miR-26b-5p通過下調(diào)MKNK2/eIF4E信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲

王躍華，曾麗平，曾久平，王曉紅，朱志斌，趙 昕，金中奎

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是惡性程度最高的腫瘤之一，5年生存率不到8%[1]。目前根治性手術(shù)切除仍是治愈胰腺癌、使患者達(dá)到長期生存的有效手段；然而由于胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，約60%的患者確診時(shí)已處于疾病進(jìn)展期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，探索胰腺癌發(fā)生進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵分子，對(duì)于PC的早期診斷和治療有重要意義。microRNAs是一種非編碼小分子RNA，其通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合在目標(biāo)mRNA的3’非編碼區(qū)，并使之降解，從而調(diào)控其功能。研究顯示在胰腺癌進(jìn)展過程中，miRNAs發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。已有報(bào)道m(xù)iR-21[2]和miR-203[3]在胰腺癌組織中高表達(dá)，高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)；miR-145[4]和miR-122-5p[5]分別靶向轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和細(xì)胞周期蛋白G1（CCNG1），抑制胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，其他非編碼RNA，如長鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA也可通過吸附作用影響miRNAs的功能。在胰腺癌中，circular RNA ADAM9可吸附結(jié)合miR-217，從而增強(qiáng)PRSS3基因的功能，激活ERK/VEGF信號(hào)通路[6]。長鏈非編碼RNA HCP5可結(jié)合miR-214-3p，減少其對(duì)HDGF基因的抑制作用，從而導(dǎo)致胰腺癌對(duì)吉西他濱耐藥[7]。本課題組在前期研究中系統(tǒng)分析了胰腺癌miRNA的差異表達(dá)及其與生存的關(guān)系[3]。本研究將進(jìn)一步探討miR-26b-5p的生物學(xué)功能，驗(yàn)證其調(diào)控的信號(hào)通路。

1 資料與方法

1.1 胰腺癌臨床資料 從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO ；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載數(shù)據(jù)集GSE71533和GSE85589。GSE71533包含18例正常組織和8例PC組織的miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)；GSE85589包含88例正常和19例PC患者血漿miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)。從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas，TCGA；https://cancergenome.nih.gov）提取胰腺癌數(shù)據(jù)集，其中包含184例組織樣本miRNA的表達(dá)譜和其中的174例PC患者的隨訪生存資料。

1.2 差異分析和生存分析 分別將GSE71533和GSE85589數(shù)據(jù)集中的樣本分為PC組和正常組。通過方差分析計(jì)算miR-26b-5p表達(dá)值在兩組中的差異。在TCGA-胰腺癌（TCGA-PAAD）隊(duì)列中，排除術(shù)后3個(gè)月內(nèi)死亡的患者，以減少手術(shù)對(duì)生存期的影響，最終納入168例PC患者進(jìn)行生存分析。按照miR-26b-5p的中位表達(dá)值，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，通過Log-rank檢驗(yàn)評(píng)估高、低表達(dá)組的生存曲線是否存在差異，并繪制Kaplan-Meier生存曲線表示總生存率。

1.3 miR-26b-5p的功能和通路富集分析 首先通過TargetScan數(shù)據(jù)庫篩選3’非編碼區(qū)與miR-26b-5p互補(bǔ)配對(duì)的基因集作為預(yù)測的靶基因；其次，使用R軟件“clusterprofiler”程序包對(duì)miR-26b-5p靶基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，其中包括三方面功能注釋：生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）；最后利用京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；https://www.kegg.jp），完成基因集的通路富集分析。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 胰腺癌PANC-1細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（北京TransGen Biotech公司）體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液。miR-26b-5p對(duì)照（NC）、類似物（mimics）和抑制物（inhibitor）購自廣州RiboBio公司。短發(fā)卡干擾RNA（sh-RNA）質(zhì)粒和MKNK2-pcDNA3.1質(zhì)粒購自蘇州GenePharma公司，并包裝成GV248慢病毒。將5×105個(gè)對(duì)數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞接種于6孔板，參照說明書，使用Lipofectamine 3000 （Invitrogen）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn) 將PANC-1細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-26b-5p mimics組和 miR-266-5p inhibitor組，觀察miR-26b-5p對(duì)細(xì)胞功能的影響。PANC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，接種于96孔板，每孔3×103個(gè)細(xì)胞，在37 ℃完全培養(yǎng)基培養(yǎng)0、24、48、72和96 h后，用CCK-8試劑盒在450 nm波長處測量光密度，計(jì)算細(xì)胞增殖率，每孔重復(fù)3次。

