HT29 和HCT116 結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及其裸鼠移植成瘤研究*

王 霞，朱飛艷，王 晶，熊 喆，韋云芳，李 彬，魏紅江，趙紅業(yè)

(1.大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；2.云南省動(dòng)物基因編輯與體細(xì)胞克隆技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；3.云南省異種器官移植工程研究中心，云南 昆明 650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

根據(jù)國(guó)家癌癥中心公布的數(shù)據(jù)，近年來結(jié)直腸癌新發(fā)病例和死亡病例居高不下[1]。結(jié)直腸癌早期生存率高但隱匿性強(qiáng)，因此早期診斷至關(guān)重要[2-3]。結(jié)直腸癌的治療主要是手術(shù)切除加藥物治療，病灶切除后，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性大，晚期患者只能接受化療，但副作用很大[4]。在結(jié)直腸癌治療方案的研究中，動(dòng)物試驗(yàn)在體外研究結(jié)果向體內(nèi)研究轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要的橋梁作用。由于生物學(xué)的相似性和重復(fù)性等特點(diǎn)，高質(zhì)量動(dòng)物模型的建立為腫瘤的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防及藥物研發(fā)提供了客觀可靠的平臺(tái)。目前，建立的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型主要以小鼠(免疫缺陷)為試驗(yàn)動(dòng)物，通過化學(xué)誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)基因和移植等3 種方式獲得腫瘤模型[5]。化學(xué)誘導(dǎo)的腫瘤模型生長(zhǎng)緩慢，腫瘤細(xì)胞增殖率低，誘導(dǎo)過程所需時(shí)間較長(zhǎng)，且個(gè)體差異較大；轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型通過改變基因組的表達(dá)而建立，成瘤率及轉(zhuǎn)移率較低，試驗(yàn)時(shí)間較久，在試驗(yàn)研究中應(yīng)用尚少；移植模型操作簡(jiǎn)單，成功率高，重復(fù)性好[6]。皮下腫瘤移植是把體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞移植到小鼠的皮下部位從而建立動(dòng)物模型，該方法操作簡(jiǎn)單、成瘤率高、應(yīng)用廣泛[7-8]。由于裸鼠的免疫缺陷性，它不排斥移植源于異種動(dòng)物的細(xì)胞或組織；此外，由于其可以保留原發(fā)腫瘤本身的遺傳性和形態(tài)特征[9]，故具有較強(qiáng)的生物學(xué)相似性和較高的重復(fù)性。

HT29 和HCT116 細(xì)胞同為人結(jié)直腸癌細(xì)胞。已有研究得到HCT116 細(xì)胞系小鼠皮下移植瘤[10]；在裸鼠爪墊皮下部位注射可獲得人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞系轉(zhuǎn)移模型[11]；將結(jié)直腸癌細(xì)胞接種于裸鼠左側(cè)腋窩皮下可獲得人結(jié)直腸癌的裸鼠皮下移植瘤模型[12]。皮下生長(zhǎng)的腫瘤通常易被纖維膜所包繞，故不易表現(xiàn)惡性腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的特性，腫瘤轉(zhuǎn)移率低。突變或缺失可使機(jī)體失調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[13-14]。HT29 是細(xì)胞發(fā)生p53基因突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞，是最常見的人類腫瘤基因。野生型p53是腫瘤的抑制關(guān)鍵因子，腫瘤發(fā)生過程中產(chǎn)生錯(cuò)誤的突變積累到較高水平時(shí)，會(huì)導(dǎo)致腫瘤惡性增殖[15]。細(xì)胞周期抑制蛋白p21 在細(xì)胞增殖過程中與p53基因共同作用，調(diào)控細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期[16]。當(dāng)DNA 發(fā)生損傷時(shí)，細(xì)胞周期阻滯，對(duì)DNA 復(fù)制錯(cuò)誤的細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行抑制，達(dá)到抑制癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)的作用[17]；p53基因突變或缺失的細(xì)胞中，DNA 損傷沒有得到及時(shí)修復(fù)，且不斷增殖導(dǎo)致錯(cuò)誤蛋白積累，最終發(fā)展為惡性腫瘤[18]。因此，我們認(rèn)為HT29 的惡性程度更高。

腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，增殖受到傳代等因素的影響，移植到體內(nèi)的細(xì)胞系增殖能力可能會(huì)受到體內(nèi)微環(huán)境影響而發(fā)生改變。本研究以2 株不同的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29 和HCT116為材料，分析其在體外培養(yǎng)和在裸鼠體內(nèi)的增殖能力，比較2 株細(xì)胞的成瘤效果和成瘤條件，為結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的構(gòu)建提供合適的細(xì)胞移植量，縮短成模周期，為移植瘤模型的成功建立提供可靠依據(jù)，也為結(jié)直腸癌的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，以期后續(xù)對(duì)裸鼠皮下移植瘤進(jìn)行更進(jìn)一步的生理生化和病理分析以及藥物試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細(xì)胞的增殖培養(yǎng)

