3個不同木薯品種的代謝產(chǎn)物解析

吳金山，王思琦，耿夢婷，宋記明，黃家權(quán)，賈迎雪，張逸杰，張肖飛，陳銀華*

3個不同木薯品種的代謝產(chǎn)物解析

吳金山1,3，王思琦1，耿夢婷1，宋記明2，黃家權(quán)1，賈迎雪3，張逸杰1，張肖飛4，陳銀華1*

1. 海南大學熱帶作物學院，海南?？?570228；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所，云南保山 678000；3. 海南大學林學院，海南?？?570228；4. 國際熱帶農(nóng)業(yè)中心（CIAT），卡利A.A 6713

本研究以3種木薯品種（‘KU50’‘SC205’和‘SC9’）塊根為實驗材料，采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用非靶向代謝組學技術(shù)，對8月齡木薯塊莖的代謝物進行差異性分析。通過鑒定共獲得77個差異代謝物，主要涉及糖及其衍生物、氨基酸、有機酸等，‘KU50’和‘SC205’兩個品種的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物（相對含量>15%）均為蔗糖，且二者含量基本相當，‘SC9’的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物為蔗糖與果糖；‘SC9’中蔗糖、檸檬酸相對含量顯著低于‘KU50’和‘SC205’，但果糖、半乳糖、葡萄糖高于二者。利用主成分分析（PCA）發(fā)現(xiàn)，3個木薯品種塊根代謝物組成結(jié)構(gòu)差異性顯著，獲得差異顯著的33種代謝物中主要涉及糖類及其衍生物、有機酸及其衍生物、生物堿、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物等5個類別。通過GO、KEGG、通路富集分析共注釋到14個差異顯著性代謝途徑，其中，共有16個代謝物富集于氨酰tRNA生物合成途徑，9個富集于精氨酸和脯氨酸代謝途徑，3個富集于氰基氨基酸代謝途徑。本研究通過對3個木薯品種塊根代謝物的種類、相對含量、主要代謝物和顯著差異代謝物進行分析，闡明了不同木薯品種淀粉品質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)?？蔀楹笃诟玫剡M行木薯品種改良、品種選育及木薯食品加工提供參考。

木薯；代謝產(chǎn)物；代謝途徑；差異分析

木薯（Crantz），又稱南洋薯、木番薯、樹薯，為大戟科灌木狀多年生植物，是熱帶、亞熱帶地區(qū)主要的糧食作物[1-2]。主要用于生產(chǎn)以木薯淀粉為基礎(chǔ)的食品及生物能源，其深加工產(chǎn)品多達3000種[3]，是全球近10億人的日?？诩Z[4]，被稱為“淀粉之王”“特用作物”“地下糧倉”[5]，因此提高木薯淀粉含量一直是木薯栽培、育種研究中的核心問題。針對木薯淀粉合成機制，研究人員從基因水平、蛋白質(zhì)水平均進行了不同的探討[6-7]，而木薯淀粉品質(zhì)的不同也與各品種的蛋白質(zhì)和淀粉代謝有關(guān)[8]。

代謝組學能夠通過對某一生物或細胞在一特定生理時期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量分析[9]，考察生物體系在特定時期或受到刺激、擾動前后所有小分子代謝物的組成及其含量變化，從而表征生物體系的整體代謝特征，研究涉及微生物[10-11]、植物[12-13]及藥物[14-15]等方面，在食品安全、食品質(zhì)控、食品加工、食品溯源等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16-18]。

由于木薯在食品安全中的重要性，人們對木薯進行了大量的研究，以明確木薯中有益于人類的代謝物，從而開發(fā)更高營養(yǎng)價值的新品種。目前已經(jīng)建立了木薯初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物的化學篩選方法，主要是通過色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）[19]，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘（partial least squares，PLS）等統(tǒng)計學方法[20]，用于鑒定與木薯目的性狀相關(guān)的代謝產(chǎn)物。但相關(guān)的研究報道多集中于特定木薯品種基因?qū)用鎇21]及理化性質(zhì)[22-23]層面，鮮有文獻探討不同木薯品種間特別是與淀粉品質(zhì)相關(guān)代謝物的差異，以及在探究優(yōu)勢代謝物的生物學角色和代謝途徑方面的研究較為欠缺。

