“秩邊透水道”針法對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠PI3K/AKT/mTOR信號通路及血清指標(biāo)的影響

張 黎，王海軍△，劉 璇，曹玉霞，李佳茹，樊 青，馬夢娜

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.山西省針灸醫(yī)院，山西 太原 030006)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMs)，簡稱“內(nèi)異癥”，是一種在子宮腔內(nèi)壁以外的部位活動的疾病，其侵犯能力強，涉及范圍廣。輕則可引起疼痛、不孕與產(chǎn)科并發(fā)癥[1]，重則導(dǎo)致癌變、繼發(fā)腹水[2-3]。Dahiya等[4]驗證了子宮內(nèi)膜異位癥女性患有卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌與乳腺癌的概率分別為6.2%、4.1%與1.8%。

關(guān)于內(nèi)異癥的發(fā)病機制，最早提出的是異位內(nèi)膜種植學(xué)說，之后有體腔上皮化生學(xué)說、免疫學(xué)說等[5-6]，現(xiàn)Matsuzaki S提出纖維化參與EMs的發(fā)展[7]，但其分子病理機制尚未明確。Leconte研究發(fā)現(xiàn) PI3K/Akt/mTOR信號通路與EMs關(guān)系密切[8]。Omero等[9]利用公共數(shù)據(jù)庫提供的原始數(shù)據(jù)對轉(zhuǎn)錄組微陣列進行了薈萃分析，得出PI3K、AKT及mTOR反應(yīng)在Ⅲ-Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥中富集。Yan等[10]研究結(jié)果表明，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可緩解坐骨神經(jīng)異位癥疼痛,可能成為潛在的靶向機制。

隨著中醫(yī)的發(fā)展，治療EMs的方法逐漸增多。其中針灸療法被廣泛認(rèn)可，針灸屬于中醫(yī)學(xué)的一種，對疼痛類疾病，能起到良好的鎮(zhèn)痛作用，可暢達(dá)氣機推動氣血運行，提高機體免疫力[11]。楊兆鋼主任經(jīng)過長期臨床實踐，運用芒針以秩邊穴深透水道穴為主治療前列腺炎癥，發(fā)揮了芒針的優(yōu)勢[12]。隨后冀來喜教授根據(jù)其經(jīng)驗提出“秩邊透水道”針法，將其操作規(guī)范化以及干預(yù)慢性前列腺炎效果進行了研究，也取得卓效[13]?，F(xiàn)階段本課題組通過臨床和實驗研究，體現(xiàn)了“秩邊透水道”針法治療痛經(jīng)、壓力性尿失禁和少弱精癥等疾病的確切療效[14-16]。前期課題研究亦表明“秩邊透水道”針法通過上調(diào)大鼠子宮內(nèi)膜組織內(nèi)Beclin-1、LC3的表達(dá)促進自噬來改善EMs[17]。在此基礎(chǔ)上，本實驗進一步觀察“秩邊透水道”針法對EMs大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路及血清CA125、EMAb及VEGF的影響，探討針刺治療EMs的作用機制，這些可能在未來具有治療意義和臨床適用性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取45只SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量(180±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證編號為SCXK(京)2016-0006，條件：明暗周期為10/14 h，溫度22～26 ℃，濕度40%～70%。動物研究批號：2019DW300。成型飼料和標(biāo)準(zhǔn)水喂養(yǎng)1周后，隨機法分為假手術(shù)組、模型組、針刺組、激動劑組與針刺加抑制劑組，每組9只。

1.2 主要試劑與儀器

一次性毫針0.25 mm×15 mm；雷帕霉素(美國MCE,HY-10219);3-甲基腺嘌呤(美國MCE,HY-19312)；透射電子顯微鏡(hitachi貨號HT7700)；RIPA裂解液(Servicebio,貨號G2002)；電鏡固定液(Servicebio,貨號G1102)；子宮內(nèi)膜抗體EMAb、卵巢癌標(biāo)志物CA125和血管內(nèi)皮生長因子VEGF試劑盒(購自杭州吉泰和寧，貨號CK-E34930、CK-E30615和CK-E30908)；酶標(biāo)分析儀(Rayto RT-6100)；mTOR抗體(servicebio,貨號GB11405)；PI3K抗體(BIOSS,貨號BSM-33219M)；AKT抗體(servicebio,貨號GB111114)；臺式高速冷凍離心機(DRAGONLAB貨號D3024R)；微量高速離心機(TG16W,長沙湘智離心機儀器有限公司,型號TG16W)；電子天平(上海良平,規(guī)格：1.120 g/0.1 mg,型號AE1204m)；電子分析天平(瑞士PRECISA XB220A)。

