電針聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷的研究淺析*

郭智超 孫忠人 尹洪娜

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150006）

脊髓損傷（SCI）在中醫(yī)學(xué)中沒(méi)有明確的對(duì)應(yīng)病名，但是其癥狀與“痿病”相近，所以通常將脊髓損傷歸于“痿病”一類(lèi)，也有專(zhuān)家稱(chēng)為“體墮”。胥林波認(rèn)為，督脈與脊髓關(guān)系密切，不僅生理功能聯(lián)系緊密，病理影響也相互依存。督脈循行于人體背部，為“陽(yáng)脈之海”，具有調(diào)節(jié)全身陽(yáng)經(jīng)經(jīng)氣的作用。當(dāng)督脈受到損傷后，會(huì)出現(xiàn)氣血瘀阻，產(chǎn)生全身麻木、活動(dòng)受限的癥狀［1］。

急性SCI是指各種原因?qū)е碌募顾杞Y(jié)構(gòu)功能的損害，損傷平面以下感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能障礙，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性?xún)煞N。原發(fā)性SCI是指當(dāng)脊髓受到外力作用后的損傷［2］。繼發(fā)性SCI是指損傷后由于多種原因造成的二次損傷，主要與損傷部位的微循環(huán)有關(guān)，包括過(guò)度的促炎癥反應(yīng)、脊髓細(xì)胞的死亡、凋亡、脂質(zhì)過(guò)氧化等［3］。

電針作為一種具有顯著療效的非手術(shù)治療方式，具有副作用小、效果明顯、經(jīng)濟(jì)安全等優(yōu)點(diǎn)，在臨床中被廣泛應(yīng)用。目前有許多研究表明，電針具有抑制受損脊髓組織細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）的表達(dá)、抑制血栓的生成、促進(jìn)脊髓屏障中血管內(nèi)皮的再生等作用［4］。但電針治療SCI的治療機(jī)制還有待深入研究。

使用干細(xì)胞的目的在于通過(guò)引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)來(lái)維持和重新髓鞘化、促進(jìn)損傷和存活神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以及加速脊髓自身細(xì)胞的增殖來(lái)恢復(fù)組織基質(zhì)［5］。間充質(zhì)干細(xì)胞作為干細(xì)胞的一種，是具有自我更新和多向分化的基質(zhì)細(xì)胞，被稱(chēng)為“萬(wàn)能細(xì)胞”。可以從多種組織中進(jìn)行分離，如臍帶、骨髓、脂肪組織等，并且可以分為多個(gè)亞群，這些亞群不僅和某些細(xì)胞譜系的分化有關(guān)，而且和本身的再生能力有關(guān)。即使是同一組織內(nèi)也會(huì)因炎癥變化，分離分化而產(chǎn)生不同。正因?yàn)檫@些部位容易獲取且治療效果明顯，逐漸應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床中［6-7］。BMSCs移植作為臨床中廣泛應(yīng)用的一種干細(xì)胞移植手段，具有來(lái)源廣、分化能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)［8］。本文就電針聯(lián)合BMSCs移植對(duì)SCI的修復(fù)機(jī)制及時(shí)間效應(yīng)進(jìn)行淺析。

