吲哚美辛通過NOS3影響線粒體呼吸鏈對非小細(xì)胞肺癌的機(jī)制

尚磊晶，孫盈盈，李元海

(1.安徽理工大學(xué)附屬淮南新華醫(yī)院麻醉科，安徽 淮南 232052；2.安徽省兒童醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230022；3．安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230032)

肺癌(lung cancer，LC)是全球范圍內(nèi)最常見的癌癥，并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。在過去的10年中，我們對肺癌的研究取得了突破性的進(jìn)展，尤其是肺癌相關(guān)基因的研究。但縱使如此，肺癌仍是導(dǎo)致癌癥死亡的首要因素。2018年，全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)估算，有大約290萬肺癌新發(fā)病例(占總腫瘤病例的11.6%)和176萬死亡病例(占總腫瘤死亡病例數(shù)的18.4%)，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2012年報道水平[1-2]。根據(jù)肺癌的分化程度和形態(tài)特征，將肺癌分成小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC中最多見的是鱗狀細(xì)胞癌，其次是腺癌，還有一些少見的病理類型，例如腺鱗癌、大細(xì)胞癌、肺泡細(xì)胞癌等。

肺癌患者會發(fā)生一系列身體和心理上的問題，包括咳嗽、呼吸困難、疼痛和焦慮等，疼痛是最嚴(yán)重的癥狀之一，并且嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。世界衛(wèi)生組織制定了癌痛三階梯鎮(zhèn)痛方案：第一階梯是使用非甾體抗炎藥物為主的鎮(zhèn)痛藥物；第二階梯是使用弱阿片類鎮(zhèn)痛藥物；第三階梯是使用強(qiáng)阿片類鎮(zhèn)痛藥物[3]。吲哚美辛則是屬于第一階梯鎮(zhèn)痛藥物，它是常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，有口服、涂抹、直腸給藥等多種給藥途徑，在臨床上有廣泛的用途。它是首批被批準(zhǔn)用于疼痛治療的非甾體抗炎藥物之一，目前被認(rèn)為是誘導(dǎo)早產(chǎn)兒動脈導(dǎo)管閉合的一線藥物，具有極高的安全性。此外，吲哚美辛在治療其他一些臨床疾病中也具有很好的療效，例如：腎臟痛和一些類型的頭痛，但吲哚美辛在晚期癌癥中的研究目前還是相對較少。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種氣體自由基遞質(zhì)，可調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生物學(xué)功能。它是一種簡單的氣體自由基，其主要功能是通過cGMP作為細(xì)胞信號通路中的信使。在哺乳動物中，NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)合成的，NOS有3種亞型，分別是神經(jīng)元中的NOS1(neuronal NO synthase，nNOS or NOS1)，可誘導(dǎo)的NOS2(inducible NO synthase，iNOS or NOS2)和內(nèi)皮細(xì)胞中的NOS3(endothelial NO synthase，eNOS or NOS3)。關(guān)于NOS3的研究，之前主要集中在心血管疾病發(fā)生發(fā)展及治療中的相關(guān)作用，NOS3表達(dá)異常和功能障礙與動脈粥樣硬化發(fā)展密切相關(guān)[4]。不僅如此，NOS3促進(jìn)生成的NO對預(yù)防糖尿病引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有著重要的意義[5]，但是NOS3在NSCLC中發(fā)揮著何種作用仍不清楚。

呼吸作用是生物最重要也是最基本的特征之一。線粒體參與多種重要的細(xì)胞活動，其中最為重要的是能量轉(zhuǎn)換。在很多癌癥中，由線粒體脫氧核糖核酸(mitochondrial deoxyribonucleic acid，mtDNA)突變引起線粒體呼吸鏈功能障礙導(dǎo)致電子泄露加劇，從而使自由基產(chǎn)生增加[6]。在大多數(shù)細(xì)胞中，線粒體復(fù)合物I和線粒體復(fù)合物III是細(xì)胞ROS的主要來源。在腫瘤細(xì)胞中，不斷產(chǎn)生的ROS作為信使刺激腫瘤細(xì)胞增殖，并作為內(nèi)源性DNA損傷因素，促進(jìn)遺傳變異和腫瘤的發(fā)展，因此，線粒體呼吸鏈在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過人源NSCLC細(xì)胞系NCI-H520、A549，使用不同濃度的吲哚美辛，探討吲哚美辛在NSCLC中發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 本實驗選用NSCLC細(xì)胞系NCI-H520、A549，由上海派通生物科學(xué)有限公司提供。

