大量氨基酸及小分子多肽來(lái)合成細(xì)胞相關(guān)成分。如圖4所示，2組發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量均顯著下降，K1發(fā)酵過(guò)程比SF的氨基酸消耗更快，與K1發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的生長(zhǎng)更快相對(duì)應(yīng)。

圖4 不同處理發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量的變化

2.4 發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸代謝特征

有機(jī)酸作為果酒中重要的感官物質(zhì)，支撐果酒的整體結(jié)構(gòu)，對(duì)果酒的品質(zhì)有重要影響。乳酸菌的有機(jī)酸代謝在果酒中占主導(dǎo)地位；酵母菌的酒精發(fā)酵也會(huì)產(chǎn)生少量乙酸和乳酸[28]。如圖5所示，在香蕉汁酒精發(fā)酵過(guò)程中，2組處理中的5種主要有機(jī)酸變化趨勢(shì)基本一致，蘋果酸、檸檬酸、酒石酸含量呈整體下降趨勢(shì)，乳酸含量逐漸升高，乙酸含量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。

蘋果酸和檸檬酸是香蕉果實(shí)中的主要有機(jī)酸[29]。由圖5可知，蘋果酸和檸檬酸初始含量最高，發(fā)酵后生成乳酸和乙酸。在發(fā)酵過(guò)程中，香蕉酒中蘋果酸含量不斷降低，一部分是由于部分酵母菌三羧酸循環(huán)，利用蘋果酸生成酒精；另一部分主要是由于發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的蘋果酸-乳酸發(fā)酵反應(yīng)。在發(fā)酵初期，SF發(fā)酵過(guò)程中的蘋果酸下降速率較K1快，這主要與SF發(fā)酵過(guò)程中更高的乳酸菌含量有關(guān)，但在發(fā)酵末期，2組處理發(fā)酵過(guò)程中的蘋果酸含量并無(wú)顯著差異。乳酸是蘋果酸-乳酸發(fā)酵途徑的主要產(chǎn)物，其含量受乳酸菌活菌數(shù)的影響較大。2組處理發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸含量均呈先增后降的趨勢(shì)。研究表明，發(fā)酵初期，為適應(yīng)香蕉汁的脅迫環(huán)境，微生物會(huì)生成檸檬酸，以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外pH。此外，2組處理發(fā)酵過(guò)程中酒石酸含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行均呈下降趨勢(shì)，這可能是發(fā)酵環(huán)境變化導(dǎo)致酒石酸結(jié)晶沉淀。酒石酸含量在SF發(fā)酵前期下降較慢，發(fā)酵結(jié)束SF樣品中的酒石酸含量顯著低于K1發(fā)酵處理。

在香蕉汁酒精發(fā)酵過(guò)程中，SF發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量明顯高于K1，發(fā)酵結(jié)束后SF中乳酸的含量也顯著高于K1，表明在存在優(yōu)勢(shì)釀酒酵母菌的條件下，乳酸菌的代謝途徑受到一定影響。乙酸是酒類發(fā)酵過(guò)程中的不良產(chǎn)物，其含量超出一定閾值后會(huì)帶來(lái)不良風(fēng)味。本研究中，2組發(fā)酵處理的香蕉酒樣品中乙酸含量均低于0.5 g/L，低于國(guó)家限定標(biāo)準(zhǔn)。在酒精發(fā)酵全過(guò)程中，SF中的乙酸含量始終高于K1，這可能是商業(yè)酵母菌Lalvin K1TM的接種抑制了雜菌生長(zhǎng)，從而減少了乙酸的生成。