1 電針治療SCI機(jī)制研究

電針在鎮(zhèn)痛、改善神經(jīng)元功能、抑制細(xì)胞自噬、焦亡、凋亡、鐵死亡［9］和炎癥等相關(guān)通路進(jìn)行修復(fù)SCI方面的作用中得到了廣泛的證實(shí)［10］。姚夢(mèng)莉等研究發(fā)現(xiàn)選用雙側(cè)懸鐘、陽(yáng)陵泉兩個(gè)穴位進(jìn)行電針治療可以提升白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑（IL-1Rα）的含量，降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-β（IL-1β）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)進(jìn)行抗炎，減少繼發(fā)性SCI的損害［11］。同時(shí)使用不同的波形對(duì)于SCI的治療機(jī)制也會(huì)產(chǎn)生差異。有研究表明，使用疏密波進(jìn)行電刺激能夠使對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)起營(yíng)養(yǎng)支持作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3（NT-3）含量增加，加快SCI的逆轉(zhuǎn)運(yùn)速率，同時(shí)使TrkC受體、mRNA的表達(dá)水平均明顯提升［12］，并且疏密波還可以促進(jìn)SCI的血液循環(huán)，提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，并顯著降低丙二醛（MDA）含量，從而避免自由基及其代謝產(chǎn)物對(duì)損傷部位的損害，改善神經(jīng)組織，使新陳代謝加快，加速炎癥吸收［13］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用斷續(xù)波進(jìn)行電刺激時(shí)，不僅可以加速受損部位炎癥的減退，促進(jìn)局部壞死和崩解產(chǎn)物的消除，使局部微循環(huán)得到改善，神經(jīng)髓鞘及其細(xì)胞核不斷增多，從而促進(jìn)神經(jīng)的再生，并且斷續(xù)波還可以使損傷部位失去神經(jīng)控制的肌纖維進(jìn)行主動(dòng)性收縮，逐漸恢復(fù)肌細(xì)胞固有的收縮和舒張?zhí)匦?，減慢因失去神經(jīng)支配后肌蛋白的變性過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)SCI的恢復(fù)［14］。

2 BMSCs治療SCI機(jī)制研究

2.1 BMSCs保護(hù)機(jī)制

SCI可分為兩個(gè)階段，即初級(jí)階段和二次損傷階段。在大多數(shù)的情況下，原發(fā)性損傷后的繼發(fā)階段更為重要，是防治損傷傳播的治療靶點(diǎn)。當(dāng)二次損傷發(fā)生后，會(huì)加重組織損傷、細(xì)胞膜內(nèi)外失衡、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和血脊髓屏障被破壞等，最終造成脊髓神經(jīng)功能喪失，并伴隨SCI中持久的膠質(zhì)和纖維化疤痕的發(fā)展［15］。

2.1.1 抗炎 巨噬細(xì)胞主要有M1型和M2型兩種，M1型巨噬細(xì)胞是典型的促炎細(xì)胞，通過(guò)糖酵解進(jìn)行吞噬和殺傷，在脊髓損傷初期向組織集合，逐漸形成瘢痕組織。M2型巨噬細(xì)胞的特性是產(chǎn)生抗炎因子，依賴(lài)氧化磷酸化（OXPHOS）持續(xù)產(chǎn)生能量進(jìn)行組織修復(fù)。BMSCs能有效地為損傷部位進(jìn)行抗炎，張繼峰等［16］發(fā)現(xiàn)骨髓間光質(zhì)干細(xì)胞能夠減少膿毒癥大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，M2巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯降低，調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB（P65）蛋白入核，即損傷發(fā)生后，通過(guò)BMSCs和MSR1聯(lián)合有助于增強(qiáng)M2極化表型進(jìn)行抗炎。另外有實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)提取BMSCs的外體（BMSC-Exos）對(duì)已經(jīng)建模肌腱骨損傷的小鼠進(jìn)行組織學(xué)、免疫熒光以及PCR定量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSC-Exos可以抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，分泌過(guò)量的抗炎因子，加速骨質(zhì)的愈合［17］。

2.1.2 抗氧化 氧化應(yīng)激是指當(dāng)機(jī)體受到刺激后產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，導(dǎo)致與抗氧化防御系統(tǒng)平衡狀態(tài)失衡，引起機(jī)體損傷［18］。SCI后氧化應(yīng)激的出現(xiàn)導(dǎo)致：1）細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，內(nèi)外離子失衡，導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂；2）線(xiàn)粒體抗氧化功能受損，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡；3）加速谷氨酸釋放速度，增加運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元對(duì)興奮性毒性的敏感性等多種繼發(fā)性損害［19-21］。實(shí)驗(yàn)表明，將BMSCs移植到SCI部位后進(jìn)行觀察有明顯改善，BBB評(píng)分3 d后開(kāi)始降低并持續(xù)恢復(fù)，作為氧化應(yīng)激標(biāo)志性指標(biāo)的SOD活性提升，損傷部位的抗氧化能力持續(xù)增強(qiáng)［22］。Kyan在實(shí)驗(yàn)中將培養(yǎng)后的BMSCs血清直接注射SCI處發(fā)現(xiàn)，與其他組相比，本組氧化應(yīng)激代謝物的產(chǎn)量明顯降低，BMSCs對(duì)氧化應(yīng)激水平降低，能夠最大限度地減少對(duì)軸突的二次損傷程度［23-24］。