本研究主要以3個優(yōu)質(zhì)的木薯品種為實驗材料，3個木薯品種均具淀粉含量多、產(chǎn)量高等優(yōu)質(zhì)特性，尤其是‘SC9’的口感品質(zhì)比其他2個品種好。造成3個木薯不同的淀粉品質(zhì)特性是否與差異代謝物有密切聯(lián)系，為解決這一問題，本研究采用GC-MS的非靶向代謝組學，結(jié)合PCA、正交偏最小二乘判別（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等方法，差異分析3個不同木薯品種的代謝產(chǎn)物及各自優(yōu)勢代謝物，進一步探討優(yōu)勢代謝物的代謝途徑和富集通路，旨在全面鑒定具有不同淀粉品質(zhì)的木薯中代謝物的自然變異及相關(guān)的調(diào)控機制，為更好地進行木薯品種改良、品種選育奠定基礎(chǔ)，同時本研究結(jié)果也可為3個木薯品種深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯塊莖選自海南省儋州市海南大學農(nóng)科基地木薯種植資源圃3個品種‘KU50’‘SC205’‘SC9’，分別取相同種植條件下8個月齡木薯塊莖，然后進行剝皮、洗凈處理，于–80℃下保存，后續(xù)用于代謝產(chǎn)物的測定。實驗設(shè)3個生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取 精確稱量樣本25 mg于2 mL EP管中，準確加入1 mL甲醇∶氯仿∶2%乙酸（5∶2∶1，∶∶）混合溶液（–20℃），加入60 μL的核糖醇（0.2 mg/mL）作為內(nèi)標，加入100 mg玻璃珠[24-25]。放入高通量組織研磨儀中30 Hz震蕩2 min，12 000 r/min離心10 min，收集合并2次上清液并加入500 μL ddH2O，400 μL氯仿，渦旋振蕩1 min，12 000 r/min離心2 min，取上中層1100～1200 μL溶液用真空濃縮儀濃縮至盡干。進而加入40 μL甲氧基溶液渦旋振蕩30 s，30℃反應(yīng)1.5 h，最后加入80 μL BSTFA試劑（含1%三甲基氯硅烷），37℃條件下反應(yīng)30 min，12 000 r/min離心3 min，取上清液90～100 μL加入到檢測瓶中。每個待測樣本各取20 μL混合成 QC樣本（quality control，QC），用來校正混合樣品分析結(jié)果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤，用剩余待測樣本進行GC-MS檢測[26]。

1.2.2 樣品檢測 氣相色譜采用HP-5MS毛細管柱（5%苯/95%甲基聚硅氧烷30 m×250 μm i.d.，0.25 μm film thickness，Agilent J & W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA）以1 mL/min的恒流氦氣來分離衍生化物質(zhì)，1 μL樣品以分流比20∶1的方式通過自動進樣器注入。注射溫度為280℃，接口設(shè)置為150℃和離子源調(diào)整到230℃。升溫程序以60℃為初始溫度，持續(xù)2 min，以10 ℃/min的速率上升到300℃并停留5 min。質(zhì)譜范圍從35～750/，采用全掃描方法進行[27-28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過GC-MS光譜全波段掃描代謝物質(zhì)。通過Agilent MSD ChemStation工作站對原始數(shù)據(jù)進行特征提取，利用R（v3.1.3）的XCMS程序包得到包括質(zhì)核比（mass to charge ratio，m/z）、保留時間（retention time）及峰面積（intensity）等信息的數(shù)據(jù)矩陣[29]，導出數(shù)據(jù)至Excel 2010（標準品鑒定過的物質(zhì)標記為紅色字體），進而利用QC質(zhì)譜和樣本點PC1值的分布對項目的系統(tǒng)進行分析和評估。由圖1可知，在PCA圖中，QC樣本相對于實驗樣本點聚到一起，且QC誤差在2倍的標準偏差以內(nèi)，在離群點內(nèi)，說明本實驗的系統(tǒng)誤差在可控范圍內(nèi)，校正效果良好。進一步標準化處理如圖2所示，在標準化前，代謝物含量的中位數(shù)和上下四分位點參差不齊，差異較大，但標準化后，基本均位于同一個水平上，接近正態(tài)分布。