1.1.1 細(xì)胞系來源及培養(yǎng)試劑

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29 和HCT116 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；雙抗(青霉素—鏈霉素)購(gòu)于Biological industries 公司；胎牛血清購(gòu)于 ExCell Bio 公司；CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒和BCA 總蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；p53 抗體、p21 抗體和β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司；二抗購(gòu)自美國(guó)R&D 公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取凍存的細(xì)胞株HT29 和HCT116 于37 ℃水浴鍋中迅速解凍3 min，加入DMEM 培養(yǎng)液，1 500 r/min 離心3 min 以洗去凍存液；將細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中，加入含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；隔天換液，分皿，1 周后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將HT29 和HCT116 細(xì)胞密度調(diào)整為2×106和1×107mL-1，將細(xì)胞懸液分裝于1.5 mL 離心管中，每支離心管裝200 μL，置于冰盒中保存，以備接種。

1.1.3 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

將細(xì)胞培養(yǎng)于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，每孔加人CCK-8 反應(yīng)液10 μL，隨后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；取出后使用酶標(biāo)儀讀取每個(gè)孔在450 nm 的OD 值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。

1.1.4 細(xì)胞單克隆試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按每孔1 000 個(gè)細(xì)胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)7 d 后用細(xì)胞固定液固定30 min，然后用10% Gisma 染色30 min，用蒸餾水輕輕洗去Gisma 染色液，放置干燥，于顯微鏡下觀察細(xì)胞單克隆生長(zhǎng)情況并拍照。

1.2 腫瘤細(xì)胞p53 和p21 蛋白表達(dá)測(cè)定

HT29 和HCT116 細(xì)胞使用阿霉素(doxorubicin，DOX)誘導(dǎo)后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。使用RIPA 細(xì)胞裂解液將處理組細(xì)胞放置于4 ℃裂解20 min，離心，收集細(xì)胞上清，采用BAC 法測(cè)定上清液中的總蛋白濃度；加入SDS 上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱10 min，得到變性的全細(xì)胞總蛋白樣品。細(xì)胞總蛋白使用SDS-PAGE 電泳，然后取出SDS-PAGE 凝膠，鋪上聚偏氟乙烯樹脂(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，使用膜轉(zhuǎn)印儀進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)?。晦D(zhuǎn)印了蛋白的PVDF 膜首先經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，隨后加入稀釋后的一抗于4 ℃孵育過夜，然后加入二抗于室溫孵育2 h。經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物顯色后，使用凝膠成像儀進(jìn)行蛋白表達(dá)量顯影。

1.3 腫瘤細(xì)胞的成瘤差異比較

1.3.1 腫瘤細(xì)胞接種

為比較HT29 和HCT116 細(xì)胞裸鼠移植成瘤的差異并篩選兩者的最適細(xì)胞接種量，設(shè)置單只細(xì)胞接種量為4×105(IN1)和2×106個(gè) (IN2)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞接種。將25 只裸鼠在恒定條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為5 組：對(duì)照組、HT29 細(xì)胞IN1組、HT29 細(xì)胞IN2組、HCT116 細(xì)胞IN1組和HCT116 細(xì)胞IN2組。對(duì)照組每只裸鼠于腹股溝部位皮下注射PBS 溶液200 μL，試驗(yàn)組裸鼠每只相同部位注射細(xì)胞懸液200 μL。

1.3.2 裸鼠體質(zhì)量和腫瘤體積的測(cè)定

各組裸鼠體質(zhì)量和腫瘤體積從細(xì)胞接種的第4 天起，每2 d 測(cè)量1 次，持續(xù)14 d，每次于固定時(shí)間使用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑(d1)和最短直徑(d2)，并計(jì)算腫瘤體積(V)。V=1/2d1d22。

1.4 腫瘤組織的病理學(xué)檢測(cè)

1.4.1 腫瘤組織的獲取

裸鼠成瘤14 d 后，使用5%水合氯醛對(duì)所有裸鼠進(jìn)行麻醉，剝?nèi)÷闶笃は履[瘤組織和癌旁組織，置于4%甲醛溶液中固定，于4 ℃冰箱保存。

