核糖體蛋白S15a在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義

鈕燕，白忠，吳海鶯，呂操，曹守明，馬燕，寧金梅

（1.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，云南 昆明 650000；2.云南省曲靖市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，云南 曲靖 655000）

0 引言

對于真核生物核糖體而言，其組成分為兩大部分，分別為79種核糖體蛋白（ribosomal protein,RP）、4種 核 糖 體RNA（ribosomal RNA，rRNA）。有相關(guān)的研究指出，在核糖體形成，蛋白質(zhì)合成中，前者均扮演著重要的角色，且參與轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控、免疫細胞惡性轉(zhuǎn)化等較多的生理與病理過程及變化[1]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些RP在眾多類型腫瘤中表達量升高，過表達的RP可能起到促進腫瘤作用，某些RP在鼻咽癌組織中的表達異常，但就目前的相關(guān)研究來看，在鼻咽癌組織中，針對核糖體蛋白S15a（ribosomal protein S15a，RPS15a）的相關(guān)表達與功能研究文獻較少。故而筆者開展此次研究具有較高的意義，首先針對RPS15a在鼻咽癌組織中的表達展開了分析，并進一步分析了RPS15a不同表達水平與此類疾病患者相關(guān)臨床指標之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

所有標本來自昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院2016年10月至2019年12月因鼻咽部腫塊就診患者107例，對所有的患者標本實施病理檢查，均確診低分化鱗癌（107例患者的相關(guān)標本在取材前均未實施相關(guān)的治療，包括放化療）。隨機選取30例鼻咽部腫塊患者，取鼻咽部病變旁0.8-1cm的無腫瘤組織，對所取的組織實施病理診斷，均確診為癌旁正常組織，且均未經(jīng)癌細胞浸潤。需要注意的是，上述所提到的組織標本保存待檢方法為：活檢后用氯化鈉溶液沖洗表面殘留血跡，置入冷凍管后，放入液氮罐或-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；而且均在活檢前對患者進行告知，得到其同意后實施。昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會已經(jīng)對此次研究實施了相關(guān)審查，其結(jié)果顯示為通過。

1.2 主要試劑

兔抗RPS15a多克隆抗體由美國賽默飛世爾科技Invitrogen公司提供，工作濃度1:100。二甲苯、中性樹膠由國藥集團提供，0.1%triton-100X由Sigma（上海）貿(mào)易有限公司提供，山羊血清由恒遠生物公司提供，蘇木素由珠海貝索生物技術(shù)公司提供，0.25%鹽酸酒精、檸檬酸抗原修復液由邁新公司提供，EDTA 抗原修復液由碧云天公司提供，1xPBST 洗液為實驗室自配，3%過氧化氫溶液、100%乙醇、75%乙醇實驗室自有。

1.3 RPs15a表達的檢測

嚴格按照試劑盒說明書中的操作標準與相關(guān)流程、步驟等開展常規(guī)免疫組織化學SP法檢測。首先，將烤箱設(shè)置為65℃、30min后，置入組織玻片進行烘烤，取出后利用二甲苯缸進行3次脫蠟處理，每次10min；利用酒精可以洗去二甲苯的作用，前后共4次置于酒精缸中，依次為100%酒精5min，100%酒精5min，100%酒精5min，75%酒精5min，流水沖洗5min；將經(jīng)過上述處理后的玻片置入檸檬酸鹽修復液缸中，再將缸放入高壓鍋內(nèi)，鍋內(nèi)加水至缸體2/3處，管壁高壓鍋270℃升溫煮沸至爆氣，將溫度調(diào)至180℃煮沸5min，關(guān)閉高壓鍋，保溫10min，開蓋取出玻片修復缸，室溫冷卻；將所得玻片置入1xPBS緩沖液中，浸泡時間設(shè)置為10min，根據(jù)組織大小，使用免疫組化筆畫出橢圓形的隔水圈后，再次利用1xPBST緩沖液進行3次沖洗處理，每次時間均為5min，使用3%過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶5min，再次進行沖洗5min處理，利用1xPBST緩沖液進行，山羊血清封閉15min，染色，選擇使用1抗的濃度，1抗稀釋液使用0.1%triton，加入1抗置37℃孵箱1h，將1抗反應(yīng)結(jié)束的玻片使用1xPBST緩沖液清洗5min/3次，加入2抗，置37℃孵箱1h，將2抗反應(yīng)結(jié)束的玻片使用1xPBST緩沖液清洗5min，共3次，之后進行避光染色處理，利用DAB染液，染色5min，此項操作結(jié)束后水洗終止染色，利用蘇木素進行復染10s處理，流水沖洗之后，用0.25%鹽酸酒精分色2s，再次經(jīng)過流水沖洗之后，利用無水乙醇實施脫水處理，每缸2min，共計2缸，二甲苯缸浸泡，每缸2min，使用中性樹膠進行封片。