2.1.3 抗細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞死亡方式的一種，是為了維持機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育、保持細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡的一種必要過(guò)程，是一種為了更好適應(yīng)生存環(huán)境進(jìn)行主動(dòng)性死亡的過(guò)程。其過(guò)程主要表現(xiàn)為：當(dāng)受到不同內(nèi)外環(huán)境刺激時(shí)，會(huì)引發(fā)不同途徑介導(dǎo)的一系列凋亡起始，導(dǎo)致凋亡小體的形成，之后凋亡小體會(huì)激活相應(yīng)的Caspases家族引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致凋亡的出現(xiàn)［25］。Li等在研究中將BMSCs中的線(xiàn)粒體直接或間接通過(guò)納米管的方式移植到受損部位，實(shí)驗(yàn)表明，線(xiàn)粒體內(nèi)化后改變了凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的表達(dá)，促進(jìn)了神經(jīng)元的生存；與SCI組相比，線(xiàn)粒體組大鼠BBB評(píng)分顯著提高，促進(jìn)了SCI大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，說(shuō)明BMSCs的移植能夠有效地促進(jìn)凋亡的下降，損傷部位的恢復(fù)［26］。大量研究表明，當(dāng)脊髓損傷發(fā)生后神經(jīng)細(xì)胞的相繼凋亡，其凋亡特征為主要分布在白質(zhì)上，凋亡細(xì)胞以膠質(zhì)細(xì)胞為主［27］。而膠質(zhì)細(xì)胞具有連接神經(jīng)遞質(zhì)、突觸的橋梁作用，并且能夠參與多種細(xì)胞、神經(jīng)因子的修復(fù)、生長(zhǎng)。大量研究表明，BMSCs移植能夠提高神經(jīng)元細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化水平，更好地調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的平衡，增加少突膠質(zhì)細(xì)胞的成活率，從而抑制細(xì)胞凋亡［28］。

2.2 BMSCs神經(jīng)再生機(jī)制

突觸作為神經(jīng)元胞體的延伸部分，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性恢復(fù)具有重要意義，軸突作為其中的一種，主要作用就是將神經(jīng)元胞體的興奮沖動(dòng)傳遞至其他神經(jīng)元或效應(yīng)器上。在一般情況下，當(dāng)SCI發(fā)生后軸突不能再生，其部分原因是缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NGF），包括由腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、NT-3和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4/5（NT-4/5）組成的生長(zhǎng)因子家族［29］。它們對(duì)神經(jīng)的生存、發(fā)育、功能維持和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的可塑性至關(guān)重要。即使軸突能夠再生，它們也很少針對(duì)正確的突觸后神經(jīng)元或形成突觸連接來(lái)恢復(fù)功能［30-34］。

研究證明BMSCs能夠給細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，通過(guò)提供生長(zhǎng)因子支持神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。據(jù)報(bào)道，BMSCs能夠很好地表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并且有良好的受體親和力［35］，這在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、再生和存活中非常重要。在較早的研究中，研究人員將BMSCs在含有胎兒牛血清中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)未被治療的細(xì)胞中BDNF、GDNF、NGF、NT3和NT4/5基因的表達(dá)也顯著增加［36］。Min Ye等為了研究BMSCs分泌膠質(zhì)細(xì)胞和衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）的能力，分別通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)和酶相關(guān)免疫素檢測(cè)（ELISA）檢測(cè)了BMSCs的GDNF和蛋白質(zhì)表達(dá)。當(dāng)BMSCs培養(yǎng)3 d時(shí)，檢測(cè)到GDNF和蛋白質(zhì)，當(dāng)培養(yǎng)3、7、10 d后逐漸增加，說(shuō)明了BMSCs具有明顯的分泌GDNF的潛力［37］。大量研究表明，BMSCs分泌NTFs并促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、招募支持細(xì)胞或修復(fù)受損組織。BMSCs移植到受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，能直接定居在損傷部位，取代失去的神經(jīng)元，分泌生長(zhǎng)因子，改善突觸可塑性恢復(fù)，并提供促進(jìn)細(xì)胞存活的微環(huán)境［35］。即通過(guò)BMSCs移植，能夠使神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子允許軸突延長(zhǎng)并以正確的數(shù)量向適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)延伸，提高細(xì)胞存活率，最終對(duì)損傷部位的神經(jīng)生長(zhǎng)起到積極作用。