1.1.2試劑 吲哚美辛、L-NMMA(NOS3抑制劑)購自美國Selleck公司；胎牛血清購自澳洲Gibco公司；0.25%胰酶消化液購自北京碧云天公司；DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司； ATP5A、UQCRC2、SDH8、NDUFB8復(fù)合抗體(批號：ab110413)購自英國Abcam公司；β-actin(批號：bsm-33036m)購自中國博奧森公司；MitoTracker Red CMXRos探針、ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 使用含有10%的胎牛血清的DMEM/F12高糖培養(yǎng)液，將NCI-H520置于37 ℃，含有5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度至80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8實驗 將NSCLC細(xì)胞A549種植于96孔板，每孔接種約1×104個細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度吲哚美辛(0、5、10、20、50、 100 μmol·L-1)分別在0、12、24、48 h檢測細(xì)胞增殖能力。再將NCI-H520肺癌細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種約1×104個細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，加入不同濃度吲哚美辛(10、20、30 μmol·L-1)，測定吲哚美辛對NCI-H520的抑制作用。確定吲哚美辛作用濃度后將NCI-H520、A549肺癌細(xì)胞接種于96孔板，使用不同濃度的L-NMMA(50、100 μmol·L-1)處理吲哚美辛預(yù)處理后的NCI-H520、A549細(xì)胞系，再測定細(xì)胞存活率，另設(shè)DMSO對照組，每組設(shè)置6個復(fù)孔。孵育24 h后，每孔加入100 μL CCK-8溶液，置于孵育箱孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔吸光度值(OD值)，計算各實驗孔相對存活率。實驗重復(fù)3次。

1.2.3克隆形成實驗 取對數(shù)生長期NCI-H520細(xì)胞，以每孔約500個細(xì)胞接種于6孔板中，加入不同濃度的吲哚美辛(0、10、20、30 μmol·L-1)進(jìn)行處理，放置于孵育箱中培養(yǎng)14 d，其中每3 d更換1次培養(yǎng)基。4%多聚甲醛固定后，使用0.2%結(jié)晶紫染色后進(jìn)行拍照，每組設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.4Western blot實驗 將NSCLC細(xì)胞NCI-H520接種于直徑60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于孵育箱培養(yǎng)12 h后，加入20 μmol·L-1吲哚美辛孵育 24 h，另設(shè)對照組。24 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)皿，使用PBS沖洗2遍，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解10 min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，置于EP管中。加入1/4體積的5×SDS-PAGE，沸水水浴10 min。取蛋白量約為20 μg的樣品加入10% SDS-PAGE凝膠中電泳。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，在冰水中，電壓100 V，100 min，使用濕法轉(zhuǎn)膜方式將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，TBS洗滌3遍后，放置于已稀釋的一抗中，4 ℃搖床孵育過夜。d 2，經(jīng)TBS洗滌3遍后，置于二抗中，室溫孵育1 h，使用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，曝光后檢測各蛋白條帶的灰度值。

