2型糖尿病模型大鼠心肌微血管病變的觀察*

張夢笛，崔鑫鈺，袁悅瑩，張雨婷，于雪，吳晏

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

糖尿病是全球流行的慢性終身代謝性疾病，近年來，我國糖尿病患者數(shù)量急劇增加，帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病患者發(fā)生心血管疾病的比例和嚴(yán)重程度都高于非糖尿病患者，心血管并發(fā)癥是糖尿病患者死亡的主要病因[1-2]。微血管病變是糖尿病心血管并發(fā)癥的一個(gè)重要類別，血管生成因子表達(dá)減少和血管生成受損是其主要表現(xiàn)。在糖尿病進(jìn)程中，心臟微血管病變通常先于大血管，這使得心臟更易受到缺血性損傷[3-4]。高血糖可破壞微血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性，導(dǎo)致毛細(xì)血管和小動(dòng)脈嚴(yán)重受損，同時(shí)阻礙新生血管生成，微血管密度降低[5]。心肌微血管數(shù)量的逐漸減少導(dǎo)致心肌灌注降低，最終引發(fā)心臟功能障礙和進(jìn)行性心力衰竭。同時(shí)，血管生成障礙又加重了糖尿病的臨床表現(xiàn)，如心肌缺血、壞死等。因此，保護(hù)心臟微血管對于延緩或減輕糖尿病心血管并發(fā)癥至關(guān)重要[6]。促進(jìn)心臟血管生成和改善微循環(huán)功能已成為改善糖尿病引起的不良心血管事件的潛在靶點(diǎn)[7-8]。

糖尿病大鼠模型是進(jìn)行藥理研究的常用動(dòng)物模型。目前，對于糖尿病引起的心肌微血管病變的研究較少，并且既往實(shí)驗(yàn)多采用1型糖尿病模型進(jìn)行研究。然而，2型糖尿病占糖尿病發(fā)病總數(shù)的90%～95%[9]，是最為普遍的糖尿病類型。雖然1型糖尿病和2型糖尿病均可引起心血管并發(fā)癥，但是二者的疾病特征與機(jī)制并不完全相同。采用更為貼合人類2型糖尿病病變特點(diǎn)的動(dòng)物模型探討其糖尿病心肌微血管病變的特點(diǎn)與機(jī)制是臨床前藥物評價(jià)以及藥理機(jī)制研究的工作基礎(chǔ)，具有重要意義。本研究采用經(jīng)典的高脂飼料喂養(yǎng)合并單次腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素的方法復(fù)制2型糖尿病大鼠模型，于模型成功建立12周后觀察心功能與毛細(xì)血管密度的改變，并對血管生成相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探討，旨在探尋具備2型糖尿病心肌微血管病變的實(shí)用動(dòng)物模型，為相關(guān)藥物研究提供工作基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物雄性SPF級SD大鼠18只，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物房，使用許可證號：SYXK (京) 2020-0033，溫度(23±2) ℃，濕度(55±5)%，12 h/12 h明暗交替，自由飲食、水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批通過，倫理審批號：BUCM-4-2020091503-3148。實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格遵循3R原則，給予人道關(guān)懷。

1.2 試劑鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，德國sigma公司，貨號：S0130)；口服葡萄糖粉劑[廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H45021416]；檸檬酸鈉緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，0.1 mmol·L-1，pH4.5，貨號：C1013)；Masson染色試劑盒、蘇木素伊紅染液、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又名CD31)兔多克隆抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1006、G1005、GB11063-2)；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)鼠單克隆抗體、血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)兔多克隆抗體、酪氨酸激酶受體-2(tyrosie kinase with Ig and EGF homology domain，Tie-2)兔多克隆抗體(美國Proteintech公司，貨號：20536-1-AP、23302-1-AP、19157-1-AP)；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司，貨號：sc-7269)；磷酸化血管內(nèi)皮生長因子受體2(phospho-VEGF receptor 2，p-VEGFR2)、麥胚凝集素(wheat germ agglutinins，WGA)兔多克隆抗體(英國abcam公司，貨號：ab5473、L5142)；Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國Protein Simple公司，貨號：SM-W001)；高脂飼料[膽固醇1%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽酸鈉0.5%、基礎(chǔ)飼料 83.5%，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司]。