圖1 各樣本點PC1分布（A）和各樣本質(zhì)控PCA圖（B）

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝物分析

通過GC-MS法對3個品種進行分離鑒定，共注釋獲得了代謝物77個。為更直觀地比較各分組間代謝物組成結(jié)構(gòu)差異，對3個品種中的代謝物含量進行比較分析（圖3），位于前20的代謝物為蔗糖、果糖、半乳糖、肌醇、核糖醇、檸檬酸、葡萄糖、磷酸、焦谷氨酸、谷氨酸、L-谷氨酰胺、蘋果酸、L-絲氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、4-氨基丁酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、抗壞血酸、酪氨酸。在前20種代謝物中，糖及其衍生物、氨基酸、有機酸含量占比最高，其余代謝物被歸類到Others中。

如圖3所示，3個品種含量排前20的代謝產(chǎn)物中，‘KU50’‘SC205’含量較高（>10%）的代謝物均為蔗糖，‘SC9’含量較高（>10%）的代謝物為蔗糖、果糖、半乳糖。在相對含量中等（5%～10%）的代謝物中，‘KU50’有8種、‘SC205’有5種、‘SC9’有3種；在相對含量較低（5%）的代謝物中，‘KU50’有11種，‘SC205’‘SC9’均有14種。

‘KU50’和‘SC205’的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物均為蔗糖且二者在塊根中含量基本相當，‘SC9’為蔗糖和果糖；‘SC9’中的蔗糖、檸檬酸相對含量低于‘KU50’和‘SC205’的，但果糖、半乳糖、葡萄糖高于二者；‘SC9’中的果糖和葡萄糖相對含量高，可能是蔗糖水解產(chǎn)生或來自脂肪的轉(zhuǎn)化；葡萄糖、果糖、半乳糖是對人體比較重要的單糖，因此，口感頗好的‘SC9’是目前市場上食用的主推產(chǎn)品。

A：標準化校正前所有樣本中各個代謝物的含量分布；B：標準化校正后所有樣本中各個代謝物的含量分布；C：標準化校正前各個樣本中所有代謝物的含量分布；D：標準化校正后各個樣本中所有代謝物的含量分布。

圖3 3個木薯品種前20種代謝物名稱及含量

將獲得的所有代謝物用KEGG數(shù)據(jù)庫br08001進行注釋，得到代謝物所扮演的生物學角色，然后統(tǒng)計每個生物學角色的百分比含量。如表1所示，在3個品種中，扮演著特定角色的代謝物主要有碳水化合物、多肽、有機酸、維生素及輔助因子、脂類、核酸等。3個品種中，‘SC9’中的碳水化合物含量最高，為0.6594，但其余四類均低于二者；‘KU50’在多肽、維生素和輔酶因子方面均高于二者；而‘SC205’在有機酸、脂質(zhì)方面含量最高。但在核酸含量方面，‘SC205’和‘SC9’的含量相同。

表1 扮演生物學角色的代謝物含量

2.2 熱圖聚類圖分析

在樣品代謝物含量聚類分析中，不同分組的樣本聚類到不同位置，說明分組間代謝物組成結(jié)構(gòu)差異較大。如圖4所示，在‘SC9’樣品中，‘SC9B’和‘SC9C’相似性較近，‘SC9A’相對較遠；同樣在‘KU50’和‘SC205’樣品中，‘KU50A’和‘KU50B’相似性較近，‘KU50C’較遠，‘SC205B’和‘SC205C’相似性較近，‘SC205A’較遠。但3個品種間存在一定的差異，且差異顯著。

縱軸為樣品名稱信息，同時也包括了分組信息。橫軸為代謝物。圖中上方的聚類樹為代謝物在各樣本中分布的相似度聚類，左側(cè)的聚類樹為樣品聚類樹，中間的熱圖是代謝物含量熱圖，顏色與代謝物含量（Z-Score）的關(guān)系見圖右上方的刻度尺。

2.3 樣品PCA及代謝物的OPLS-DA分析

通過PCA分析，觀察各樣本間的總體分布趨勢。如圖5所示，圖中3個分組的點云（point cloud）明顯分布在不同區(qū)域，說明3個分組的代謝物組成結(jié)構(gòu)差異顯著。

