補(bǔ)陽還五湯對(duì)腦缺血/再灌注損傷大鼠皮質(zhì)區(qū)沉默信息調(diào)節(jié)因子1表達(dá)的影響

辛紫媛，靳曉飛，周曉紅，趙艷萌，劉真一，張彐寧，高維娟，

(1. 承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.河北中醫(yī)學(xué)院 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091)

補(bǔ)陽還五湯是治療缺血性腦卒中氣虛瘀證的代表方劑，最早記載于清朝王清任著《醫(yī)林改錯(cuò)·下卷·癱痿論》中，臨床療效確切，但其具體機(jī)制尚未明確[1]。腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)是缺血性腦卒中的重要病理過程，直接影響該病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸，其發(fā)生機(jī)制蘊(yùn)含著缺血性腦卒中的潛在治療靶點(diǎn)。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulation 1，SIRT1)是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴性Ⅲ類組蛋白去乙?；?，通過去乙酰化組蛋白和一些非組蛋白底物參與基因調(diào)控[2]。SIRT1在神經(jīng)退行性疾病和腦卒中等疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[3]。本研究旨在探討補(bǔ)陽還五湯對(duì)CIRI大鼠發(fā)揮保護(hù)作用時(shí)是否通過調(diào)節(jié)皮質(zhì)區(qū)SIRT1蛋白，以期進(jìn)一步挖掘補(bǔ)陽還五湯治療CIRI的作用機(jī)制，為臨床治療缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的7～8周齡健康♂ SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(250～280) g，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格依據(jù)中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制度倫理審查委員會(huì)關(guān)于《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的指導(dǎo)方針，于河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物補(bǔ)陽還五湯購自北京同仁堂藥店，其中包括黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、赤芍5 g、紅花3 g、地龍3 g、桃仁3 g、川芎3 g，水煎濃縮至100 mL，于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，? mL水煎液中含生藥量約為1.43 g。阿托伐他汀購自美國輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20051408。

1.3 主要試劑TTC 染液(G1017)、兔抗β-actin抗體(GB11001)、尼氏染液(G1036)均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；兔抗SIRT1抗體(#9475)購自Cell Signaling Technology公司；鼠抗SIRT1抗體(60303)購自Proteintech公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白酶抑制劑(P8340)購自Sigma公司；QuickBlockTM免疫染色封閉液(P0260)、含DAPI抗熒光淬滅封片液(P0131)購自碧云天生物；CY3-羊抗小鼠IgG抗體(BA1031)購自武漢博士德。

1.4 主要儀器MCAO 栓線(北京西濃科技有限公司)、腦切片模具(北京西濃科技有限公司)；組織包埋機(jī)(Leica)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica)、冰凍切片機(jī)(Leica)、顯微拍照系統(tǒng)(Leica)；蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)；Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀(Thermo)；FUSION FX5 Spectra多功能成像系統(tǒng)(Vilber)；PeriCam PSI激光散斑血流監(jiān)測視頻系統(tǒng)(Perimed)。

1.5 動(dòng)物模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組給藥健康 SD ♂ 大鼠，參照文獻(xiàn)[4]建立模型。模型組(MCAO/R)大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型缺血2 h后，再灌注72 h；補(bǔ)陽還五湯組(BYHWT)和陽性對(duì)照藥阿托伐他汀組(Atorvastatin)于造模后，根據(jù)人鼠等效劑量換算給予大鼠劑量為補(bǔ)陽還五湯14.3 g·kg-1·d-1，阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1，術(shù)后等待大鼠完全清醒后立即灌胃給藥，每24 h給藥1次，共3次。

1.6 腦血流監(jiān)測用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，剪開顱頂皮膚暴露前囟，均勻的將腦膜薄化，固定好探頭，在該區(qū)域不時(shí)滴加生理鹽水保持腦膜濕潤。應(yīng)用PeriCam PSI 激光散斑血流監(jiān)測視頻系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測大鼠缺血前、缺血中、缺血/再灌注后局部腦血流量變化，選取感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，以ROI值代表相應(yīng)區(qū)域內(nèi)微循環(huán)血流灌注量，計(jì)算缺血側(cè)局部腦血流量占基線水平的百分比。

1.7 神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分缺血2 h/再灌注72 h后，根據(jù) Zea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，采用盲法觀察大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分并記錄。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無神經(jīng)功能缺損的癥狀；1分，提尾時(shí)不能伸展對(duì)側(cè)前爪并內(nèi)旋；2分，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，爬行時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能行走或意識(shí)喪失。