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：于Transwell下室（美國Corning公司）加入100 μL高糖DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染24 h后，5×104個(gè)細(xì)胞加入上室，孵育24 h后，用4%甲醛固定15 min，用0.1%的蘇木精染色15 min，用200倍光學(xué)倒置顯微鏡拍照，觀察侵襲到膜下的細(xì)胞數(shù)，取每張膜中央部分和周圍部分共計(jì)5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)采用Matigal膠（美國BD公司）均勻平鋪于小室的聚碳酸酯膜上，于37 ℃作用2 h備用。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染24 h后，將5×107個(gè)細(xì)胞接種于12孔板，孵育24 h后，用200 μL移液槍頭劃痕，用PBS沖洗2次，分別于0 h和24 h用倒置顯微鏡拍照，測量劃痕寬度，計(jì)算每組0 h的平均寬度作為參照值，相對(duì)寬度=實(shí)際寬度/參照值，每組重復(fù)3次。

1.6 蛋 白 印 跡 實(shí) 驗(yàn)（Western blotting） 將PANC-1細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-26b-5p mimics組和miR-266-5p inhibitor組，觀察miR-26b-5p對(duì)MAPK互作絲氨酸/蘇氨酸激酶2（MKNK2）蛋白表達(dá)的影響。將PANC-1細(xì)胞分為MKNK2敲減（KD）組、KD對(duì)照組、MKNK2過表達(dá)（OE）組和OE對(duì)照組，觀察MKNK2對(duì)eIF4E蛋白表達(dá)的影響。MKNK2、真核細(xì)胞啟動(dòng)因子4E（eIF4E）和GAPDH抗體購自上海Abcam公司。將5×105個(gè)對(duì)數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后，孵育24 h，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液處理細(xì)胞，利用BCA蛋白檢測試劑盒（Beyotime）檢測蛋白總量。經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉2 h。用TBST洗膜3次后，加入一抗，4 ℃孵育過夜；再次洗膜后，室溫加入二抗孵育2 h；洗膜后，經(jīng)ECL孵育后，在暗室掃膜顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析，P < 0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-26b-5p在胰腺癌組織低表達(dá)且與PC患者預(yù)后不良有關(guān) 在GSE71533數(shù)據(jù)集中，miR-26b-5p在PC組織中的表達(dá)值明顯低于正常組織（9.65±0.10 vs 10.18±0.07，P < 0.001；圖 1A）。GSE85589數(shù)據(jù)集的結(jié)果顯示：miR-26b-5p在PC患者血漿的表達(dá)值明顯低于正常對(duì)照血漿的表達(dá)值（0.67±0.18 vs 0.79±0.24，P=0.017；圖 1B）。TCGA-PAAD生存分析顯示，miR-26b-5p高表達(dá)組的總體生存率明顯高于低表達(dá)組（圖1C）。

圖1 miR-26b-5p在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與PC患者預(yù)后的關(guān)系

2.2 miR-26b-5p的靶基因與MAPK信號(hào)通路有關(guān) 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫，篩選出251個(gè)基因的3’非編碼區(qū)有miR-26b-5p的結(jié)合位點(diǎn)，將這些基因作為miR-26b-5p的預(yù)測靶基因進(jìn)行GO分析。結(jié)果顯示：在生物學(xué)過程方面，基因主要富集在細(xì)胞酰胺代謝過程和翻譯調(diào)控（圖2A）；在細(xì)胞成分方面，富集在細(xì)胞質(zhì)核糖核蛋白顆粒（圖2B）；在分子功能方面，富集在磷脂水解酶活性方面（圖2C）。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示：MAPK信號(hào)通路是富集最為明顯的信號(hào)通路（P=0.002；圖2D）；在miR-26b-5p的251個(gè)靶基因中，有10個(gè)基因（MKNK2、ATF2、RAP1A、HGF、CACNA2D1、TAB2、RPS6KA2、MRAS、MEF2C、IGF1）參與MAPK信號(hào)通路。由于MKNK2是MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶之一，可以結(jié)合eIF4E從而激活mRNA翻譯、癌性轉(zhuǎn)化和腫瘤細(xì)胞的增殖，本研究選擇MKNK2作為miR-26b-5p的靶基因進(jìn)行后續(xù)的Western blotting驗(yàn)證。