1.3 模型制備

參考瓊斯的造模方法造模[18]:選取45只大鼠,術(shù)前各組大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/kg),禁食不禁飲1 d,腹腔麻醉,固定于鼠板上,去毛,在尿道口上方約1 cm處行3 cm左右的垂直正中縱切口進入腹腔,在膀胱下方可見子宮呈“Y”形。近端在離宮角約1 cm處結(jié)扎,遠(yuǎn)端在離卵巢約2 cm處結(jié)扎,取中段子宮放入青霉素緩沖液中洗滌,隨后切開管形子宮,剝離漿膜層、肌層,將剝離的子宮內(nèi)膜剪為5 mm×5 mm大小的片段,將內(nèi)膜層對著種植部位，植入36只受體大鼠左右兩側(cè)的腹壁處,最后關(guān)腹。假手術(shù)組單純開腹。

術(shù)后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素0.1 mL，防止感染。先給予水后投喂食物，以防發(fā)生腸梗阻。同時檢查傷口開裂情況，進行縫補。評估標(biāo)準(zhǔn)：造模后常規(guī)喂養(yǎng)15 d，再次開腹,觀察發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位灶呈囊性增長和擴大，囊壁內(nèi)產(chǎn)生新鮮血管，囊泡內(nèi)有明亮或呈黃色液體[19]?？ǔ邷y量移植物體積v=0.52×長×寬×高(v>25 mm3)。

1.4 干預(yù)方法

假手術(shù)組、模型組大鼠只進行捆綁，針刺組造模成功2周后，先捆綁，穴位消毒，選取秩邊穴：臀外下部，股骨大轉(zhuǎn)子與尾椎結(jié)合部連線外1/3與中1/3交點處[20-21]，順著同側(cè)水道穴方向進針，深度13 mm左右，待針下有緊實感，進行提插捻轉(zhuǎn)，留針20 min。激動劑組腹腔注射激動劑雷帕霉素，劑量為50 μmoL/L，2 mg(kg·d)；針刺加抑制劑組針刺后腹腔注射抑制劑3-甲基腺嘌呤，劑量為400 nmoL/μL，1.5 mg(kg·d)。各組1周干預(yù)6次,共3周。

1.5 標(biāo)本采集

1.5.1 腹腔采血 干預(yù)3周后，大鼠禁食24 h，正常飲水，腹腔麻醉，肉眼觀察大鼠沒有活動后，指掐尾部，無反應(yīng)，且全身變軟。把大鼠置于手術(shù)臺上，腹部消毒，提起腹部皮毛，沿腹中線剪開，充分暴露腹部臟器，兩手持棉球?qū)⒏采w在血管上邊的腸道與血管周圍的脂肪扒開，置于一旁，找到腹主動脈(比較粗)，左手將大鼠背部墊起，便于看清腹主動脈以及進針，右手持穿刺針，進針角度15°～30°，平刺，避免血管彎曲，采血5 mL，拔出針頭，用棉球按壓針孔。3 000 r/min離心10 min(離心半徑12 cm)取上清，分裝成50 μL/管，-20 ℃冷凍，使用時在室溫下解凍。嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5.2 子宮內(nèi)膜組織病理形態(tài)觀察 干預(yù)3周后，取大鼠異位內(nèi)膜，切成0.5 cm×0.3 cm×0.1 cm小塊。4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，HE和甲苯胺藍(lán)染色后，行光鏡查看內(nèi)膜組織形態(tài)。

1.5.3 透射電鏡檢測自噬小體 取新鮮內(nèi)膜組織置于電鏡固定液4 ℃固定2～4 h。用0.1 M磷酸鹽緩沖液沖洗，鋨酸再次固定2 h，依次脫水，滲透5～8 h，包埋，將組織切成60～80 nm的超薄切片，染色，進行觀察。