1.3 儀器Onetouch Ultraeasy型血糖儀、Onetouch Ultra型試紙(美國強(qiáng)生公司)；JT-12S型脫水機(jī)、JB-L7型包埋機(jī)、JJQ-P3116型病理切片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；ICC50HD型光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)；Pannoramic SCAN型數(shù)字切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司)；Wes型全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)及配套試劑(美國ProteinSimple公司)；Vevo2100型小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng) (加拿大Visual Sonics公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與造模18只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)體質(zhì)量均衡原則分為正常組(8只)和模型組(10只)。正常組予以普通飼料喂養(yǎng)，模型組予以高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，模型組大鼠禁食12 h，腹腔注射35 mg·kg-1STZ建立2型糖尿病模型，模型建立7 d后檢測空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol·L-1為造模成功[10]；正常組腹腔注射相應(yīng)劑量的檸檬酸鈉緩沖液。模型成功后，正常組給予普通飼料，模型組給予高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)12周。

2.2 口服糖耐量實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?2周后，測量大鼠的體質(zhì)量(body weight，BW)，并進(jìn)行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)，具體如下：兩組動(dòng)物禁食不禁水12 h，尾尖部靜脈取血測定血糖后按2 g·kg-1劑量灌胃給予葡萄糖溶液，并于灌胃后30 min、60 min、120 min尾尖采血檢測血糖變化，用Graphpad prism軟件計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)。

2.3 心臟功能檢測將大鼠麻醉后置于平臺上，采用Visual Sonics Vevo 2100小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)經(jīng)胸骨旁短軸切面進(jìn)行二維M型超聲心動(dòng)圖檢查，使用Vevo 2100分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fractions，EF)和短軸縮短率(short-axis fractional shortening，F(xiàn)S)。

2.4 HE染色與Masson染色超聲檢測后，經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血后，處死動(dòng)物迅速分離心臟，隨后放入預(yù)冷的生理鹽水中，反復(fù)沖洗至心臟中無血液，漂凈并擦干水分后，迅速取大鼠左心室心肌組織，部分放入4%多聚甲醛進(jìn)行固定，部分立即放入液氮中保存?zhèn)溆?。取固定好的心臟組織，常規(guī)脫水、包埋、切片，并進(jìn)行HE染色與Masson染色，并于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)及膠原纖維含量變化，每個(gè)樣品選取5個(gè)視野，并采集圖像，使用Image J軟件分析膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。

2.5 免疫組化染色法檢測心肌組織CD31的表達(dá)石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水后，置于檸檬酸抗原修復(fù)液中修復(fù)抗原，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min，3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%BSA室溫封閉30 min，甩除后加50 μL CD31一抗(稀釋比例為11 000)，4 ℃孵育過夜后，滴加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1200)覆蓋組織，室溫孵育50 min，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，沖洗切片以終止顯色。蘇木素復(fù)染，梯度酒精、二甲苯及中性樹膠脫水、透明、封片。用數(shù)字切片掃描儀掃描染色切片，CD31陽性細(xì)胞呈棕黃色，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野在400倍下進(jìn)行毛細(xì)血管計(jì)數(shù)，除以視野面積(約0.18 mm2)即為毛細(xì)血管密度。

2.6 WGA染色檢測心肌細(xì)胞肥大情況石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，置于EDTA抗原修復(fù)液中抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS洗滌3次，每次5 min，切片甩干后滴加WGA染液，避光37 ℃恒溫孵育30 min，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS洗滌后滴加自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min，用抗熒光淬滅封片劑封片。采用數(shù)字切片掃描儀掃描染色切片，并使用3DHISTECH配套分析平臺CaseViewer 2.4.0對心肌細(xì)胞面積進(jìn)行測量。綠色表示心肌細(xì)胞邊界，400倍下每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，每視野取10個(gè)細(xì)胞，量化平均心肌細(xì)胞面積(μm2)，以確定是否存在心肌細(xì)胞肥大改變。