1.4 結(jié)果判定標準

由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，陰性對照品為4%免疫前羊血清。RPS15a表達陽性判定標準：對組織中的細胞質(zhì)、細胞核等進行仔細觀察，如果出現(xiàn)清晰的黃色、棕黃色顆粒則判定為陽性。另外，針對每個組織標本的染色情況進行得分統(tǒng)計，方法為在鏡下觀察標本的染色強度和廣度，以其乘積作為得分。其中在染色廣度中，分別記為0-4分，以陽性細胞占比作為計分標準，0-4分分別為陽性 細胞 占 比＜1%、2%-25%、26%-50%、51%-75%、＞75%；在染色強度中，以其著色情況作為計分標準，0-3分分別為無著色、黃色、棕色、深褐色。最終每個組織標本的染色情況根據(jù)得分高低分為Ⅰ（0-1分）、Ⅱ（2-4分）、Ⅲ（5-8分）、Ⅳ級（9-12分），其中除Ⅰ級為陰性表達之外，Ⅱ級及以上均為陽性表達[2]。

1.5 統(tǒng)計學方法

此次利用軟件SPSS18.0，針對RPS15a表達水平、臨床相關(guān)的病例資料指標等均實施[n（%）]與χ2檢驗，在其對比過程中，如果對比結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義則以P＜0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 RPs15a基因在鼻咽癌組織和癌旁組織的表達

見表1。

表1 RPs15a在鼻咽癌組織及癌旁組織的免疫組化表達

RPS15a 在鼻咽癌組織中的陽性表達率為低表 達39.3%（42/107），高 表 達60.7%（65/107），在癌旁正常組織中的陽性表達率為低表達100%（30/30），未有高表達的標本，依據(jù)χ2檢驗分析可知，與癌旁組織相比，在鼻咽癌組織中RPS15a基因的表達相對更高(P＜0.001)。RPS15a主要表達于鼻咽黏膜的腺體，多數(shù)位于細胞胞漿，少數(shù)位于細胞核及核膜（圖1、2）。

圖1 癌旁組織

圖2 鼻咽癌組織

2.2 RPs15a基因在鼻咽癌組織臨床病理資料的表達

見表2。

表2 鼻咽癌患者RPs15a表達與腫瘤特征的關(guān)系

將患者按年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、是否有復發(fā)情況、有無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組進行RPS15a表達陽性率比較，根據(jù)Mann-Whitney U分析可知，RPS15a基因的表達在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01），與患者年齡、性別、 腫瘤大小、腫瘤分期、是否有復發(fā)情況無明顯相關(guān)性。

2.3 鼻咽癌患者RPs15a表達與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

見表3。

表3 鼻咽癌患者RPs15a表達與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

根據(jù)Spearman等級相關(guān)性分析可知，RPS15a基因的表達與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，即隨著患者腫瘤惡性程度加深，RPS15a基因的表達隨之增加。

3 討論

鼻咽癌是一種起源于鼻咽部上皮細胞的惡性腫瘤[3]。雖然隨著醫(yī)學診療技術(shù)的進步，該疾病的生存率顯著提高，但由于大部分的患者發(fā)現(xiàn)時已處于疾病晚期，甚至伴有不同程度的轉(zhuǎn)移等，故而其治療效果并不是十分理想。對此，筆者開展此次研究，旨在為鼻咽癌患者的早期臨床診斷以及預后評估尋找到更優(yōu)的生物標志物。

對于核糖體蛋白而言，其除了主要參與蛋白質(zhì)的合成之外，還參與正常細胞惡性轉(zhuǎn)化等[4]，因此其如果存在基因表達異常則可能會誘發(fā)疾病[5,6]。RPS15a是高保守的核糖體蛋白，其可在蛋白翻譯水平中介導腫瘤發(fā)生[7]，筆者考慮，這可能是導致鼻咽癌的發(fā)生及進展的相關(guān)機制之一，而也有相關(guān)的研究指出，RPS15a可能在細胞中起著癌基因或癌基因激活劑的作用[8,9]。

在本研究中，在鼻咽癌組織中，RPS15a的陽性表達率更高，且其表達水平與患者的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。故而提示，RPS15a基因可能在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，具有較強的診斷與預后價值，有可能作為鼻咽癌治療的一個藥物靶點。