1.2.5免疫組化染色 組織樣品購自武漢賽維爾生物科技有限公司，組織芯片產(chǎn)品編號：IWLT-N-52LN93，其中肺腺癌6例，肺鱗癌26例，癌旁組織20例。取出石蠟切片，置于烘箱烘烤2 h，使用PBS沖洗3遍，再用二甲苯浸泡20 min，一共浸泡3遍。然后使用無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇分別浸泡10 min進(jìn)行水化。使用95 ℃檸檬酸鈉緩沖液浸泡10 min，PBS浸泡2次，每次5 min。然后使用10%山羊血清進(jìn)行封閉，置于濕盒室溫孵育1 h。隨后小心吸取封閉液，加入已稀釋好的一抗(NOS3 1 ∶200)，4 ℃孵育過夜。次日室溫復(fù)溫30 min后，使用PBS洗滌3遍，每遍10 min，隨后，使用3%的H2O2避光孵育15 min，再使用PBS洗滌3遍，每遍5 min。使用已稀釋二抗室溫孵育1 h后，使用DAB染色，置于流動的自來水沖洗2 min進(jìn)行終止，再用蘇木素進(jìn)行復(fù)染。將玻片置于1%氨水中進(jìn)行返藍(lán)，再置于自來水沖洗2 min。最后使用二甲苯進(jìn)行透明化5 min，封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。由于使用ImageJ plus無法精確區(qū)分肺泡和腫瘤組織界限，故采用人工打分方式，綜合芯片結(jié)果，能夠明顯發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平區(qū)別，因此未定量。

1.2.6生物信息學(xué)分析 本實驗使用STRING網(wǎng)站對吲哚美辛配體進(jìn)行預(yù)測，結(jié)合分?jǐn)?shù)>0.8有意義；使用Discovery Studio模擬吲哚美辛與NOS3結(jié)合；通過GEPIA網(wǎng)站分析腫瘤和癌旁組織NOS3 mRNA表達(dá)水平、腫瘤切除術(shù)后NOS3 mRNA水平和遠(yuǎn)期生存率之間關(guān)系；通過LinkedOmics分析與NOS3富集的基因；使用KEGG分析與NOS3相關(guān)的通路。

1.2.7線粒體ROS水平 本實驗使用MitoTracker Red CMXRos探針，將探針使用DMSO配置為1 mmol·L-1的儲存液，加入處理后的肺癌細(xì)胞中，工作液濃度為100 nmol·L-1，孵育30 min。使用新鮮培養(yǎng)基洗去染色液，4%多聚甲醛固定后使用0.2%的Triton X-100進(jìn)行透化，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.2.8透射電鏡 取5 μL處理后的細(xì)胞懸液，置于銅網(wǎng)，使用2.5%的戊二醛溶液固定后加入3%的磷鎢酸室溫復(fù)染5 min，吸取多余復(fù)染液，純水洗滌3次，每次2 min，室溫干燥，使用電鏡拍攝照片。

2 結(jié)果

2.1 吲哚美辛通過NOS3抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖通過CCK-8實驗(Fig 1A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于對照組，20 μmol·L-1的吲哚美辛作用24 h即可抑制NSCLC細(xì)胞A549增殖(P<0.05)，在48 h處理組中，發(fā)現(xiàn)吲哚美辛的抑制作用更穩(wěn)定且十分明顯。通過CCK-8、克隆形成實驗(Fig 1B、C)實驗發(fā)現(xiàn)，在NSCLC細(xì)胞NCI-H520中，20 μmol·L-1的吲哚美辛也具有抗癌作用以及抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成能力。通過STRING網(wǎng)站預(yù)測吲哚美辛受體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOS3與吲哚美辛有較高的結(jié)合分?jǐn)?shù)(>0.98；Fig 1D、1E)。然后通過Discovery Studio進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在NOS3蛋白內(nèi)側(cè)，存在吲哚美辛的結(jié)合域(Fig 1F)。于是我們使用了NOS3抑制劑L-NMMA進(jìn)行處理，結(jié)果表明，在A549和NCI-H520 NSCLC細(xì)胞系中，相較于吲哚美辛處理組，50 μmol·L-1L-NMMA均可以逆轉(zhuǎn)吲哚美辛引起的NSCLC細(xì)胞死亡(Fig 1G)(P<0.01)。以上實驗表明，吲哚美辛抑制NSCLC細(xì)胞增殖，并且其抑癌作用與NOS3的活化相關(guān)。

2.2 吲哚美辛的作用靶點分析通過GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，相較于癌旁組織，NSCLC中NOS3 mRNA水平明顯降低(Fig 2A)(P<0.05)。在切除病灶后，NOS3高表達(dá)的患者遠(yuǎn)期生存率較高(Fig 2B)。我們對NSCLC病患者的樣本進(jìn)行免疫組化染色，比較癌旁組織和NSCLC組織的NOS3表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織的NOS3水平明顯低于癌旁組織(Fig 2C)。以上結(jié)果表明，NOS3在NSCLC的發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用。