3 BMSCs與電針治療SCI的聯(lián)合作用

3.1 作用機(jī)制聯(lián)合

BMSCs和電針在治療脊髓損傷方面都表現(xiàn)出了極大的潛能，并且兩者可以相互配合，共同作用在SCI受損部位。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，BMSCs的增殖分化，可以加速誘導(dǎo)電針對(duì)SCI運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)功能的改善，減少繼發(fā)性疾病，從而加速損傷的恢復(fù)。有學(xué)者證實(shí)電針可以改善脊髓損傷部位的微環(huán)境，促進(jìn)移植干細(xì)胞的遷移。Hui Jind等在體外培養(yǎng)干細(xì)胞的NT-3和TRKC基因的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)支架后，通過(guò)電針進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)因子的再生數(shù)量明顯增高，并能維持原有的突觸結(jié)構(gòu)，建立新的突觸狀衍生神經(jīng)元［38］。Ying Ding等將BMSCs移植和電針治療相結(jié)合直接作用于受損大鼠部位發(fā)現(xiàn)，相比較其他組，本組的NT-3含量增加，BBB評(píng)分顯著提高，肌纖維偶爾能進(jìn)行主動(dòng)性收縮。熒光免疫化學(xué)染色顯示，移植的BMSCs能夠分化成神經(jīng)元狀細(xì)胞或膠質(zhì)狀細(xì)胞，使細(xì)胞含量顯著增加［39］。

電針能夠刺激神經(jīng)元的去極化，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞某些電壓門(mén)離子通道開(kāi)啟，進(jìn)而刺激細(xì)胞內(nèi)CAMP水平升高和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的自動(dòng)釋放，增加組織的CAMP水平和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，如NT-3、BDNF、NGF和GDNF。CAMP作為被第一個(gè)識(shí)別的第二信使，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)合成的作用，在對(duì)細(xì)胞外的反應(yīng)中具有重要影響。CAMP水平的提高能夠有效促進(jìn)激素分泌，促進(jìn)軸突生成，加速下游激活復(fù)合物的形成，推動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)［40］。此外一些研究已經(jīng)表明BMSCs能夠分泌各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子［36］，促進(jìn)體內(nèi)的軸突生長(zhǎng)。同時(shí)，電針治療可以抑制脊髓損傷后星形細(xì)胞的活性增殖，并防止形成膠質(zhì)疤痕。因此，結(jié)合BMSCs移植和電針治療可以相互配合改變病變部位的有害環(huán)境，通過(guò)增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和CAMP水平，抑制膠質(zhì)疤痕的形成，促進(jìn)軸突再生。