3 討論

果酒發(fā)酵的本質(zhì)是多菌種的協(xié)同作用，同時(shí)存在不同菌種的相互作用。相關(guān)研究表明，在葡萄酒發(fā)酵中酵母菌與乳酸菌存在相互抑制的關(guān)系，ALEXANDRE等[30]曾提出酒酒球菌利用精氨酸合成的鳥氨酸是導(dǎo)致酵母菌細(xì)胞死亡的主要因素。BONOMO等[31]報(bào)道了0.5～1.0 g/L鳥氨酸可以抑制野生酵母菌感染葡萄酒。也有研究指出酵母菌造成乳酸菌死亡的原因是酵母菌代謝產(chǎn)生的乙醇、中鏈脂肪酸、二氧化硫等物質(zhì)的作用[30, 32]。脂肪酸抑制乳酸菌三磷酸腺苷（ATP）酶活性，降低了細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)pH和細(xì)胞膜間代謝轉(zhuǎn)移的必要跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子梯度[32]。同時(shí)，酒精發(fā)酵形成的高酸低pH環(huán)境是釀酒酵母對(duì)乳酸菌（LAB）的生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生消極影響的原因[33-34]。本研究表明，在香蕉果酒發(fā)酵過(guò)程中，接種商業(yè)酵母菌發(fā)酵與自然發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌的最大生物量差別不大，但不同發(fā)酵體系中乳酸菌生物量差異顯著。在商業(yè)酵母菌Lalvin K1TM主導(dǎo)的發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌生物量顯著降低，有機(jī)酸總量也相應(yīng)較低。自然發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌和乳酸菌都能達(dá)到較高的生物量，但由于相互抑制作用，存在錯(cuò)峰生長(zhǎng)的趨勢(shì)。由此可見，在發(fā)酵香蕉果酒的過(guò)程中，酵母菌與乳酸菌存在生存競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。OLGAL等[8]研究了葡萄酒中植物乳桿菌與酵母菌的生長(zhǎng)互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)商業(yè)酵母菌Lalvin K1TM、Enoferm M2TM、Lalvin QA23TM抑制乳桿菌的生長(zhǎng)；但Lalvin 4600TM等商業(yè)酵母菌對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)無(wú)影響。說(shuō)明植物乳桿菌與酵母菌的生長(zhǎng)互作可能與酵母菌的種屬及生理特性相關(guān)。

圖5 不同處理發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化

本研究中，2種發(fā)酵處理對(duì)發(fā)酵酒中的乳酸、乙酸含量具有顯著影響。采用商業(yè)酵母菌Lalvin K1TM主導(dǎo)發(fā)酵可以很好地控制發(fā)酵香蕉酒中的乙酸含量，自然發(fā)酵能夠獲得更高的乳酸含量，對(duì)于需要增加酸度的果酒具有良好的增酸作用。在果汁發(fā)酵過(guò)程中，由于存在不同微生物種屬的多樣性，有機(jī)酸的代謝相互交錯(cuò)非常復(fù)雜。本研究只初步探索了2種發(fā)酵處理中菌株數(shù)量與有機(jī)酸含量的變化，后續(xù)還需要進(jìn)一步在基因和蛋白等層面進(jìn)行有機(jī)酸代謝的深層次研究，為果酒發(fā)酵的控制提供理論支撐。

[1] CHEN C, LU Y Q, YU H Y, CHEN Z Y, TIAN H X. Influence of 4 lactic acid bacteria on the flavor profile of fermented apple juice[J]. Food Bioscience, 2019, 27(1): 30-36.

[2] 劉 濤, 韋仕靜, 任 杰, 楊繼國(guó), 寧正祥. 桑葚汁多菌種發(fā)酵過(guò)程主要成分及抗氧化性的變化[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(19): 131-135, 141.

LIU T, WEI S J, REN J, YANG J G, NING Z X. The change of index and antioxidant activity in mulberry juice fermentation process[J]. Science and Technology of Food Industry, 2017, 38(19): 131-135, 141. (in Chinese)

[3] KWAW E, MA Y K, TCHABO W, APALIYA M T,WU M, SACKEY A S, XIAO L L, TAHIR H E. Effect ofstrains on phenolic profile, color attributes and antioxidant activities of lactic-acid-fermented mulberry juice[J]. Food Chemistry, 2018, 250: 148-154.

[4] LI C, NIE S P, ZHU K X, XIONG T, XIE M Y.NCU116 fermented carrot juice evokes changes of metabolites in serum from type 2 diabetic rats[J]. Food Research International, 2016, 80: 36-40.

[5] MASSIMO I, BRUNO T, SILVIA J L, ALMUDENA G R, CAROLINA M G, BEGONA B, M. VICTORIA M A. Selection and technological potential ofbacteria suitable for wine malolactic fermentation and grape aroma release[J]. LWT - Food Science and Technology, 2016, 73: 557-566.

[6] MINNAARA P P, DU PLESSISA H W, JOLLYA N P, VAN DER RIJSTC M, DU TOIT M. Non-yeast and lactic acid bacteria in Co-inoculated fermentations with twoyeast strains: a strategy to improve the phenolic content of Syrah wine[J]. Food Chemistry: X, 2019, 4: 100070.