2.7 Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測心肌組織中VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2的表達(dá)采用Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)定量試劑盒使用Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)[11]進(jìn)行蛋白表達(dá)水平檢測，每個(gè)樣品上樣量為3 μL(5×Master Mix 0.6 μL，樣品原液與0.1×Sample Buffer共 2.4 μL，以95 ℃、10 min條件變性)。一抗使用試劑盒自帶的Antibody diluent 2進(jìn)行稀釋(β-actin、Ang-1、Tie-2稀釋比例為1100；VEGF、p-VEGFR2稀釋比例為150)。樣品及一抗制備好后，按照封閉液、一抗、二抗、樣品、發(fā)光液、清洗液的順序逐孔加入12～230 kDa Wes測定板，機(jī)器自檢無異常后，放入測定板及毛細(xì)管，開始檢測后，機(jī)器通過毛細(xì)管抽取400 nL樣品，按分子量大小對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，然后通過使用HRP偶聯(lián)的二抗對心肌組織中VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2進(jìn)行基于HRP的檢測。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，用目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示該目的蛋白的表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀況比較模型建立12周后，與正常組相比，模型組大鼠BW明顯降低(P<0.01)。注射STZ 7 d后，模型組共有8只大鼠空腹血糖值符合模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)，且與正常組相比，模型成功大鼠的血糖值明顯升高(P<0.01)，并出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿的癥狀。模型建立12周后，與正常組相比，模型組大鼠的空腹血糖明顯降低(P<0.01)。口服糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠的血糖值均先升高后降低，正常組大鼠的血糖在30 min時(shí)達(dá)到峰值，而模型組大鼠的血糖在60 min時(shí)才達(dá)峰值；與正常組相比，模型組大鼠AUC顯著升高(P<0.01)。綜合大鼠體質(zhì)量、空腹血糖和糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，2型糖尿病模型建立成功且保持穩(wěn)定。見表1，圖1。

表1 各組大鼠空腹血糖及體質(zhì)量比較

注：n=6；A:血糖變化；B:AUC變化；與正常組相比，**P<0.01圖1 各組大鼠口服糖耐量比較

3.2 各組大鼠心功能比較經(jīng)超聲心動(dòng)圖檢測大鼠心功能發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室短軸縮短率均明顯降低(P<0.01)，提示模型大鼠已出現(xiàn)明顯左心室收縮功能障礙。見圖2。

注：n=6；A:EF比較；B:FS比較；與正常組相比，**P<0.01圖2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

3.3 各組大鼠心肌纖維化和心肌細(xì)胞肥大比較HE染色顯示：正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常、邊界清晰；而模型組大鼠心肌組織染色不均勻，肌束排列紊亂，出現(xiàn)大量結(jié)締組織增生。Masson染色評估大鼠心肌纖維化情況，圖中呈藍(lán)色的為膠原纖維，呈紅色的為肌纖維和紅細(xì)胞，結(jié)果顯示：正常組大鼠心肌組織分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞間質(zhì)和周圍血管無明顯藍(lán)色膠原纖維；而模型組的心肌組織尤其是微血管周圍有大量膠原纖維沉積，心肌組織結(jié)構(gòu)破壞。與正常組相比，模型組大鼠CVF明顯升高(P<0.01)。免疫熒光染色顯示，與正常組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞面積明顯升高(P<0.01)。見圖3-圖5。

圖3 各組大鼠心肌組織HE、Masson染色圖(×400，n=6)

注：n=6，與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01圖4 各組大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)比較

注：n=6；A:WGA染色圖(×400)；B:心肌細(xì)胞面積比較；與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01圖5 各組大鼠心肌細(xì)胞WGA染色圖及面積分析

3.4 各組大鼠心肌組織CD31的表達(dá)水平比較作為內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，CD31陽性代表毛細(xì)血管密度的變化，因此采用CD31染色檢測大鼠心肌毛細(xì)血管密度。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中CD31陽性細(xì)胞密度顯著降低(P<0.01)。見圖6。

注：n=6；A:CD31染色示意圖(×400)；B:毛細(xì)血管密度比較；與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01圖6 各組大鼠心肌組織CD31表達(dá)水平比較

3.5 各組大鼠心肌組織VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2蛋白表達(dá)水平比較Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織中VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見圖7。

注：n=6；A:各蛋白條帶圖；B:各蛋白表達(dá)水平比較；與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01圖7 Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測心肌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)