1.4.2 腫瘤組織切片和HE 染色

將固定的組織塊裝入包埋盒，置于廣口瓶中用水流沖洗20 min，使用全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)對(duì)切片進(jìn)行脫水，脫水后使用生物組織包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋。將包埋的石蠟塊放入切片機(jī)，切取厚度為5 μm 的石蠟切片，將切片攤至載玻片，將載玻片置于60 ℃烤片機(jī)上烘烤20 min。將石蠟切片裝入載玻片架，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精復(fù)水→蘇木素室溫染色15 min→水洗→分化液分化3 s→水洗→反藍(lán)液反藍(lán)10 s→水洗→純?nèi)芤良t染色5 min→梯度酒精脫水→二甲苯透明→中性樹脂封片得到HT29 和HCT116 腫瘤組織和癌旁組織的HE 染色切片，于顯微鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

采用 GraphPad Prism 7 和SPSS 17.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)蛋白表達(dá)水平以及小鼠體質(zhì)量和腫瘤體積進(jìn)行雙因素方差分析，然后進(jìn)行Tukey’s 事后檢驗(yàn)；對(duì)細(xì)胞增殖采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 HT29 和 HCT116 腫瘤細(xì)胞的增殖

由圖1 可知：在接種細(xì)胞量相同情況下，HCT116 細(xì)胞的增長(zhǎng)率極顯著高于HT29 細(xì)胞(P＜0.01)；單克隆形成試驗(yàn)也表明：接種相同數(shù)量的HCT116 和HT29 細(xì)胞7 d 后，HCT116 克隆點(diǎn)的細(xì)胞面積明顯大于HT29 的細(xì)胞面積。

圖1 HT29 和HCT116 腫瘤細(xì)胞增殖差異比較Fig.1 Differences of proliferation between HT29 and HCT116 tumor cells

2.2 HT29 和HCT116 腫瘤細(xì)胞p53 和p21 蛋白的表達(dá)水平

由圖2 可知：DOX 誘導(dǎo)后，HT29 和HCT116細(xì)胞的p53 蛋白水平均無顯著變化(P＞0.05)，且HT29 細(xì)胞中p53 蛋白水平極顯著高于HCT116細(xì)胞(P＜0.01)；HT29 細(xì)胞中，p21 蛋白在DOX誘導(dǎo)前、后均不表達(dá)，HCT116 細(xì)胞中p21 蛋白正常表達(dá)，且在DOX 誘導(dǎo)后表達(dá)水平極顯著升高(P＜0.01)。

圖2 HT29 和HCT116 腫瘤細(xì)胞p53、p21 蛋白表達(dá)水平差異Fig.2 Differences of protein expression levels of p53 and p21 between HT29 and HCT116

2.3 HT29 和HCT116 腫瘤細(xì)胞移植對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

由圖3 可知：細(xì)胞移植12 d 內(nèi)，HT29 和HCT-116 的單只接種量為4×105和2×106個(gè)時(shí)，裸鼠體質(zhì)量均無顯著變化(P＞0.05)。

圖3 接種HT29 和HCT116 的裸鼠體質(zhì)量變化Fig.3 Changes in body weight of nude mice inoculated with HT29 and HCT116

2.4 HT29 和HCT116 腫瘤細(xì)胞的成瘤性

由圖4 可知：?jiǎn)沃患?xì)胞接種量為4×105和2×106個(gè)時(shí)，HT29 細(xì)胞移植裸鼠在移植的第4 天觀察到腫瘤生成，HCT116 細(xì)胞移植裸鼠僅在2×106個(gè)的接種量下第4 天后觀察到腫瘤產(chǎn)生；各處理組產(chǎn)生的腫塊體積在第8 天開始呈逐漸增大的趨勢(shì)，但與其他移植時(shí)間的大小無顯著差異(P＞0.05)；同一接種量下，HT29細(xì)胞移植裸鼠腫瘤體積顯著高于HCT116 細(xì)胞移植組(P＜0.05)。說明HT29 細(xì)胞比HCT116 細(xì)胞的成瘤效果顯著，高濃度的癌細(xì)胞移植有利于腫瘤形成。

圖4 HT29 和HCT116 細(xì)胞接種裸鼠的腫瘤體積Fig.4 Tumor volume in nude mice inoculated with HT29 and HCT116 cells

2.5 腫瘤組織病理學(xué)檢測(cè)

成瘤14 d 后，HT29 細(xì)胞移植組成功從裸鼠皮下剝離腫瘤組織，而HCT116 組未獲得腫瘤組織。將HT29 腫瘤組織與正常肌肉組織進(jìn)行切片和HE 染色，結(jié)果(圖5)顯示：正常肌肉組織呈正常分化的肌肉細(xì)胞；HT29 細(xì)胞腫瘤組織內(nèi)可見細(xì)胞核膨大，呈圓形，染色體著色不均，有空泡樣細(xì)胞核，腫塊組織內(nèi)細(xì)胞間聯(lián)系松散，未見明顯組織分化。