[7] 賀銀鳳, 劉敏敏, 李燕軍, 楊 冬. 酸馬奶酒中乳酸菌和酵母菌互作關(guān)系的研究[J]. 食品科技, 2011, 36(5): 32-36.

HE Y F, LIU M M, LI Y J, YANG D. Interactions between lactic acid bacteria and yeasts from koumiss[J]. Food Science and Technology, 2011, 36(5): 32-36. (in Chinese)

[8] OLGA L, ISABLE P, JOSE M H, SIBYLLE K, SERGI F. Influence of yeast strains on managing wine acidity using[J]. Food Control, 2018, 92: 471-478.

[9] CHEN D, LIU S Q. Transformation of chemical constituents of lychee wine by simultaneous alcoholic and malolactic fermentations[J]. Food Chemistry, 2016, 196: 988-995.

[10] LERM E, ENGELBRECHT L, DU TOIT M. Malolactic fermentation: the ABC’s of MLF[J]. South African Journal for Enology and Viticulture, 2010, 31(2): 186-212.

[11] WIBOWO D, FLEET G H, LEE T H, ESCHENBRUCH R E. Factors affecting the induction of malolactic fermentation in red wines with[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1988, 64(5): 421-428.

[12] DING Y J, NIU Y P, CHEN Z, DONG S J, LI H. Discovery of novelco-existence-associated influencing factor(s) onfermentation performance[J]. LWT - Food Science and Technology, 2021, 135: 110268.

[13] 段小果, 李 博, 賀銀鳳. 乳酸菌與酵母菌共生機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2017, 44(8): 1988-1995.

DUAN X G, LI B, HE Y F. Progress in symbiotic mechanism between lactic acid bacteria and yeast[J]. Microbiology China, 2017, 44(8): 1988-1995. (in Chinese)

[14] 姚艷麗, 謝江輝, 朱祝英, 楊玉梅, 胡玉林, 孫德權(quán), 張秀梅. 香蕉果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化規(guī)律[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2011, 32(11): 2012-2015.

YAO Y L, XIE J H, ZHUZ Y, YANG Y M, HU Y L, SUN D Q, ZHANG X M. Changes of nutrient components during the development of banana fruit[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2011, 32(11): 2012-2015. (in Chinese)

[15] 陳海強(qiáng), 楊公明, 梅為云, 李昌寶, 余 銘. 不同品種香蕉果實(shí)成熟期主要營(yíng)養(yǎng)與功能成分含量變化[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 41(22): 24-28.

CHEN H Q, YANG G M, MEI W Y, LI C B, YU M. Changes of main nutritional and functional components in different varieties of banana during ripening[J]. Guangdong Agriculture Science, 2014, 41(22): 24-28. (in Chinese)

[16] 何俞均, 王 芳. 基于波特鉆石理論的中國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力分析[J]. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè), 2022, 104(1): 19-26.

HE Y J, WANG F. Analysis of China’s banana industrial competitiveness based on Porter’s Diamond Theory[J]. China Tropical Agriculture, 2022, 104(1): 19-26. (in Chinese)

[17] 柏建玲, 莫樹平, 張菊梅, 王惠惠, 吳軍林, 吳清平. 香蕉酒發(fā)酵及膠清工藝技術(shù)研究[J]. 釀酒科技, 2019, 300(6): 86-90.

BAI J L, MO S P, ZHANG J M, WANG H H, WU J L, WU Q P. Fermentation & clarification technology of banana wine[J]. Liquor-Making Science & Technology, 2019, 300(6): 86-90. (in Chinese)

[18] 李艷芳, 徐 匆, 羅華建, 梁衛(wèi)驅(qū), 胡 珊, 陳仕麗, 黃 皓. 嶺南特色果酒的研究與應(yīng)用[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 41(5): 159-162.

LI Y F, XU C, LUO H J, LIANG W Q, HU S, CHEN S L, HUANG H. Research and application of Lingnan characteristic fruit wine[J]. Guangdong Agriculture Science, 2014, 41(5): 159-162. (in Chinese)

[19] 郗恩光, 譚海生, 楊勁松, 崔坤鵬, 張萬(wàn)昌, 鞠雪莉, 李曉雷, 張桂和. 香蕉植株上乳酸菌的分離鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及特性研究[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(14): 112-118.