1.8TTC染色測定腦梗死體積大鼠麻醉后迅速斷頭取出完整腦組織，-20 ℃冰箱中冷凍30 min，腦切片模具中制備2 mm的連續(xù)冠狀腦片，在TTC溶液中37 ℃避光浸染30 min，染色完成后放入10%中性福爾馬林固定液中固定24 h，腦組織連續(xù)冠狀切片按自后向前的順序擺放拍照，ImageJ軟件測定腦片白色缺血梗死區(qū)體積和紅色正常組織體積，計(jì)算梗死體積百分率。

1.9 尼氏染色觀察皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)厚度5 μm石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)尼氏染液染色2～5 min流水水洗，0.1 %的冰醋酸分化，脫水透明，稍干燥中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照，觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用ImageJ軟件計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量。

1.10 Western blot檢測皮質(zhì)區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)約60 μg提取總蛋白，按1 ∶10加入組織裂解液低溫勻漿，取上清液BCA法進(jìn)行蛋白定量；按4 ∶1加入5×loading buffer后100 ℃金屬浴10 min使蛋白變性；蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；室溫下在5%脫脂奶粉中封閉2 h，TBST洗膜后；滴加一抗SIRT1抗體(1 ∶1 000)及內(nèi)參抗β-actin(1 ∶2 000)抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后；加入二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后；ECL液顯色，使用VisionCapt軟件獲取圖像并分析，以β-actin為內(nèi)參照蛋白，通過分析目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的灰度比值，得出目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.11 免疫熒光染色檢測皮質(zhì)區(qū)SIRT1熒光表達(dá)厚度8 μm的冰凍切片用快速封閉液封閉15 min，滴加抗SIRT1抗體(1 ∶500) 4 ℃孵育過夜，TBST洗片；滴加CY3-羊抗小鼠IgG抗體(1 ∶100)，室溫避光孵育1 h，TBST洗片；滴加含DAPI抗熒光淬滅劑封片后，避光保存并在熒光顯微鏡下觀察拍照，觀察SIRT1蛋白表達(dá)位置以及熒光表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 腦血流量評(píng)價(jià)模型建立成功大鼠缺血前腦血流ROI值為基線值，插入線栓阻塞后ROI值呈現(xiàn)明顯的下降趨勢且降幅達(dá)到基線65%以上，恢復(fù)血液再灌注后ROI值明顯的上升趨勢超過80%以上，證明造模成功(Fig 1)。

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損的變化神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯示，與Sham組相比，MCAO/R組大鼠神經(jīng)功能缺損程度嚴(yán)重，神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.05)；與MCAO/R組相比，BYHWT組和Atorvastatin組大鼠神經(jīng)功能缺損程度減輕，評(píng)分明顯降低(P<0.05)(Fig 2)。

Fig 1 Cerebral blood flow monitoring

Fig 2 Neurological deficit score of rats in each group n=9)

2.3 各組大鼠腦梗死體積變化TTC染色顯示，與Sham組相比，MCAO/R組左側(cè)大鼠腦組織出現(xiàn)明顯白色梗死灶(P<0.05)；與MCAO/R組相比，BYHWT組和Atorvastatin組大鼠腦梗死體積明顯減小(P<0.05)(Fig 3)。

2.4 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷的變化尼氏染色顯示，Sham組大鼠神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、緊密，胞核清晰，尼氏體大、呈深藍(lán)色，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量豐富。與Sham組相比，MCAO/R組細(xì)胞損傷嚴(yán)重、排列不規(guī)整，細(xì)胞核碎裂、溶解呈空泡狀，尼氏體顏色變淺、解體甚至消失，部分神經(jīng)細(xì)胞丟失、數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與MCAO/R組相比，BYHWT組和Atorvastatin組細(xì)胞損傷均有所改善、形態(tài)較完整、排列較整齊，尼氏體又重新出現(xiàn)，完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05)(Fig 4)。

2.5 各組大鼠皮質(zhì)區(qū) SIRT1 蛋白表達(dá)的變化Western blot檢測顯示，與Sham組相比，MCAO/R組SIRT1蛋白表達(dá)下降(P<0.05)；與MCAO/R組相比，BYHWT組和Atorvastatin組可明顯提升SIRT1蛋白表達(dá)強(qiáng)度(P<0.05)(Fig 5)。

2.6 各組大鼠皮質(zhì)區(qū) SIRT1 熒光表達(dá)的變化免疫熒光檢測顯示，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光標(biāo)記，SIRT1為紅色熒光標(biāo)記，藍(lán)色熒光與紅色熒光部分重合，紅色熒光也可在藍(lán)色熒光周圍顯示，提示SIRT1在缺血側(cè)腦組織細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。缺血2 h/再灌注72 h后，與Sham組相比，MCAO/R組紅色熒光減少提示 SIRT1 表達(dá)下降，BYHWT和Atorvastatin組紅色熒光增強(qiáng)，提示可提升SIRT1表達(dá)(Fig 6)。

