實(shí)時熒光定量PCR 法對ICU 患者痰液標(biāo)本中鮑曼不動桿菌耐藥基因的檢測及其評價

馬亞楠, 譚 兵, 徐 磊, 張健東

（1. 天津市第三中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 天津市重癥疾病體外生命支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心 天津市肝膽研究所, 天津 300170；2. 天津市第三中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 天津 300170）

重癥監(jiān)護(hù)病房（Intensive Care Unit, ICU）是醫(yī)院內(nèi)病情危重患者的集中救治基地, 絕大多數(shù)患者病情嚴(yán)重、自身免疫功能低, 加上各種有創(chuàng)醫(yī)療救治措施和廣譜抗菌藥物的長期使用, 患者被細(xì)菌感染的風(fēng)險大幅度上升。ICU 患者一旦發(fā)生醫(yī)院感染, 其炎癥控制非常困難, 不但延長了患者的住院時間、增加醫(yī)療費(fèi)用, 更影響患者的生命安全[1］。鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii, AB）是一類革蘭陰性、非發(fā)酵的條件致病菌, 生命力極強(qiáng), 被公認(rèn)為全球范圍內(nèi)醫(yī)院暴發(fā)感染的新病因[2-3］。碳青霉烯類抗菌藥物是治療重癥革蘭陰性菌感染的一線藥物[4］。近年來, 由于藥物的廣泛使用, 耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenemresistantAcinetobacter baumannii, CRAB）的檢出率已經(jīng)高達(dá)70%, 為臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)[5］。目前認(rèn)為產(chǎn)生碳青霉烯酶是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的主要機(jī)制[6］。碳青霉烯類抗生素耐藥菌株以產(chǎn)D 類酶, 又稱苯唑西林酶（oxacillin-hydrolyzing, OXA）最常見, OXA-51 基因是鮑曼不動桿菌唯一的固有基因, 而OXA-23 基因?yàn)橹饕哪退幓騕7-8］。本研究采用實(shí)時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR） 法對ICU 患者的痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測分析, 評估耐藥基因檢測的應(yīng)用價值, 為臨床及時有效地選擇抗生素提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源、主要試劑和儀器選取天津市第三中心醫(yī)院ICU 病房2019 年1 月—2021 年6 月送檢的患者痰液標(biāo)本, 共計(jì)285 份。本研究已獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)。將送檢標(biāo)本分別進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定和藥敏試驗(yàn)及RT-qPCR 法耐藥基因檢測。培養(yǎng)所用血平板、巧克力平板和麥康凱平板購于濟(jì)南百博生物技術(shù)有限公司, 全自動鑒定和藥敏卡購于美國梅里埃公司, 鮑曼不動桿菌碳青霉烯類抗生素基因檢測試劑盒（核酸抽提液、OXA-51 基因PCR 檢測混合液、OXA-23 基因PCR 檢測混合液、酶、陰性對照品和陽性對照品）購于寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司。VITEK MS 全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)和VITEK 2 Compact 全自動微生物藥敏系統(tǒng)購于法國生 物 梅 里 埃 公 司, 羅 氏Cobas?Z480 全 自 動RT-qPCR 儀購于德國羅氏診斷有限公司。

1.2 細(xì)菌鑒定和藥敏鑒定傳統(tǒng)培養(yǎng)是細(xì)菌檢出的金標(biāo)準(zhǔn)方法, 其過程包括細(xì)菌接種培養(yǎng)和細(xì)菌鑒定。將接收的合格痰標(biāo)本接種于血平板、麥康凱平板和巧克力平板, 置于溫箱培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h 后從接種的平板中分離單個菌落, 并制備成0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙? 采用VITEK MS 全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)和VITEK 2 Compact 全自動微生物藥敏系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定及藥敏鑒定。

采用K-B 紙片法對亞胺培南和美羅培南的藥敏情況進(jìn)行鑒定。結(jié)果判定依據(jù)2019 版臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）指南[9］。CRAB 判定標(biāo)準(zhǔn)：亞胺培南或美羅培南至少一種碳青霉烯類抗生素耐藥作為納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 耐藥基因檢測嚴(yán)格按照寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司“鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗生素基因檢測試劑盒說明書”操作并進(jìn)行核酸提取, 采用全自動RT-qPCR 儀擴(kuò)增并進(jìn)行耐藥基因（OXA-51和OXA-23）檢測分析。篩選出感染AB 的標(biāo)本中OXA-51 基因陽性的標(biāo)本, 根據(jù)其耐藥基因OXA-23 分為OXA-23 基因陽性組和OXA-23 基因陰性組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用WHONET 5.6 軟件和SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Kappa檢驗(yàn)分析藥敏鑒定法和耐藥基因檢測法的符合率, 符合率組間比較采用χ2檢驗(yàn), OXA-23 基因陽性組和OXA-23 基因陰性組標(biāo)本耐藥率組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AB 和CRAB 檢出率在285 份疑似AB 感染患者的痰標(biāo)本中, 經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法鑒定出AB 的有151 株, AB 陽性檢出率為52.98%；鑒定出CRAB的有109 株, CRAB 陽性檢出率為38.25%；基因檢測OXA-51 陽性為AB 的有155 株, AB 陽性檢出率為54.39%； OXA-23 陽性為CRAB 的有108 株, CRAB 陽性檢出率為37.89%。對碳青霉烯類藥物產(chǎn)生耐藥的AB 所占比例高達(dá)72.20%（109/151）。