XI E G, TAN H S, YANG J S, CUI K P, ZHANG W C, JU X L, LI X L, ZHANG G H. Separation, identification, phylogenetic analysis and antibacterial activity offrom banana plants[J]. Food Science, 2018, 39(14): 112-118. (in Chinese)

[20] 楊東升, 羅先群, 王新廣. 香蕉酒嗜殺野生釀酒酵母的篩選[J]. 中國(guó)釀造, 2013, 32 (2): 57-60.

YANG D S, LUO X Q, WANG X G. Screening of killer yeast from wildin banana wine[J]. China brewing, 2013, 32(2): 57-60. (in Chinese)

[21] 崔坤鵬, 譚海生, 楊勁松, 郗恩光, 張萬(wàn)昌, 鞠雪莉, 李曉雷, 張桂和, 鄭元平, 蔡錦紅. 香蕉殘次果及香蕉花上乳酸菌的篩選鑒定[J]. 中國(guó)釀造, 2017, 36(7): 53-57.

CUI K P, TAN H S, YANG J S, XI E G, ZHANG W C, JU X L, LI X L, ZHANG G H, ZHENG Y P, CAI J H. Screening and identification of lactic acid bacteria from defective banana fruit and banana flower[J]. China Brewing, 2017, 36(7): 53-57. (in Chinese)

[22] 王福彬, 雒曉芳, 鄭青波, 劉傳麗, 羅 前, 朱 凱. 香蕉皮內(nèi)生細(xì)菌的分離純化及初步鑒定[J]. 西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2019, 40(2): 59-62.

WANG F B, LUO X F, ZHENG Q B, LIU C L, LUO Q, ZHU K. Isolation, purificationan and preliminary identification of endophytic bacteria from a banana skin[J]. Journal of Northwest Minzu University (Natural Science), 2019, 40(2): 59-62. (in Chinese)

[23] ROBLES A, FABJANOWICW M, CHMIEL T, PLOTKA W J. Determination and identification of organic acids in wine samples problems and challenges[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2019, 120: 115630.

[24] CHAI L L, DAVE S O W, STEVE K W O. Quantitative real-time polymerase chain reaction for determination of plasmid copy number in bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods, 2006(65): 258-267.

[25] LV X C, JIA R B, CHEN J B, ZHOU W B, LI Y, XU B X, LIANG Y T, LIU B, CHEN S J, TIAN Y T, RAO P F, LI N. Development of reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR) assays for monitoring,, andduring the traditional brewing of Hong Qu Glutinous rice wine[J]. Food Analytical Methods, 2017, 10(1): 161-171.

[26] 李 憑, 李 彤, 高瑩瑩, 張翠英. 葡萄汁酵母和植物乳桿菌混合發(fā)酵對(duì)葡萄酒發(fā)酵的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2019, 45(3): 138-142.

LI P, LI T, GAO Y Y, ZHANG C Y. Effects of co-fermentation ofandon wine brewing[J]. Food and Fermentation Industries, 2019, 45(3): 138-142. (in Chinese)

[27] 馬麗娜, 龔 霄, 殷俊偉, 林 茂, 林麗靜. 基于RP-HPLC法測(cè)定水果及其果酒中有機(jī)酸含量[J]. 食品工業(yè), 2018, 39(1): 328-330.

MA L N, GONG X, YIN J W, LIN M, LIN L J. Determination of organic acid in fruit and wine by RP-HPLC[J]. The Food Industry, 2018, 39(1): 328-330. (in Chinese)

[28] 李 華, 王 華, 袁春龍, 王樹生. 葡萄酒化學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2005: 95-96.

LI H, WANG H, YUAN C L, WANG S S. Wine chemistry[M]. Beijing: Science Press, 2005: 95-96. (in Chinese)

[29] 周兆禧, 趙家桔, 馬蔚紅, 臧小平, 何應(yīng)對(duì), 李敬陽(yáng), 蔡勝忠. 3個(gè)品種香蕉果實(shí)中糖酸組分及含量的比較分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2011, 32(8): 1453-1456.

ZHOU Z X, ZHAO J J, MA W H, ZANG X P, HE Y D, LI J Y, CAI S Z. The composition and contents of sugars and acids in three types of bananas[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2011, 32(8): 1453-1456. (in Chinese)

[30] ALEXANDRE H, COSTELLO P J, REMIZE F, GUZZO J, GUILLOUS B M.-interactions in wine: current knowledge and perspectives[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 93(2): 141–154.