2.3 NOS3與線粒體呼吸鏈高度負(fù)相關(guān)通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析，NOS3可以富集20 103個基因(Fig 3A、B)。然后我們對NOS3富集得到的基因進(jìn)行KEGG分析，發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈功能調(diào)控通路與NOS3有較高的負(fù)相關(guān)系數(shù)(Fig 3C、D)，因此我們考慮NOS3可能通過抑制線粒體呼吸鏈來發(fā)揮抑癌作用。

2.4 吲哚美辛抑制線粒體呼吸鏈活性為了檢測線粒體功能，我們首先檢測了線粒體ROS改變，通過MitoTracker Red CMXRos探針，結(jié)果顯示相較于對照組，吲哚美辛處理組線粒體ROS明顯增多(Fig 4A、B，P<0.01)，接下來我們通過透射電鏡直觀的觀察線粒體的形態(tài)，結(jié)果提示吲哚美辛處理組線粒體數(shù)量減少、形態(tài)腫脹變形、內(nèi)嵴消失(Fig 4C)。最后我們檢測了ATP5A、UQCRC2、SDH8、NDUFB8四個線粒體復(fù)合物核心蛋白，通過Western blot實驗，我們發(fā)現(xiàn)在20 μmol·L-1吲哚美辛作用下，相較于對照組，吲哚美辛處理組UQCRC2蛋白水平發(fā)生了明顯的降低(Fig 4D)(P<0.01)，但ATP5A、SDH8、NDUFB8蛋白水平?jīng)]有發(fā)生明顯改變。這提示吲哚美辛可能通過UQCRC2影響線粒體呼吸鏈功能。

3 討論

肺癌是世界上最常見、最致命的腫瘤之一，中國是世界上肺癌患者最多的國家之一，雖然肺癌治療取得了極大的進(jìn)展，但肺癌患者的生存率仍不容樂觀。約有80%的肺癌患者患有肺鱗狀細(xì)胞癌，且在確診時已經(jīng)是晚期，并伴有轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良[7]。因此，如何改善這類患者的生存質(zhì)量是一個很值得探討的問題。吲哚美辛是臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，之前很多研究表明，吲哚美辛不僅具有良好的解熱鎮(zhèn)痛效果，還具有一定的抗癌作用。在前列腺癌中，吲哚美辛激活未折疊蛋白反應(yīng)和凋亡通路，促進(jìn)p53蛋白表達(dá)，并抑制細(xì)胞周期、Myc基因表達(dá)和AR/ARV7通路[8]。在結(jié)直腸癌中，吲哚美辛可降低炎癥因子水平，激活凋亡通路從而發(fā)揮抑癌作用[9]。不僅如此，負(fù)載阿霉素的吲哚美辛二聚體納米顆粒在耐藥乳腺癌可發(fā)揮抑癌作用[10]。然而，吲哚美辛在NSCLC中的作用，目前的研究甚少，而它卻是肺癌中常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物。

Fig 1 Indomethacin inhibited proliferation of non-small cell lung cancer cells by

