袋鼠源隱孢子蟲分離株分子鑒定與種系發(fā)育關系分析*

衡昭君，馬 洲，董星和，程文杰，鄒豐才，黃翠琴，賀君君，楊建發(fā)

(1.云南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；2.保山市動物衛(wèi)生監(jiān)督所 云南 保山 678000；3.龍巖學院生命科學學院，福建省家畜傳染病防治與生物技術重點實驗室，福建 龍巖 364000)

隱孢子蟲 (Cryptosporidiumspp.) 是重要的人獸共患原蟲之一，其宿主范圍廣泛，可感染包括人在內(nèi)的260 種脊椎動物[1]。人類感染隱孢子蟲后，主要癥狀為腹瀉，目前已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)列為人類最常見的6 種腹瀉病之一[2]，同時也是繼輪狀病毒后引起兒童嚴重腹瀉的第二大病原體[3]。隱孢子蟲屬已報道有40 多個種和70 多種基因型[4-5]，其中人可感染的隱孢子蟲蟲種有微小隱孢子蟲 (C.parvum)、人隱孢子蟲 (C.hominis)、鼠隱孢子蟲(C.muris)、安氏隱孢子蟲 (C.andersoni)、貓隱孢子蟲 (C.felis)、犬隱孢子蟲 (C.canis)、火雞隱孢子蟲 (C.meleagridis) 和豬隱孢子蟲 (C.suis) 等[6]，且多為在野生動物上鑒定出的人獸共患隱孢子蟲[7]。隱孢子蟲主要通過受污染的水源和食物等途徑傳播[8]，已在全球范圍內(nèi)引發(fā)多起食源性和水源性隱孢子蟲病的暴發(fā)[9-11]。

在國內(nèi)，王利勤等[12]對成都動物園圈養(yǎng)野生動物隱孢子蟲感染情況進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲總感染率為4.19%；宋源等[7]對貴陽動物園圈養(yǎng)野生動物隱孢子蟲的感染流行情況進行調(diào)查，結果從該園野生動物體內(nèi)鑒定出安氏隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、人隱孢子蟲和鼠隱孢子蟲等4 種隱孢子蟲，均為人獸共患隱孢子蟲蟲種，該園隱孢子蟲總體感染率達15.50%?？梢姡瑢游飯@野生動物進行隱孢子蟲檢測具有重要的公共衛(wèi)生意義。前期國內(nèi)對于野生動物寄生蟲的研究多基于傳統(tǒng)的形態(tài)學方法，通過顯微鏡觀察形態(tài)對分離到的蟲株進行鑒定，隨著野生動物對寄生蟲的感染和傳播問題的加重，中國開始注重對動物園野生動物腸道原蟲進行檢測，但目前仍缺乏有關袋鼠源隱孢子蟲所屬的基因型背景資料。本研究通過巢氏PCR 技術擴增對云南某動物園袋鼠源隱孢子蟲分離株的18S rRNA 基因序列進行分析，通過構建系統(tǒng)進化樹對該隱孢子蟲分離株的種類進行鑒定，以期為深入研究袋鼠源隱孢子蟲提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟲株

對云南某動物園進行寄生蟲感染調(diào)查時，從袋鼠糞樣中獲得蟲株樣品，將其保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 糞樣處理

取適量樣品于燒杯中，加入清水攪拌均勻，用60 目銅篩過濾于50 mL 離心管中；用高速臺式離心機 (Model CF-10，Wise Spin 公司生產(chǎn)) 以3 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，保留沉淀并將其振蕩混勻；吸取沉淀250 μL 于2 mL 離心管中，按照OMEGA 糞樣DNA 提取試劑盒 (EZNAR stool DNA Kit 試劑盒，USA 生產(chǎn)) 說明書進行DNA 提取，將獲得的DNA 置于4 ℃保存，備用。

1.3 PCR 擴增

基于小核糖體核苷酸 (18S rRNA) 基因進行巢式PCR 擴增，引物序列按照XIAO 等[13]設計的引物合成。第1 輪引物：上游5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′，下游5′-CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3′，擴增產(chǎn)物片段為1 325 bp；第2 輪 引 物：上 游5′-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3′，下游5′-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3′，擴增產(chǎn)物片段約為830 bp。反應體系包括：dNTP 2.00 μL，MgCl22.00 μL，10×PCR Buffer (Mg2+free) 2.50 μL，r-TaqDNA 聚合酶0.25 μL，上、下游引物各0.25 μL，DNA 模板2.00 μL，最后添加滅菌雙蒸水至25.00 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；第2 輪反應退火溫度為58 ℃。