圖2 miR-26b-5p靶基因的GO和KEGG富集分析

2.3 miR-26b-5p抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-26b-5p mimics組的PANC-1細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組；而miR-26b-5p inhibitor組的PANC-1細(xì)胞存活率明顯高于對(duì)照組（圖3A）。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-26b-5p mimics組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組；而miR-26b-5p inhibitor組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（圖3B）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)提示，在miR-26b-5p mimics組穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組；而在miR-26b-5p inhibitor組，穿至下室的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（圖3B）。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：miR-26b-5p inhibitor組的劃痕寬度明顯小于對(duì)照組；而miR-26b-5p mimics組的寬度明顯大于對(duì)照組（圖3C）。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)提示，miR-26b-5p抑制PANC-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖3 miR-26b-5p對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 miR-26b-5p抑制MKNK2/eIF4E信號(hào)通路 Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，miR-26b-5p mimics組的MKNK2和eIF4E表達(dá)下降；而miR-26b-5p inhibitor組的MKNK2和eIF4E表達(dá)上調(diào)（圖4A）。在MKNK2過表達(dá)組的eIF4E表達(dá)升高；MKNK2低表達(dá)組的eIF4E表達(dá)下降（圖4B）。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-26b-5p抑制MKNK2及其下游eIF4E蛋白的表達(dá)。

圖4 miR-26b-5p對(duì)MKNK2/eIF4E信號(hào)通路的影響

3 討論

胰腺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤，雖然近年來手術(shù)技術(shù)、診斷方法和治療手段有所進(jìn)步，但患者的長期生存率仍無明顯改善。因此需要探索、驗(yàn)證影響PC進(jìn)展的新機(jī)制和靶點(diǎn)。大量研究證實(shí)miRNAs在胰腺癌組織異常表達(dá)，可作為PC診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物；miRNAs對(duì)胰腺癌的發(fā)生、進(jìn)展起重要的調(diào)控作用。GEO數(shù)據(jù)庫提供了胰腺癌多組學(xué)芯片數(shù)據(jù)，可以對(duì)miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，從而篩選出更可靠的目標(biāo)分子。TCGA數(shù)據(jù)庫除了提供胰腺癌多組學(xué)數(shù)據(jù)外，還包含臨床隨訪數(shù)據(jù)，因此可以探索分子表達(dá)水平與患者生存的相關(guān)性。本研究通過上述公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，miR-26b-5p在胰腺癌組織和PC患者血漿低表達(dá)，并且miR-26b-5p高表達(dá)組PC患者的預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：miR-26b-5p的靶基因主要富集在MAPK通路，細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-26b-5p抑制PANC-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Western blotting實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR-26b-5p可抑制MKNK2/eIF4E信號(hào)通路。

miR-26b-5p在多種腫瘤中均發(fā)揮抑癌作用。例如，COL12A1在胰腺癌組織明顯高表達(dá)，與PC患者預(yù)后不良有關(guān)；miR-26b-5p的表達(dá)與COL12A1負(fù)相關(guān)并有結(jié)合位點(diǎn)，NAMPTP1與miR-26b-5p有結(jié)合位點(diǎn)并且二者的表達(dá)值呈負(fù)相關(guān)，提示NAMPTP1吸附miR-26b-5p從而減弱其對(duì)COL12A1的抑制作用[8]。另一項(xiàng)研究顯示miR-26b-5p是影響PC患者預(yù)后的保護(hù)性因素（危險(xiǎn)比=0.53），與Cox-2信號(hào)通路有關(guān)[9]。在前列腺癌組織中miR-26b-5p低表達(dá)，可作為診斷前列腺癌的分子標(biāo)志物[10]。lncRNA DUXAP8結(jié)合miR-26b-5p從而下調(diào)其功能，導(dǎo)致肺癌進(jìn)展[11]。此外，miR-26b-5p靶向 KPNA2，抑制Burkitt淋巴瘤細(xì)胞增殖[12]。本研究通過公共數(shù)據(jù)集和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-26b-5p對(duì)胰腺癌具有抑癌作用。