2.2 CRAB 的藥敏結(jié)果CRAB 對大多數(shù)藥物普遍耐藥, 其中耐藥率較低的藥物有米諾環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦、黏菌素和替加環(huán)素。CRAB 菌株抗生素藥敏結(jié)果見圖1。

圖1 CRAB 菌株抗生素藥敏結(jié)果Fig.1 Antibiotic susceptibility results of CRAB strains

2.3 OXA-51 基因檢測結(jié)果臨床上通過檢測OXA-51 基因陰陽性來判斷是否為AB 感染, 如OXA-51 基因陽性則代表標(biāo)本中存在AB。將傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法的結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn), 評價OXA-51 基因檢測結(jié)果的符合率。在傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定為AB 感染的151 份標(biāo)本中, OXA-51 基因陽性的有142 份；在鑒定結(jié)果并非AB 感染的134 份標(biāo)本中, OXA-51基因陰性的有121 份。采用OXA-51 基因檢測AB 的符合率為92.28%, 傳統(tǒng)培養(yǎng)法和耐藥基因檢測法的陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.056,P＞0.05）；經(jīng)Kappa檢驗(yàn)分析, Kappa=0.845, 表明2 種方法的檢測結(jié)果一致性較好。

2.4 耐藥基因OXA-23 檢測結(jié)果可通過耐藥基因OXA-23 陰陽性來判斷AB 是否耐藥, 即是否為CRAB。故篩選出感染AB 標(biāo)本中OXA-51 基因陽性的標(biāo)本, 以此為研究對象, 將藥敏試驗(yàn)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn), 判斷耐藥基因OXA-23 檢出CRAB 結(jié)果的符合率。在藥敏試驗(yàn)鑒定為CRAB 的107 份標(biāo)本中, 耐藥基因OXA-23 陽性的有98 份；在鑒定結(jié)果AB 對碳青霉烯類藥物敏感的35 份標(biāo)本中, 耐藥基因OXA-23 陰性的有25 份。采用OXA-23 基因檢測CRAB 的符合率為86.62%。藥敏鑒定法和耐藥基因檢測法的陽性檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.703,P＞0.05）；經(jīng)Kappa檢驗(yàn)分析, Kappa=0.636, 表明2 種方法檢測結(jié)果的一致性一般。盡管并非所有的CRAB 均攜帶OXA-23 基因, 但檢測OXA-23 耐藥基因方法的準(zhǔn)確性較高。

2.5 OXA-23 基因陽性組和OXA-23 基因陰性組標(biāo)本的藥敏結(jié)果在108 株AB 感染OXA-23 陽性標(biāo)本對米諾環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦、黏菌素和替加環(huán)素的耐藥率較低。在34 株感染AB 的OXA-23 基因陰性標(biāo)本中, 上述藥物耐藥率普遍較低。統(tǒng)計(jì)分析顯示：AB 如果對碳青霉烯類藥物, 如亞胺培南和美羅培南不產(chǎn)生耐藥, 則大概率AB 對其他藥物也不產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象, 即除慶大霉素外, 其他藥物的耐藥率均小于亞胺培南和美羅培南。見表1。

表1 OXA-23 基因檢測與抗生素藥敏結(jié)果的關(guān)系Tab. 1 Relationship between OXA-23 gene detection results and antibiotic susceptibility results

3 討 論

AB 是一種普遍存在的條件致病菌, 是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一。由于ICU 患者長期使用廣譜抗菌藥物和有創(chuàng)醫(yī)療救治措施, 其醫(yī)院感染發(fā)生率是普通病房的5～10 倍, 預(yù)后也隨之變差[10-11］。研究[12-13］顯示：超過36%的醫(yī)院獲得性肺炎是由AB 感染引起的, 在重癥監(jiān)護(hù)病房中, 醫(yī)院獲得性感染的致病菌中, 由AB 引起的約占12%, 其中因AB 耐藥引發(fā)的血流感染導(dǎo)致的死亡率高達(dá)58.2%～79.8%。AB 主要引起皮膚和軟組織感染、傷口和血液感染及腦膜炎和呼吸機(jī)相關(guān)肺炎, 這是AB 引起的最常見也是最致命的感染[14］。