[31] BONOMO M G, CAFARO C, GUERRIERI A, CRISPO F, MILELLA L, CALABRONE L. Flow cytometry and capillary electrophoresis analyses in ethanol-stressedstrains and changes assessment of membrane fatty acids composition[J]. Journal of Applied Microbiology, 2017, 122(6): 1615-1626.

[32] CAPUCHO I, ROMAO M V S. Effect of ethanol and fatty acids on malolactic activity of[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1994, 42: 391-395.

[33] FUGELSANG K C, EDWARDS C G. Wine microbiology: practical applications and procedures[M]. 2nd edition. New York, USA: Springer Science, Business Media LLC, 2007.

[34] HUANG Y C, EDWARDS C G, PETERSON J C, HAAG K M. Relationship between sluggish fermentations and the antagonism of yeast by lactic acid bacteria[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1996, 47(1): 1-10.

Characteristics of Lactic Acid Bacteria Colony Change and Organic Acid Metabolism During Inoculation and Spontaneous Fermentation of Banana Fruit Wine

YANG Ying1,2,3, DAN Xia2,3, GUAN Jingxi2,3, LI Jiemin1,2,3, HE Xuemei1,2,3, YE Dongqing1,2,3*, SUN Jian1,2,3*

1. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China; 2. Guangxi Key Laboratory of Fruit and Vegetables Storage-Processing Technology, Nanning, Guangxi 530007, China; 3. Guangxi Banana Preservation and Processing Research Center of Engineering Technology, Nanning, Guangxi 530007, China

Bananas, rich in nutritional and bioactive ingredients, can be used as remarkable raw materials for deep processing products in food industry. Banana wine is one of the important deep-processing products. During the fermentation process, high sugar and low acidity of banana juice is suitable for microorganisms growth, especially for lactic acid bacteria (LAB) growth which is closely related to the production of organic acids. The change of LAB community easily produces excessive volatile acid content during the fermentation process, leading to low-quality banana wine. Therefore, this study was to investigate the growth and reproduction pattern of naturally existing LAB, as well as to evaluate the effect of LAB on the organic acid metabolism during banana wine fermentation. The findings of this research could provide theoretical references for accurately managing fermentation process to promote banana wine quality. In this study, the commercial yeast K1 inoculated fermentation and the banana juice spontaneous fermentation (SF) were used as the fermentation processes. The colony changes of yeast and LAB in the fermentation processes were monitored by real-time PCR, and the changes of organic acid content in fermentation processes were also detected by high performance liquid chromatography (HPLC). The organic acid metabolism characteristics of LAB in the processes were comparatively studied as well. The results showed that the growth of yeast and LAB differed significantly in the fermentation processes. In the fermentation process using K1 yeast, the number of LAB community was significantly inhibited, and the maximum growth amount of LAB was only 4.0×106CFU/mL and the biomass of yeast was 1.2×107CFU/mL. In the banana juice spontaneous fermentation process, the growth cycles of LAB and yeast were not affected mutually, and the biomass of LAB and yeast was 1.0×107CFU/mL and 1.6×107CFU/mL, respectively. Both fermentation processes demonstrated that there was a competitive relationship between yeast and LAB in banana wine fermentation. Additionally, organic acid metabolism was mainly related to the number of LAB community, and the contents of different organic acids had the similar change trends in this study. During the fermentation processes, lactic acid content was increased, and acetic acid content was increased firstly and then decreased. However, the total lactic acid and acetic acid contents in the spontaneous fermentation were higher than those in the yeast K1 inoculated fermentation. The citric acid, malic acid and tartaric acid contents showed a decreasing trend during the two kinds of fermentation process.

lactic acid bacteria; colony change; organic acid metabolism; banana wine

S668.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.022

2022-01-17；

2022-04-18

廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB21220013）；廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD19110141）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（No. CARS-31）。

楊 瑩（1980—），女，碩士，副研究員，研究方向：亞熱帶水果釀造技術(shù)與發(fā)酵微生物。*通信作者（Corresponding author）：葉冬青（YE Dongqing），E-mail：yedongqing@gxaas.net；孫 ?。⊿UN Jian），E-mail：jiansun@gxaas.net。