基因本體分析發(fā)現(xiàn)：miR-26b-5p的靶基因在生物學(xué)功能方面與酰胺代謝有關(guān)。腫瘤細(xì)胞的增殖速度快，為了獲得能量，谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝較正常細(xì)胞明顯加快，其代謝產(chǎn)物也參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。在細(xì)胞成分方面，靶基因與核糖核蛋白顆粒有關(guān)。核糖體蛋白與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)有關(guān)，可在多種腫瘤組織中過表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。在分子功能方面，靶基因與磷脂水解酶活性有關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)磷脂酶A2的亞型在多種腫瘤異常表達(dá)，與腫瘤增殖、凋亡和侵襲有關(guān)。GO分析提示，miR-26b-5p可能通過調(diào)控靶基因，在多個(gè)腫瘤相關(guān)生物學(xué)功能方面發(fā)揮作用。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)：在預(yù)測的251個(gè)miR-26b-5p的靶基因中，8個(gè)基因參與MAPK信號(hào)通路。MAPK是絲裂原活化蛋白激酶，將細(xì)胞表面的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，可受到腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)及細(xì)胞應(yīng)激調(diào)控。MAPK通路的基本組成為三級(jí)激酶模式，包含MAPK激酶激酶（MKKK）、MAPK激酶和MAPK。這三種激酶能依次激活，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化，參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。例如，p38 MAPK信號(hào)通路的激活可促進(jìn)VEGF表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌血管生成[13]；在肝癌細(xì)胞，EGFR-p38 MAPK的激活可下調(diào)miR-675-5p從而增加PD-L1的穩(wěn)定性[14]；剪接因子SF3b6可通過MAPK信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[15]。因此本研究選擇MAPK通路的基因作為目標(biāo)分子進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

MKNK2是蛋白激酶超家族成員，是分裂素激活蛋白（MAP）激酶激活的一種下游激酶，能夠使eIF4E磷酸化，從而對(duì)于mRNA的翻譯、致癌性轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞增殖有重要作用[16]。在恩雜魯胺耐藥的前列腺癌細(xì)胞中，miR-361-3p可靶向MKNK2 3’非編碼區(qū)，抑制其表達(dá)從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)恩雜魯胺的敏感性[17]。在前列腺癌細(xì)胞中，mTORC1可磷酸化MKNK2從而促進(jìn)eIF4E的磷酸化，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[18]。目前發(fā)現(xiàn)eIF4E是MKNK2下游分子，促進(jìn)胰腺癌發(fā)生和進(jìn)展。例如，PHGDH與eIF4E互相作用，促進(jìn)其表達(dá)從而促進(jìn)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖、侵襲[19]。MKNK2/eIF4E通路的激活可以上調(diào)放療后Sox2介導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的增殖，提示對(duì)Sox2的干預(yù)治療可能提高胰腺癌放療的效果[20]。本研究在PANC-1細(xì)胞中證實(shí)miR-26b-5p可下調(diào)MKNK2/eIF4E信號(hào)通路的表達(dá)。

綜上所述，miR-26b-5p在胰腺癌組織和血漿中低表達(dá)，miR-26b-5p的低表達(dá)與PC患者的預(yù)后不良有關(guān)，有可能作為胰腺癌診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的新型分子標(biāo)志物。在機(jī)制上，miR-26b-5p下調(diào)MKNK2/eIF4E信號(hào)通路，抑制PANC-1細(xì)胞增殖、侵襲，有可能作為胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。