圖5 HT29 細(xì)胞接種裸鼠癌組織及正常組織的HE 染色 (20×)Fig.5 HE staining of cancer tissue and normal tissues of nude mice inoculated with HT29 cells

3 討論

移植瘤的形成在動(dòng)物模型建立過程中受許多因素影響，如細(xì)胞活力及數(shù)量、注射用細(xì)胞懸液的制備情況和細(xì)胞培養(yǎng)條件等細(xì)胞因素以及裸鼠品種及大小、發(fā)育時(shí)間、健康與否和接種方法等試驗(yàn)動(dòng)物因素。本研究主要針對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞周期等進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

在進(jìn)行皮下移植腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)時(shí)，如果接種量太小，可能造成移植瘤生長(zhǎng)緩慢或效果不明顯，過高則可能造成裸鼠死亡。本研究設(shè)置了4×105和2×106個(gè)2 種單只細(xì)胞接種量，探究細(xì)胞接種量對(duì)裸鼠成瘤效果的影響。HCT116 細(xì)胞在2×106個(gè)的單只接種量下可以成瘤，說明該接種量是HCT116 細(xì)胞的較合適接種量；而 HT29細(xì)胞在4×105和2×106個(gè)的單只接種量下均可成瘤，表明高濃度的腫瘤細(xì)胞移植有利于成瘤，且HT29細(xì)胞的成瘤效果較好。與HT29 相比，HCT116細(xì)胞的體內(nèi)成瘤效果較差，其一，可能是荷瘤時(shí)間過短，瘤體還沒有完全發(fā)育，瘤體體積較?。黄涠?，可能是因?yàn)镠T29 是p53突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞，HCT116 細(xì)胞p53野生型使癌細(xì)胞凋亡，從而防止癌變。

靶向高增殖是侵襲性腫瘤的突出問題，腫瘤的特征之一是無限制的細(xì)胞增殖[19]。體外培養(yǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞增殖速率的快慢并不能完全反映腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的增殖。在體外，HT29 細(xì)胞增殖速率低于HCT116，其原因可能是HT29 細(xì)胞過度產(chǎn)生p53 腫瘤抗原，但在p53基因的273 位發(fā)生突變，導(dǎo)致組氨酸取代精氨酸[20]；本研究也表明：p53 蛋白在HT29 細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，且p53蛋白的高表達(dá)可能抑制了p53 下游p21 蛋白表達(dá)。前期研究表明：p53基因缺失可促進(jìn)豬成纖維細(xì)胞增殖[21]；在本研究中，與HT29 相比，HCT116 細(xì)胞增殖速率顯著升高，p53 蛋白表達(dá)量極顯著下降，且在HCT116 細(xì)胞中，DOX 誘導(dǎo)下p21 顯著升高，可能是由于p53 蛋白表達(dá)過低使細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持能力下降，細(xì)胞受到脅迫后應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，p21 蛋白表達(dá)水平升高。

突變型p53可增加癌細(xì)胞的惡性程度，還能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗騕22]，可阻止細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，還能直接與 DNA 啟動(dòng)子附近區(qū)域結(jié)合，或者反式激活啟動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)[23]。突變型p53轉(zhuǎn)錄的下游靶基因大多上調(diào)了腫瘤的生存信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤血管生成[24]。HCT116 的p53 蛋白表達(dá)量極顯著低于HT29 細(xì)胞，惡性腫瘤通常具有惡性增殖的特點(diǎn)，該結(jié)果提示HT29 為惡性程度更高的腫瘤細(xì)胞?？梢?，腫瘤細(xì)胞在體外增殖速率的快慢不能完全真實(shí)反映腫瘤細(xì)胞的惡性程度，必須結(jié)合腫瘤細(xì)胞的其他生物學(xué)特性、相關(guān)分子機(jī)制以及在體內(nèi)的增殖狀況才能較全面地分析和判斷腫瘤細(xì)胞的惡性程度。

4 結(jié)論

高濃度的癌細(xì)胞移植利于腫瘤的形成。HCT-116 細(xì)胞的增殖速率高于HT29，但HT29 細(xì)胞移植成瘤效率顯著優(yōu)于HCT116 細(xì)胞，這可能與HT29細(xì)胞中p53基因突變導(dǎo)致p53 蛋白高表達(dá)及其下游p21 蛋白低表達(dá)有關(guān)。