3.2 時(shí)間窗聯(lián)合

對(duì)于時(shí)間窗的理解，目前主要有兩種比較認(rèn)可的說(shuō)法。對(duì)于電針治療SCI方面也有同樣的兩種相關(guān)理解。

一是開(kāi)始介入治療的時(shí)間切入點(diǎn)［41］。王婷婷等在造模成功的急性SCI大鼠，給予不同時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行治療，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然電針組均優(yōu)于對(duì)照組，但當(dāng)造模成功2 h時(shí)就進(jìn)行電針治療效果最顯著，SOD和一氧化氮（NO）含量明顯提高，能夠有效清除自由基，保護(hù)受損的脊髓組織［42］。高連軍在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行SCI治療后通過(guò)磁共振成像進(jìn)行有效對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，在SCI后2～4 h進(jìn)行電針治療，纖維束修復(fù)程度明顯改善［43］。二是介入治療的有效療程［44］。電針在對(duì)于治療SCI療程上的不同，也會(huì)產(chǎn)生不同治療效果。有學(xué)者在不同時(shí)間段對(duì)損傷的大鼠進(jìn)行電針治療時(shí)發(fā)現(xiàn)，第3天開(kāi)始，腦源性神經(jīng)因子數(shù)量開(kāi)始高于對(duì)照組，在2周時(shí)呈現(xiàn)到最高狀態(tài)，第4周時(shí)，電針組與損傷組差別不大［45］。以上研究能夠說(shuō)明在SCI發(fā)生后，電針越早的介入，進(jìn)行有效治療，對(duì)于損傷后的治療效果越明顯［46］，但達(dá)到2～3周的治療時(shí)間后，會(huì)達(dá)到峰值，繼續(xù)進(jìn)行電針治療，雖有效果，但作用逐漸降低。但具體時(shí)間，尚有待研究。對(duì)于BMSCs治療SCI也有相對(duì)顯著的治療時(shí)間窗。即當(dāng)SCI發(fā)生后，不需要立即進(jìn)行BMSCs的移植處理，在SCI損傷后期能夠?yàn)橐凭拥母杉?xì)胞提供一個(gè)更加適合的環(huán)境，避免了移植排斥，病毒抗原的風(fēng)險(xiǎn)，讓自體再生成為可能［47］。研究表明，在3 d時(shí)開(kāi)始移植BMSCs使損傷部位的干細(xì)胞存活率提升，且遷移距離明顯增強(qiáng)，能夠有效抑制炎性因子的釋放，重建受損的血腦屏障［48］。

因此，在SCI發(fā)生后，可以立刻進(jìn)行電針治療，清除自由基，使纖維素進(jìn)行有效修復(fù)。在損傷發(fā)生3 d后，在進(jìn)行電針治療的同時(shí)，開(kāi)始移植BMSCs，為干細(xì)胞營(yíng)造一個(gè)適合的環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)因子的有效再生。當(dāng)電針治療進(jìn)行到2～3周時(shí)，減少電針的治療手段，配合其他康復(fù)療法進(jìn)行SCI后的修復(fù)。二者在時(shí)間窗上的聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)于SCI后的恢復(fù)，能夠達(dá)到顯著的療效。

4 總結(jié)與展望

SCI是一個(gè)十分復(fù)雜的病程，對(duì)于其損傷部位和繼發(fā)性的發(fā)展有眾多的不確定因素，各個(gè)通路、各個(gè)環(huán)節(jié)間層層影響。對(duì)于以往的研究大多都是電針對(duì)鎮(zhèn)痛、炎癥、神經(jīng)細(xì)胞損傷等單一方面，并不能把每個(gè)環(huán)節(jié)、通路進(jìn)行聯(lián)系，其研究效果不明顯。隨著針灸技術(shù)、文化思想的不斷深入發(fā)展，電針治療SCI逐漸普遍應(yīng)用于臨床，其簡(jiǎn)便，療效顯著，無(wú)副作用等治療優(yōu)勢(shì)也不斷被展現(xiàn)，但是對(duì)于治療機(jī)制尚研究不足。

近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞被作為“萬(wàn)能細(xì)胞”被廣泛研究，尤其BMSCs具有分化增殖力強(qiáng)，適應(yīng)度高等優(yōu)點(diǎn)能與不同治療手段相結(jié)合，應(yīng)用在治療眾多疾病方面，這給電針治療SCI提供了一個(gè)全新的思路。二者結(jié)合在促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抑制細(xì)胞死亡、改善損傷部位炎癥方面可以達(dá)到事半功倍的效果。但是在目前的研究中尚有幾點(diǎn)局限性尚需解決。1）目前的研究中多集中在短期的實(shí)驗(yàn)效果方面，尤其電針的長(zhǎng)期干預(yù)及其持久效果尚未可知。2）電針聯(lián)合BMSCs的研究目前尚局限在相關(guān)蛋白方面，還不能從基因、代謝方面進(jìn)行說(shuō)明其相關(guān)影響。3）針對(duì)電針聯(lián)合BMSCs，如何能從SCI眾多的疾病影響環(huán)節(jié)中，找出相對(duì)長(zhǎng)期、有效、與人體親和度高的治療方法仍是我們追尋的目標(biāo)。