1.4 PCR 產(chǎn)物鑒定和測序

將第2 輪PCR 產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳并鑒定，電泳完成后取凝膠放置在紫外凝膠成像分析儀 (WGD-30，BAYGENE 公司生產(chǎn))中觀察，若結果出現(xiàn)目的片段大小則將該PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物技術有限公司進行雙向測序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將本研究獲得的基因序列在GenBank 上進行BLAST 搜索，下載不同種隱孢子蟲分離株的基因序列，使用DNAMAN 和MEGA 7.0 等軟件將本研究獲得的序列與其他種隱孢子蟲進行同源性比較和系統(tǒng)進化樹分析；用MEGA 7.0 軟件、以鄰接法 (neighbor-joining，NJ) 中的Kimura-2-parameter 模型自展值檢驗 (Bootstrap test) 估計所構建基因樹的可靠性，并用1 000 個重復。本研究中，節(jié)點支持值低于50%的進行隱藏，支持值大于95%的則認為Bootstrap 分析顯著。

2 結果與分析

2.1 PCR 產(chǎn)物測序結果

隱孢子蟲18S rRNA 基因引物成功擴增出袋鼠源隱孢子蟲陽性目的條帶，長約823 bp，與預期大小一致(圖1)。

圖1 袋鼠源隱孢子蟲18S rRNA 基因PCR 擴增產(chǎn)物的檢測Fig.1 Detection of Cryptosporidium 18S rRNA PCR amplification products

2.2 袋鼠源隱孢子蟲分離株18S rRNA 基因序列的同源性分析

由圖2 可知：在18S rRNA 基因位點，袋鼠源隱孢子分離株KMK1 與已報道的中國猴源鼠隱孢子蟲 (登錄號：GU319782)、華盛頓駱駝源鼠隱孢子蟲 (登錄號：AF093497) 和日本褐家鼠鼠隱孢子蟲 (登錄號：AB089284) 無堿基差異，序列相似度為100%，且該袋鼠源隱孢子蟲與鼠隱孢子蟲的序列同源性最高。

圖2 基于18S rRNA 基因的袋鼠源隱孢子蟲分離株（KMK1）與其他源隱孢子蟲同源性比較Fig.2 Homology comparison of Cryptosporidium kangaroo isolate (KMK1) based on 18S rRNA gene with other Cryptosporidium sources

2.3 基于18S rRNA 基因序列的種系發(fā)育分析

由圖3 可知：種系發(fā)育樹形成2 個主要大分支，上半部分支為腸道寄生的隱孢子蟲，包括維瑞隱孢子蟲、人隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、火雞隱孢子蟲、豬隱孢子蟲、犬隱孢子蟲、貓隱孢子蟲、牛隱孢子蟲、芮氏隱孢子蟲和鹿隱孢子蟲基因型 ；另一分支則是胃寄生隱孢子蟲，包括龜隱孢子蟲、蛇隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲、鼠隱孢子蟲和本研究分離得到的袋鼠源隱孢子蟲分離株KMK1。KMK1 與鼠隱孢子蟲處于同一進化分支，親緣關系最近，節(jié)點支持值顯著 (96%)，屬于胃寄生隱孢子蟲中的鼠隱孢子蟲。

圖3 基于鄰接法構建的隱孢子蟲18S rRNA 基因核苷酸序列種系發(fā)育進化樹Fig.3 Evolutionary relationships among Cryptosporidium inferred by neighbor-joining analysis of 18S rRNA nucleotide sequences