目前, 碳青霉烯類藥物被臨床廣泛用于抗感染, 導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌, 包括多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥。青霉素類和三及四代頭孢菌素類抗菌藥物耐藥率均超過了60%, 碳青霉烯類（亞胺培南和美羅培南） 耐藥率也超過了60%, 形勢非常嚴(yán)峻[15］。近幾年來, 本院ICU 病房中AB 對碳青霉烯類藥物的耐藥率由2014 年的63.1%升高至2020 年的80.3%。臨床急需一種快速且準(zhǔn)確的檢測耐藥菌的方法, 幫助醫(yī)生及時診斷病情并合理選擇抗生素, 從而延緩耐藥菌的出現(xiàn)。

傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定和藥敏試驗(yàn)方法最大的缺點(diǎn)在于過程復(fù)雜、檢測周期長, 一般臨床上采用傳統(tǒng)方法鑒定出CRAB 的周期約為3 d, 而RT-qPCR 法的檢測周期為2～3 h。本研究結(jié)果顯示：通過檢測耐藥基因OXA-23 鑒定CRAB 的結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測符合率為86.62%, 在保證準(zhǔn)確性的前提下, 該方法最大的優(yōu)勢在于檢測時間短, 這對于病情嚴(yán)重的患者來講是非常可取的, 這種技術(shù)也應(yīng)在臨床中廣泛應(yīng)用。耐藥基因檢測和傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果不一致的原因：①OXA-51 陽性標(biāo)本中, AB 并非優(yōu)勢菌；②耐藥基因的檢測無法判斷細(xì)菌的死亡情況；③OXA-51 基因可能存在于其他革蘭陰性菌, 如粘質(zhì)沙雷菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌中, 但在上述細(xì)菌中OXA-51基因的檢出率極低[16］。④OXA-23基因是CRAB 耐藥的主要機(jī)制, AB 菌中還可能攜帶OXA-24 和OXA-58 基因。

本研究結(jié)果顯示：CRAB 菌株對頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環(huán)素、替加環(huán)素和黏菌素的耐藥率較低。這些藥物將成為臨床上治療CRAB 感染的重要抗生素。頭孢哌酮/舒巴坦是一類復(fù)合藥劑, 頭孢哌酮抗菌譜廣, 但對β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性較差；舒巴坦抑菌作用差, 兩者復(fù)合抗菌效果成倍, 特別是對于能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的革蘭陰性菌[17］效果更好。頭孢哌酮/舒巴坦是目前臨床上用于治療AB感染的主要藥物, 其抗菌效果顯著, 可迅速減輕患者臨床癥狀, 且價格較易被接受。但其長期大量使用時, 容易出現(xiàn)多種不良反應(yīng)。米諾環(huán)素和替加環(huán)素屬于四環(huán)素類抗生素。米諾環(huán)素目前仍是口服制劑, 只適用于胃腸動力恢復(fù)的患者, 且甲狀腺損害嚴(yán)重, 有一定的局限性。替加環(huán)素屬于米諾環(huán)素衍生物, 殺菌活性更強(qiáng), 但會出現(xiàn)全身性不良事件和血栓性靜脈炎等多種不良反應(yīng)[18］。黏菌素對革蘭陰性菌有極強(qiáng)的抗菌作用。研究[19］顯示：黏菌素對CRAB 的耐藥率非常低, 被認(rèn)為是治療CRAB感染的最后防線, 但其最大的局限性在于不良反應(yīng)多, 且有很高的腎毒性和神經(jīng)毒性, 且該藥物價格高昂, 一般情況下不建議一線使用。臨床醫(yī)生用藥往往不是單一用藥, 每種藥物均存在一定的缺陷, 如不穩(wěn)定和抗菌效果差等, 為增強(qiáng)藥物療效并減少不良反應(yīng), 臨床普遍采取聯(lián)合用藥的方式進(jìn)行治療。聯(lián)合用藥雖然可以增強(qiáng)藥效, 但這種方式可能產(chǎn)生相反的結(jié)果。所以, 合理的聯(lián)合用藥方案（含藥物種類、劑量和比例等） 還需要進(jìn)行更深入的研究。

近年來醫(yī)院內(nèi)感染中, CRAB 的耐藥率普遍達(dá)到70%左右, 呈泛耐藥趨勢。耐藥菌的出現(xiàn)給醫(yī)生用藥帶來巨大的挑戰(zhàn), 對于ICU 病房中病情嚴(yán)重的患者, 耐藥菌的檢測周期過長可能導(dǎo)致患者病情惡化, 影響生命健康安全。RT-qPCR 耐藥基因檢測可及時有效檢測出AB 感染及其耐藥性, 為醫(yī)生指導(dǎo)臨床用藥提出建設(shè)性意見。目前臨床醫(yī)生常以頭孢哌酮/舒巴坦聯(lián)合替加環(huán)素作為經(jīng)驗(yàn)性治療CRAB 的一線藥物, 但是尚無大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。為了控制“超級細(xì)菌”的出現(xiàn), 應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性檢測, 制訂抗菌藥物使用規(guī)則, 規(guī)范臨床醫(yī)生用藥方案, 嚴(yán)格依照藥敏試驗(yàn)結(jié)果, 加強(qiáng)抗菌藥物的合理使用, 避免臨床治療面臨無藥可用的境地[20］。