Fig 2 Drug target analysis of indomethacin

Fig 3 NOS3 was closely associated with mitochondrial respiratory chain

本實驗采用人源NSCLC細(xì)胞系NCI-H520和A549，在不同的時間點使用不同的吲哚美辛濃度，發(fā)現(xiàn)20 μmol·L-1的吲哚美辛即可發(fā)揮抑癌作用。這一濃度遠(yuǎn)低于臨床使用血藥濃度，不會產(chǎn)生明顯副作用。為了進(jìn)一步探討吲哚美辛抑癌作用的機(jī)制，我們使用了分子靶向?qū)蛹夹g(shù)，分析發(fā)現(xiàn)NOS3與吲哚美辛關(guān)系密切，并且使用了L-NMMA(NOS3抑制劑)驗證了這一靶點。NOS3是一個比較有爭議的分子，有研究指出NOS3能夠參與NO的生成，而NO對腫瘤的進(jìn)程有著重要的影響[11-12]。本研究對NOS3進(jìn)行了進(jìn)一步的探究，通過公共數(shù)據(jù)庫GEPIA分析發(fā)現(xiàn)，相較于正常人，NSCLC患者NOS3 mRNA水平明顯降低。不僅如此，在病灶切除后，NOS3高表達(dá)的患者遠(yuǎn)期生存率更高。對患者樣本進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)相較于癌旁組織，NSCLC組織中的NOS3蛋白水平明顯減少。這一系列的結(jié)果提示，NOS3可以抑制非小細(xì)胞NSCLC的進(jìn)展，并且是吲哚美辛發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵靶點。接下來我們進(jìn)一步探究NOS3是通過何種途徑發(fā)揮抑癌作用，通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈在其中的作用最為重要。為了驗證這一結(jié)果，我們檢測了吲哚美辛作用后線粒體ROS水平、線粒體形態(tài)，而這些結(jié)果也與我們預(yù)想的結(jié)果一致。線粒體呼吸鏈核心蛋白水平是體現(xiàn)線粒體功能的一個重要指標(biāo)，我們通過Western blot檢測在吲哚美辛處理后線粒體呼吸鏈核心蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于未處理組，吲哚美辛處理組UQCRC2蛋白表達(dá)明顯降低，而其他蛋白的表達(dá)量沒有明顯的變化，所以我們認(rèn)為吲哚美辛發(fā)揮抑癌作用是通過NOS3抑制UQCRC2蛋白表達(dá)從而抑制線粒體呼吸鏈。

線粒體是重要的細(xì)胞器，控制著細(xì)胞存活和死亡，越來越多的證據(jù)表明，線粒體代謝和功能在腫瘤的發(fā)展和進(jìn)程中必不可少，這使線粒體及其功能成為抗腫瘤的熱門靶點。線粒體呼吸鏈由5種復(fù)合物(I-V)組成，它們傳遞電子并參與氧化還原反應(yīng)。天然化合物帕普胺被證明可以抑制NSCLC細(xì)胞的ATP生成、引起線粒體功能障礙、消耗細(xì)胞內(nèi)ATP和增加線粒體超氧化物合成[13]，從而誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡。UQCRC2是線粒體復(fù)合體III重要組成亞基。它可以通過微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)/UQCRC2軸調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[14]。此外，在膠質(zhì)瘤中，鈣黏蛋白18(cadherin 18，CDH18)通過UQCRC2抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性并改變患者預(yù)后[15]。我們首次發(fā)現(xiàn)在NSCLC中，NOS3可以通過影響線粒體呼吸鏈發(fā)揮抑癌作用，它通過抑制NSCLC細(xì)胞線粒體中UQCRC2來發(fā)揮抑癌作用。有報道指出許多線粒體呼吸鏈抑制劑，例如二甲雙胍、α-生育酚琥珀酸酯和3-溴丙酮酸酯等都可以通過破壞線粒體呼吸鏈復(fù)合物功能來殺死癌細(xì)胞[16-17]，這也與我們的研究相一致。

Fig 4 Indomethacin inhibited activity of mitochondrial respiratory

綜上所述，吲哚美辛在人源NSCLC細(xì)胞NCI-H520以及A549中發(fā)揮著抑癌作用，其作用機(jī)制與調(diào)控NOS3水平，抑制線粒體呼吸鏈有關(guān)。臨床上晚期NSCLC患者眾多，而吲哚美辛作為常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物應(yīng)用十分廣泛，本研究從麻醉疼痛科醫(yī)師和外科醫(yī)師角度，在多種鎮(zhèn)痛藥物中希望選擇一個相對具有優(yōu)勢的鎮(zhèn)痛藥物，不僅可以減緩疼痛，還具有一定的抗癌作用，為晚期NSCLC患者的臨床鎮(zhèn)痛藥物選擇提供了新的用藥思路。

(致謝：本實驗在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科實驗室完成，感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)