3 討論

隱孢子蟲主要寄生于人或其他動物胃腸道和呼吸道上皮細胞中，感染后能引起人獸共患隱孢子蟲病。1907 年TYZZER[14]首次從試驗小鼠體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)該蟲，至今包括禽類、哺乳類、爬行類和兩棲類等幾乎所有脊椎動物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有隱孢子蟲感染。目前，隱孢子蟲屬已報道40 多個種和70 多種基因型[4-5]，且已經(jīng)在人類中檢測到至少20 個種和5 種基因型[15-16]。隱孢子蟲種類繁多，卵囊較小，不同蟲種之間形態(tài)相似，傳統(tǒng)的顯微鏡觀察法難以通過形態(tài)進行準確鑒定。隨著分子生物學技術的發(fā)展，越來越多的學者開始使用分子生物學方法鑒定隱孢子蟲蟲種。目前用于隱孢子蟲分類的基因主要有核糖體小亞基RNA(18S rRNA)、卵囊壁蛋白 (COWP)、70 ku 熱休克蛋白 (HSP70) 和肌動蛋白 (Actin) 等基因位點[17]。其中，18S rRNA 基因位點具有多拷貝特性，存在可用于構建系統(tǒng)進化樹的保守區(qū)和區(qū)別物種的多態(tài)性區(qū)域，能夠設計特異性引物，已被廣泛應用于人、其他動物和水源性隱孢子蟲的蟲種鑒定和基因分型研究[18]。本研究依據(jù)XIAO等[13]報道的隱孢子蟲18S rRNA 基因引物對袋鼠源隱孢子蟲陽性樣品DNA 進行擴增，獲得了長約823 bp 的目的片段，測序獲得的袋鼠源隱孢子蟲基因序列經(jīng)BLAST 在線比對后發(fā)現(xiàn)其與鼠隱孢子蟲(C.muris，GU319782、AF093497 和AB089284) 無差異堿基，同源性高達到100%。同時，從種系發(fā)育進化樹中也可以看出，本研究的分離株和鼠隱孢子蟲親緣關系最近，處于同一進化分支。綜上所述，該袋鼠源隱孢子蟲分離株鑒定為鼠隱孢子蟲(C.muris)。

研究表明：野生動物在將疾病向人類傳播的過程中扮演了重要角色[19-20]，而動物園中的野生動物因其與人類接觸更頻繁，所以將傳染病如寄生蟲等傳播給人類的可能性更大[21]，因此，研究野生動物和動物園圈養(yǎng)動物體內(nèi)的人獸共患寄生蟲具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前，隱孢子蟲在野生動物中的發(fā)現(xiàn)和報道越來越多，已成為常見寄生蟲種之一。據(jù)MICHELLE[22]統(tǒng)計：袋鼠可以感染多種隱孢子蟲，隱孢子蟲卵囊已經(jīng)在16 種有袋動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，主要檢測出費氏隱孢子蟲(C.fayeri)、袋鼠隱孢子蟲 (C.macropodum)、鼠隱孢子蟲 (C.muris)以及負鼠隱孢子蟲基因型(Opossum genotypes I、Opossum genotypes II、Brushtail possum genotypes I 和Brushtail possum genotypes II)，其中費氏隱孢子蟲和鼠隱孢子蟲具有人獸共患性，可廣泛存在于家養(yǎng)動物和野生動物中[19]。鼠隱孢子蟲可感染人、鼠、巖貍、雙峰駝、野生白山羊、犬、貓、狗、猴和豬等多種哺乳動物。在中國，已有很多對動物園野生動物寄生蟲的調(diào)查，但多基于常規(guī)的顯微鏡檢測，且對于袋鼠相關疾病的研究較少，尚未有袋鼠感染鼠隱孢子蟲的報道。本研究通過PCR 方法檢測發(fā)現(xiàn)：云南某動物園中一袋鼠源隱孢子蟲蟲種為鼠隱孢子蟲，不僅提示了袋鼠具有傳播人獸共患隱孢子蟲的潛在風險，也豐富了中國袋鼠可感染隱孢子蟲種類，為中國袋鼠源隱孢子蟲流行病學研究提供了基礎資料。在今后的研究中可進一步擴大檢測樣本的數(shù)量和地區(qū)，以進一步確定袋鼠源隱孢子蟲的感染情況、種系發(fā)育和人獸共患風險。

4 結論

本研究從云南某動物園袋鼠中分離到的1 株隱孢子蟲分離株KMK1 與先前報道的鼠隱孢子蟲(C.muris) 同源性達 100%，且在種系發(fā)育進化樹中也與鼠隱孢子蟲處于同一小分支，Bootstrap 分析顯著，表明該袋鼠源隱孢子蟲分離株為鼠隱孢子蟲。鼠隱孢子蟲屬于人獸共患寄生蟲，說明云南地區(qū)袋鼠具有潛在傳播人獸共患隱孢子蟲的風險。