Fig 3 Cerebral infarction volume of rats in each group n=3)

3 討論

腦卒中是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見疾病之一，主要是由于高血壓、吸煙、糖尿病、血脂異常、不良飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)和肥胖等不良因素誘發(fā)，大約80%的腦卒中與缺血性腦卒中有關(guān)[5]。缺血性腦卒中可導(dǎo)致嚴(yán)重的腦功能障礙，具有較高的發(fā)病率、致殘率、復(fù)發(fā)率和死亡率，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[6]。臨床上主要通過溶栓和栓子切除術(shù)快速重建血液循環(huán)，成功地恢復(fù)血液灌注后進(jìn)一步加重?fù)p傷，導(dǎo)致 CIRI[7]。 CIRI 涉及一系列復(fù)雜的病理生理過程，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)能量衰竭、興奮性氨基酸毒性、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等多個(gè)環(huán)節(jié)參與該進(jìn)程[8]。治療急性缺血性腦卒中的關(guān)鍵是拯救圍繞在缺血性核心梗死區(qū)周圍的皮質(zhì)缺血半暗帶缺血腦組織，該區(qū)域沒有遭受不可逆損傷且可以恢復(fù)[9]。探索CIRI的致病機(jī)理和作用靶點(diǎn)對(duì)腦卒中的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后都發(fā)揮著重要的作用。

Fig 4 Morphological changes of cortical nerve cells in each group n=3)

Fig 5 SIRT1 protein expression in cortical area of rats in each group n=3)

翻譯后修飾在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，sirtuins是NAD+依賴性蛋白脫乙酰酶，隨著近年來對(duì)組蛋白基因修飾的深入研究，已經(jīng)證明了組蛋白去乙酰化與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[10]。1999年SIRT1在人類中被首次發(fā)現(xiàn)，是sirtuins蛋白家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，位于染色體10 q，在人類細(xì)菌中高度保守[11]?？啥ㄎ挥诩?xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中它促進(jìn)了細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的穿梭，通過多種信號(hào)和生存途徑參與機(jī)體調(diào)控[12]。腦組織缺血缺氧后，SIRT1作為能量調(diào)節(jié)的樞紐，利用輔酶NAD+去乙酰化靶蛋白，不僅在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞能量代謝方面發(fā)揮重要作用，而且在抗氧化應(yīng)激、減輕炎癥、抗細(xì)胞凋亡等方面也發(fā)揮著減輕腦組織缺血后再灌注損傷的作用[13]。

腦卒中在中醫(yī)被稱之為中風(fēng)，《內(nèi)經(jīng)》謂其“風(fēng)性善行而數(shù)變”，以吐沫身直、口噤筋急、舌強(qiáng)而不能言、手足不遂為主要病證，起病之急、發(fā)展之迅速[14]。經(jīng)典名方補(bǔ)陽還五湯主治證為氣虛血滯，脈絡(luò)瘀阻所致中風(fēng)，7種單味藥黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花和桃仁諸藥合用，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功效，全方具有氣旺則血行，活血不傷正的配伍特點(diǎn)[15]。已有研究表明，通過建立腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯含藥血清對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧糖剝奪再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用可能是通過調(diào)節(jié)SIRT1實(shí)現(xiàn)的[16]。補(bǔ)陽還五湯含藥血清可上調(diào)SIRT1表達(dá)，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)，進(jìn)而防止人血管平滑肌細(xì)胞的年齡相關(guān)遷移和侵襲[17]。補(bǔ)陽還五湯可靶向調(diào)節(jié)海馬區(qū)SIRT1 / VEGF通路促進(jìn)CIRI后血管新生[18]。

本研究建立MCAO大鼠模型缺血2 h/再灌注72 h，我們觀察到大鼠出現(xiàn)大面積腦梗死，伴隨明顯的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷，經(jīng)補(bǔ)陽還五湯治療后組織損傷明顯改善，觀察到皮質(zhì)SIRT1蛋白的表達(dá)明顯升高，提示補(bǔ)陽還五湯可能通過激活皮質(zhì)區(qū)SIRT1靶點(diǎn)進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用，其中補(bǔ)陽還五湯在CIRI中調(diào)節(jié)SIRT1的具體作用機(jī)制是我們課題組進(jìn)一步探討的方向。

Fig 6 SIRT1 fluorescence in cortical area of rats in each group (IF,×400)

Blue represented DAPI positive signal; red represented SIRT1 positive signal.