1.5.4 內(nèi)膜組織PI3K、AKT及mTOR蛋白的表達(dá)檢測 用預(yù)冷的PBS將組織塊洗滌干凈，剪成小塊勻漿,12 000 r/min離心10 min，提取總蛋白。測定蛋白濃度，蛋白變性，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。進行免疫反應(yīng)，一抗稀釋比(PI3K、AKT：1∶1 000；mTOR：1∶250)將二抗用TBST按照1∶5 000的比例進行稀釋，孵育，加入TBST快速洗脫3次?；瘜W(xué)發(fā)光，用Alpha軟件分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EMs大鼠模型評價

建模15 d后，觀察異位灶生長情況，發(fā)現(xiàn)異位灶體積變大，附著新鮮血管，內(nèi)有明亮的液體聚集。見圖1。與治療前比較，治療后各組體積縮小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；模型組異位病灶體積增大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，各治療組異位病灶體積明顯縮小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；針刺組體積明顯低于針刺加抑制劑組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組EMs大鼠異位灶體積變化

2.2 各組大鼠內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)比較

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞完整，腺體間質(zhì)正常生長，未見異常改變；模型組異位內(nèi)膜大量上皮細(xì)胞不完整，肌層肌纖維排列不規(guī)則，內(nèi)部間隙增寬，血管增多；針刺組異位內(nèi)膜上皮可見少量脫落的矮立狀細(xì)胞，排列規(guī)則，血管數(shù)量減少；激動劑組異位內(nèi)膜可見少量上皮細(xì)胞及子宮腺上皮細(xì)胞壞死，可見少量炎性細(xì)胞浸潤，血液流動不明顯；針刺加抑制劑組異位內(nèi)膜少量上皮細(xì)胞完整，肌纖維排列略整齊，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤，可見血管內(nèi)積聚較多血液。見圖2。

圖1 造模過程及模型大鼠異位灶

注：A假手術(shù)組；B模型組；C針刺組；D激動劑組；E針刺加抑制劑組(假手術(shù)組取在位內(nèi)膜，其余組取異位內(nèi)膜)。圖2 各組大鼠內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)比較(100×)

2.3 各組大鼠內(nèi)膜細(xì)胞自噬體超微結(jié)構(gòu)的變化

假手術(shù)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可，核膜完整，核周隙正常，微絨毛、線粒體豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面可見核糖體附著，相對多的自噬小體、自噬溶酶體；模型組微絨毛稀疏，線粒體腫脹嚴(yán)重者膜破損，基質(zhì)外溢,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張，自噬小體個別存在；針刺組細(xì)胞間可見緊密連接及少量橋粒，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚可，較多的自噬小體、自噬溶酶體；激動劑組微絨毛局部稀疏，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分脫顆粒、空泡變，較少的自噬小體、自噬溶酶體；針刺加抑制劑組線粒體中度腫脹者，膜內(nèi)基質(zhì)變淡，嵴減少、消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大多擴張，偏少的自噬小體。見圖3。

2.4 各組大鼠血清中EMAb、CA125及VEGF的含量變化

模型組血清中EMAb、CA125及VEGF水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)；治療后3組血清中EMAb、CA125及VEGF水平明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；針刺組與激動劑組血清中EMAb、CA125及VEGF水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與針刺加抑制劑組比較，針刺組與激動劑組血清中EMAb、VEGF和CA125水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。表明治療后血清各指標(biāo)水平均降低，以針刺組效果最為突出。見表2。

注:A假手術(shù)組；B模型組；C針刺組；D激動劑組；E針刺加抑制劑組(假手術(shù)組取在位內(nèi)膜，其余組取異位內(nèi)膜)。微絨毛(Mv)，細(xì)胞核(N)，線粒體(M)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)，自噬小體(AP)，自噬溶酶體(ASS)。圖3 各組大鼠內(nèi)膜細(xì)胞自噬體超微結(jié)構(gòu)的比較(2k×)

表2 各組大鼠血清中EMAb、CA125及VEGF的含量變化

2.5 各組大鼠內(nèi)膜組織中PI3K、AKT及mTOR蛋白表達(dá)

模型組內(nèi)膜組織中PI3K、AKT及mTOR水平顯著高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比,治療后3組內(nèi)膜組織中PI3K、AKT及mTOR水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；針刺組與激動劑組內(nèi)膜組織中PI3K、AKT及mTOR表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與針刺加抑制劑組比較，針刺組內(nèi)膜組織中PI3K、AKT及mTOR水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，激動劑組內(nèi)膜組織中PI3K、AKT及mTOR表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。綜上所述，各治療組治療后可以抑制PI3K/Akt/mTOR蛋白的表達(dá)，針刺組效果最為顯著，見表3、表4和圖4。