4 討論

本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)合并小劑量注射STZ的方法建立2型糖尿病大鼠模型。注射STZ后，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低，空腹血糖明顯升高，并出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，提示2型糖尿病模型復(fù)制成功。在糖尿病模型建立12周后，心臟超聲結(jié)果顯示，左心室射血分?jǐn)?shù)和短軸縮短率比值明顯降低，心功能下降；病理結(jié)果顯示有心肌細(xì)胞肥大與心肌纖維化改變，由此可明確，本研究建立的2型糖尿病模型大鼠存在心功能受損。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠心肌毛細(xì)血管密度顯著降低，通過對血管生成相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測可知，與VEGF和Ang-1及其受體表達(dá)降低有關(guān)。綜上所述，糖尿病心功能障礙、心臟重構(gòu)與微血管病變有關(guān)，包括血管生成因子表達(dá)減少、微血管稀疏等。

糖尿病患者血管內(nèi)皮生長因子發(fā)揮生理作用與維持正常的心肌毛細(xì)血管密度和左心室功能有關(guān)[12]。VEGF作為重要的血管內(nèi)皮生成因子，在生理或病理情況下對血管生成都具有中心調(diào)控作用[13]，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長，促進(jìn)血管新生[14]。VEGFR2是VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的主要特異性受體及關(guān)鍵信號傳導(dǎo)因子[15]。VEGFR2與VEGF結(jié)合后形成二聚體，并發(fā)生磷酸化[16]，p-VEGFR2繼而調(diào)控下游信號通路，通過增殖、遷移和抗凋亡等途徑維持內(nèi)皮細(xì)胞生存，促進(jìn)新生血管形成[17-18]。既往研究顯示，糖尿病可引起VEGF/p-VEGFR2水平明顯下調(diào)[19-21]，導(dǎo)致血管生成受損，心肌毛細(xì)血管密度降低[14]；VEGF表達(dá)水平和毛細(xì)血管密度的顯著降低可導(dǎo)致DCM患者左心室功能障礙[22]。

VEGF/p-VEGFR2信號系統(tǒng)在血管新生過程中起主導(dǎo)作用，而Ang-1/Tie-2信號通路在血管成熟與穩(wěn)定中起關(guān)鍵作用[23]。糖尿病血管生成異常與Ang-1/Tie-2信號通路傳導(dǎo)受損密切相關(guān)[24-25]。Tie-2是內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶，Ang-1是其關(guān)鍵配體，Tie-2與Ang-1結(jié)合后發(fā)生磷酸化，在血管發(fā)育成熟中發(fā)揮重要作用。Ang-1 通過募集平滑肌細(xì)胞到新生血管中，使其形成肌性小動(dòng)脈和靜脈，促進(jìn)新生血管在初始階段進(jìn)一步發(fā)育成熟[26]，達(dá)到改善心肌血流、修復(fù)心肌的目的[27-30]，激活A(yù)ng-1/ Tie-2信號通路可顯著提高毛細(xì)血管密度[25，31]。

在糖尿病進(jìn)程中，心臟微血管損害的發(fā)生早于大血管[32]，故糖尿病患者心臟中血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)降低、微血管生成減少、血管密度降低[33-35]是引起心血管并發(fā)癥、心臟功能障礙和進(jìn)行性心力衰竭的重要因素[12，36]，并最終導(dǎo)致心血管并發(fā)癥發(fā)病率和死亡率增加[4]。促血管生成因子及其受體的異常表達(dá)及信號傳導(dǎo)障礙是糖尿病誘發(fā)血管生成障礙的主要原因。本研究中Wes全自動(dòng)蛋白定量檢測結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠心肌組織中VEGF、p-VEGFR2、Ang-1、Tie-2的蛋白表達(dá)均明顯降低，提示心肌血管生成相關(guān)信號通路VEGF/VEGFR2與Ang-1/Tie-2受損，可能與2型糖尿病介導(dǎo)的心肌血管生成障礙相關(guān)。

本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)合并單次腹腔注射小劑量STZ的方法復(fù)制2型糖尿病大鼠模型，結(jié)果顯示，在模型建立12周后，模型動(dòng)物出現(xiàn)明確的心肌微血管病變與心功能損傷，是符合2型糖尿病心肌微血管病變相關(guān)藥理研究需要的理想動(dòng)物模型。