為了篩選出組間不同的代謝物，對‘KU50’‘SC205’和‘SC9’3個品種數(shù)據(jù)進行處理，得到OPLS-DA評分后發(fā)現(xiàn)，不同分組樣本點云分布在不同區(qū)域，OPLS-DA模型能明顯區(qū)分3組樣本，各個成員組間存在顯著差異，且樣品成員組均位于置信時間內(nèi)。同時參數(shù) R2Y(cum)=1，Q2(cum)=0.979，R2Y和Q2均大于0.5并且接近于1，說明該模型的穩(wěn)定性比較好，且數(shù)據(jù)可靠。

圖5 PCA圖和PLS-DA點云圖

2.4 差異代謝物篩選及分析

本研究以VIP>1、<0.05為標準對3個品種進行差異代謝物篩選[13-14]。由圖6可知，黃色區(qū)域（右上角標注名稱處）是校正后<0.05，VIP>1的代謝物，共33種（表2）。主要包括糖類及其衍生物、有機酸及其衍生物、生物堿、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物等5個類別。此類代謝物在分組間差異顯著，在PLSDA分析中起重要作用，是重點關(guān)注的對象。

圖6 PLS-DA代謝物重要性圖

表2 PLS-DA中重要差異代謝物

續(xù)表2 PLS-DA中重要差異代謝物

Tab. 2 Important differential metabolites in PLS-DA (continued)

2.5 代謝通路及富集度分析

圖7為3組顯著差異代謝物KEGG富集圖。圖中每一個圖形都是一個KEGG路徑。橫坐標為富集倍數(shù)，即富集率，是代謝通路中觀測代謝物數(shù)/理論代謝物數(shù)比值，縱坐標表示路徑的名稱。值的大小用顏色表示，顏色越深，值越小。長方形越長代表富集到的物質(zhì)越多。通路富集分析可獲得38種差異代謝通路。

代謝物在某個通路中雖顯著富集，但不一定在該代謝通路中起關(guān)鍵作用。代謝物對代謝通路的影響，可通過拓撲分析計算關(guān)注的代謝物在代謝通路中的作用大小（用Impact衡量）。本研究通過拓撲分析發(fā)現(xiàn)，當<0.05時，共有14個通路存在顯著差異（表3）。其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑富集度和重要性均最大，分別為15.732和0.657，說明此代謝途徑在物質(zhì)代謝過程發(fā)揮著重要作用，此途徑共有8個代謝物參與；其次是TCA循環(huán)途徑、氨酰tRNA生物合成途徑、精氨酸和脯氨酸代謝途徑等。在14個途徑中，實際出現(xiàn)代謝物數(shù)最多的是氨酰tRNA生物合成途徑，為16個；其次是精氨酸和脯氨酸代謝途徑，為9個；最少的是氰基氨基酸代謝途徑，為3個。

圖7 ORA富集分析

表3 ORA富集分析和拓撲分析

3 結(jié)論

木薯是熱帶、亞熱帶地區(qū)主要的糧食作物。在我國，木薯主要用于淀粉和酒精加工。本研究選用3個木薯品種都具有淀粉含量多、產(chǎn)量高等優(yōu)質(zhì)特性，且‘SC9’的口感品質(zhì)好。3個品種淀粉品質(zhì)的不同可能與各品種的蛋白質(zhì)和淀粉代謝有關(guān)。鑒于此，本研究利用非靶向代謝組學的方法，對3個木薯品種的8月齡塊根的代謝產(chǎn)物進行系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木薯塊根中含有豐富的代謝產(chǎn)物。通過GC-MS的分離與鑒定，3個品種共注釋獲得77種代謝物。在3個品種的前20種代謝物中，糖及其衍生物、氨基酸、有機酸含量占比最高。其中‘KU50’和‘SC205’的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物（相對含量>15%）均為蔗糖且二者在塊根中含量基本相當，于前面所述二者具有淀粉含量多、產(chǎn)量高等特性相符?！甋C9’的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物主要為蔗糖與果糖，‘SC9’中的蔗糖、檸檬酸相對含量低于‘KU50’和‘SC205’，但果糖、半乳糖、葡萄糖高于二者；‘SC9’中的果糖與葡萄糖相對含量高，可能是蔗糖水解產(chǎn)生或來自脂肪的轉(zhuǎn)化，這與‘SC9’的口感品質(zhì)好有一定的關(guān)系。并且葡萄糖、果糖、半乳糖是對人體比較重要的單糖，因此口感頗好的‘SC9’是目前市場受歡迎的主要食用品種。