表3 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中PI3K、AKT、mTOR蛋白的表達(dá)

表4 各組大鼠異位內(nèi)膜組織中PI3K、AKT、mTOR蛋白的表達(dá)

注：A假手術(shù)組；B模型組在位內(nèi)膜；C模型組異位內(nèi)膜；D針刺組在位內(nèi)膜；E針刺組異位內(nèi)膜；F激動組在位內(nèi)膜；G激動組異位內(nèi)膜；H針刺加抑制組在位內(nèi)膜；I針刺加抑制組異位內(nèi)膜。圖4 大鼠內(nèi)膜組織PI3K、AKT及mTOR蛋白表達(dá)電泳

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的病灶部位很多,比如盆腔、膀胱等,但好發(fā)于盆腔。EMs的病機,黃飛翔對其進行歸納,將內(nèi)異癥的中醫(yī)病機修訂為血瘀證[22],即“瘀血阻滯胞宮、沖任”[23]。改善患者所經(jīng)歷的痛苦癥狀、改善生育力和為異位癥女性開發(fā)非手術(shù)治療方法是臨床醫(yī)生和研究人員的共同愿望。目前常用的是手術(shù)和激素類藥物治療,術(shù)后大多數(shù)女性患者生育時無法承受分娩過程中出現(xiàn)的疼痛。對于異位癥惡變發(fā)生在卵巢以外的患者，要慎重應(yīng)用雌激素。長期服用身體可出現(xiàn)不良反應(yīng)[24]。手術(shù)和藥物治療EMs復(fù)發(fā)率高[25]。因此需要開發(fā)新的、有效的和安全的針對特定分子和信號通路的治療方法。有學(xué)者闡述了同類針法治療異位癥體現(xiàn)針灸的鎮(zhèn)痛和活血化瘀功能[26]?！爸冗呁杆馈贬樂◤拈L針到芒針再到毫針一步步演變，應(yīng)用時間較長，已成為穩(wěn)定的針法。其可以緩解疼痛，還能夠改善子宮血液流變學(xué)[14]。因此，本實驗通過針刺干預(yù)EMs模型大鼠，探討該針法對EMs大鼠的作用機制。

興奮PI3K/AKT/mTOR信號通路可以促進細(xì)胞增殖[27]，Liu等[28]驗證了激活PI3K/AKT/mTOR信號通路可能使子宮內(nèi)膜癌(EC)更加嚴(yán)重，重點是PI3K通路作為自噬的開始[29]，在自噬功能中承擔(dān)著重要的作用。mTOR作為PI3K/AKT信號通路的下游效應(yīng)器，經(jīng)PI3K與AKT在細(xì)胞膜上相互作用，磷酸化后間接活化，抑制自噬。運用雷帕霉素抑制mTOR活性，可以誘導(dǎo)自噬，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤作用于PI3K-Ⅲ從而直接抑制自噬起始[30]。林瓊燕等[31]提出在EC中，順鉑抗腫瘤可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路調(diào)節(jié)自噬達(dá)到治療目的。然而，尚不確定“秩邊透水道”針法是否影響PI3K/AKT/mTOR信號通路。前期研究指出運用“秩邊透水道”針法刺激大鼠，該子宮內(nèi)膜組織中自噬Beclin1和LC3水平上升，自噬活性增強，以此治療EMs。本實驗電鏡結(jié)果顯示各組大鼠內(nèi)膜細(xì)胞中都存在自噬小體，但針刺組相對較多。推測PI3K/AKT/mTOR信號通路作為自噬上游通路，可能針刺抑制此通路提高大鼠體內(nèi)子宮內(nèi)膜細(xì)胞自噬能力從而使EMs的癥狀發(fā)生改變。

VEGF，又叫做VEGF-A,本身是一個蛋白質(zhì)，在家族成員中有“領(lǐng)導(dǎo)”身份，可以調(diào)節(jié)血管生成和介導(dǎo)疾病[32]。多種疾病的發(fā)生和發(fā)展及治療，經(jīng)常將VEGF作為檢測因子來研究，比如：EMs、慢性偏頭痛[33-34]。VEGF也受到多種途徑的調(diào)控，其中研究最多的通路之一包括PI3K/AKT/mTOR信號通路，其調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，剝奪新生血管的生存優(yōu)勢，減少形成，從而預(yù)防EMs[35]。在本研究中，模型組血清中VEGF、在位以及異位內(nèi)膜組織中PI3K、AKT和mTOR蛋白升高，提示PI3K/AKT/mTOR信號通路參與了異位癥相關(guān)血管生成的發(fā)病機制。經(jīng)干預(yù)后，血清中VEGF、在位以及異位內(nèi)膜組織中PI3K、AKT及mTOR蛋白降低，逆轉(zhuǎn)了變化。其中針刺組和激動劑組的治療作用相當(dāng)，都可降低PI3K、AKT、mTOR蛋白以及VEGF水平，可能是“秩邊透水道”針法與雷帕霉素均可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，促進自噬。經(jīng)針刺加抑制劑干預(yù)后，自噬通路PI3K、AKT、mTOR蛋白以及血清水平明顯升高,說明自噬抑制劑抑制PI3K-Ⅲ從而抑制自噬，與“秩邊透水道”針法抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)自噬的作用相反，削弱了“秩邊透水道”針法的功效。另外，經(jīng)干預(yù)后，HE染色結(jié)果顯示治療后各組異位內(nèi)膜的上皮細(xì)胞趨于完整、血管數(shù)量減少以及血流速度減緩和炎性細(xì)胞減少的程度不同，針刺組和激動劑組治療變化明顯優(yōu)于針刺加抑制劑組。進而表明“秩邊透水道針法”通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，減少血管形成，防止異位灶生長，發(fā)揮治療EMs的效應(yīng)。

實驗中EMAb和CA125發(fā)生了明顯的變化。EMAb是一種抗子宮內(nèi)膜抗體，是診斷EMs常用的生物標(biāo)志物。EMs患者受到異位內(nèi)膜的刺激，EMAb增多[35]。陳瓊?cè)A等[36]研究得出EMs患者中EMAb的非陰性率可達(dá)70%～80%。CA125作為腫瘤標(biāo)志物，用于檢測上皮性卵巢癌[37]。王瑩等[38]研究發(fā)現(xiàn)EMs患者血清中CA125濃度上升，提示較高的CA125水平在EMs的診斷、療效評估、疾病復(fù)發(fā)和鑒別等方面有重要意義。胡海雷等[39]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥患者血清中VEGF、CA125水平伴隨EMAb水平增加，客觀反映了血管新生的旺盛，說明EMAb在評價異位癥病情嚴(yán)重程度的重要性。劉增娟團隊[40]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢驗血清中EMAb、CA125優(yōu)于單一檢驗。結(jié)合檢測可以作為一種有效的無創(chuàng)篩查方法。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組血清中EMAb、CA125水平成高表達(dá)，推測兩個標(biāo)志物間接因腹膜刺激而升高，結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。經(jīng)治療后，各組大鼠血清中EMAb、CA125水平不同程度地降低。針刺組和激動劑組優(yōu)于針刺加抑制劑組，可能是針刺對機體調(diào)整作用的結(jié)果，抑制兩個標(biāo)志物的分泌，減輕EMs的癥狀，而抑制劑可能影響了針刺抑制腫瘤物分泌的作用。預(yù)實驗中在治療前對EMs大鼠眼內(nèi)眥采血，可能是因為疼痛大鼠在后續(xù)實驗中靈活度減弱；經(jīng)大腿股動脈采血，采集的血量較少；經(jīng)尾靜脈采血，采血量只有1～2滴且容易發(fā)生感染?？紤]到EMs大鼠的存活量以及血清指標(biāo)治療前后對比需要是同一個體，而腹腔采血會導(dǎo)致大鼠死亡，所以未對治療前的EMs大鼠進行腹腔采血。正式實驗沒有將EMs大鼠血清中EMAb、CA125及VEGF水平的治療前后進行對比。

本研究中，筆者首次表明針刺可能阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路，增加子宮內(nèi)膜自噬,還可降低血清中EMAb、CA125及VEGF水平，從而起到治療EMs 的作用,可能是一種有效的方法以及新的見解。同時，還需要進行更多的研究深入探討PI3K/AKT/mTOR通路在下丘腦的調(diào)控作用以及相關(guān)激素因子的檢測，加以說明其作用機制，從而成為異位癥治療的可行策略。