代謝組學分析可根據(jù)代謝物的相對含量對樣品進行比較分析，本研究以VIP>1.0作為檢測差異顯著代謝物的閾值，通過PCA及OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)，3個木薯品種塊根代謝物組成結(jié)構(gòu)差異顯著，包括糖類及其衍生物、有機酸及其衍生物、生物堿、核苷酸及其衍生物、氨基酸及其衍等5個類別共33種代謝物和木薯品種相關(guān)。通過KEGG路徑、通路富集分析發(fā)現(xiàn)這些代謝物共存在38種差異代謝通路，其中有14個通路存在顯著差異（<0.05），特別是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑的富集度和重要性均最高，分別為15.732和0.657，共有8個代謝物參與此途徑，這些代謝物主要是糖類、有機酸類和氨基酸類，這表明此代謝途徑可能在木薯物質(zhì)代謝過程發(fā)揮著重要作用。其次是TCA循環(huán)、氨酰tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝等途徑。在14個途徑中，實際出現(xiàn)代謝物數(shù)最多的是氨酰tRNA生物合成途徑，為16個；其次是精氨酸和脯氨酸代謝途徑，為9個；最少的是氰基氨基酸代謝途徑，為3個。不同木薯品種間具有較高的遺傳多樣性，通過對不同木薯品種代謝物差異分析，表明3個木薯品種可能含有不同的代謝物，尤其是糖類、氨基酸類化合物，未來需要進一步分析每個木薯品種的具體成分，可為后期更好的進行木薯品種改良、品種選育及木薯食品加工提供參考。

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Analysis of Metabolites of Three Different Cassava Varieties

WU Jinshan1,3, WANG Siqi1, GENG Mengting1, SONG Jiming2, HUANG Jiaquan1, JIA Yingxue3, ZHANG Yijie1, ZHANG Xiaofei4, CHEN Yinhua1*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Institute of Tropical and Subtropical Cash Crops, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Baoshan, Yunnan 678000, China; 3. College of Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 4. International Center for Tropical Agriculture (CIAT), Cali A.A 6713, Colombia

In this study, the root tubers of three cassava varieties (‘KU50’‘SC205’ and ‘SC9’) were used as the experimental materials. The metabolites of 8-month-old cassava tubers were analyzed by chromatography-mass spectrometry with non targeted metabolomics. A total of 77 differential metabolites were obtained through identification, mainly involving sugar and its derivatives, amino acids, organic acids, etc.. The dominant metabolites (relative content > 15%) of ‘KU50’ and ‘SC205’ were sucrose, and the contents were basically the same. The dominant metabolites for ‘SC9’ were sucrose and fructose. The relative contents of sucrose and citric acid in ‘SC9’ were significantly lower than those of ‘KU50’ and ‘SC205’, but the contents of fructose, galactose and glucose were higher than those of ‘KU50’ and ‘SC205’. Principal component analysis (PCA) found that there were significant differences in the composition and structure of root metabolites among the three cassava varieties. Among the 33 metabolites, there were mainly five categories, including sugars and the derivatives, organic acids and the derivatives, alkaloids, nucleotides and the derivatives, amino acids and the derivatives. A total of 14 metabolic pathways with significant differences were annotated through GO, KEGG and pathway enrichment analysis, of which 16 metabolites were enriched in aminoacyl tRNA biosynthesis pathway, nine in arginine and proline metabolism pathway and three in cyano amino acid metabolism pathway. By analyzing the types, relative contents, main metabolites and significantly different metabolites of root tubers of the varieties, this paper would enrich the material basis of starch quality formation of different cassava varieties and provide a reference for cassava variety improvement, variety breeding and cassava food processing in the later stage.

cassava; metabolites; metabolic pathway; difference analysis

S533

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.020

2022-02-25；

2022-04-15

國家木薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（No. CARS-11-HNCYH）；國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2018YFD1000500）。

吳金山（1984—），男，博士，副教授，研究方向：植物營養(yǎng)。*通信作者（Correponding author）：陳銀華（CHEN Yinhua），E-mail：yhchen@hainanu.edu.cn。