circEIF4G2靶向miR-144-3p促進結(jié)腸癌LoVo細胞的增殖、遷移、侵襲

潘建柱,孫萍萍,劉麗蘋

潘建柱,天津市第五中心醫(yī)院急診外科 天津市 300450

孫萍萍,天津市第五中心醫(yī)院急診科 天津市 300450

劉麗蘋,天津市第五中心醫(yī)院神經(jīng)外科 天津市 300450

0 引言

結(jié)直腸癌是全球第三大致命惡性腫瘤[1].每年大約三分之一的結(jié)直腸癌死亡率是由于此類癌癥處于晚期發(fā)現(xiàn)所致[2].因此,迫切需要更強大的診斷和預(yù)后工具來識別和治療結(jié)直腸癌的發(fā)生.在過去的幾十年里,發(fā)現(xiàn)多種基因與結(jié)直腸癌相關(guān),包括環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA/miR)[3].circRNA是一類特殊的非編碼RNA,在調(diào)節(jié)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的一系列癌癥類型中的細胞生長、周期、凋亡、遷移和代謝中起著至關(guān)重要的作用[4].circRNA被證實通過與miRNA結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達[5].circRNA EIF4G2(circEIF4G2;hsa_circ_0021254)是一種新發(fā)現(xiàn)的circRNA,circEIF4G2在宮頸癌組織中表達增加,并且circEIF4G2的上調(diào)與宮頸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[6].circEIF4G2通過海綿miR-218促進骨肉瘤的腫瘤發(fā)生和進展[7].miR-144-3p的異常表達在各種癌癥中起到抑癌[8]或致癌[9]基因的作用.在結(jié)直腸癌中,miR-144-3p表達下調(diào)[10],通過靶向BCL6抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)來抑制結(jié)直腸癌細胞增殖[11].Starbase預(yù)測顯示circEIF4G2和miR-144-3p存在互補序列,然而circEIF4G2在結(jié)直腸癌中的表達情況、詳細作用及與miR-144-3p的關(guān)系尚未見報道.本研究的重點是探索circEIF4G2在結(jié)直腸癌LoVo細胞增殖、遷移、侵襲中的作用,旨在確定circEIF4G2的潛在機制.

1 材料和方法

1.1 材料 從醫(yī)院進行手術(shù)的結(jié)直腸癌患者中共獲得51對結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)的鄰近正常組織(癌旁組織).癌旁組織距原發(fā)病灶3 cm以上.排除接受放射或化學(xué)治療的結(jié)直腸癌患者.所有患者均簽署知情同意書.研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準.組織分離后,使用液氮速凍并儲存在-80 ℃?zhèn)溆?

結(jié)直腸癌細胞LoVo(美國典藏培養(yǎng)物保存中心),靶向circEIF4G2的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)si-circEIF4G2、siRNA陰性對照(si-NC)、miR-144-3p inhibitor(anti-miR-144-3p)、陰性對照antimiR-NC、miR-144-3p mimic、陰性對照miR-NC(廣州RiboBio),Lipofectamine 3000(美國Invitrogen),High Capacity cDNA RT試劑盒、SYBR Select Master Mix(美國Applied Biosystems),CCK-8溶液(日本Dojindo),二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒(大連Takara),抗上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、抗神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(美國Proteintech),抗增殖標記蛋白細胞增殖核抗原-67(Ki-67)、增殖細胞核抗原(PCNA)抗體(美國Abcam),增強型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國EMD Millipore),pmirGLO熒光素酶載體(美國Promega).

1.2 方法 達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)中添加10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL),用于在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)結(jié)直腸癌細胞LoVo.轉(zhuǎn)染時,根據(jù)Lipofectamine 3000操作手冊指示,在接種于6孔板的結(jié)直腸癌細胞LoVo(2×105個細胞/孔)中,分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circEIF4G2、si-circEIF4G2+anti-miRNC、si-circEIF4G2+anti-miR-144-3p,記為si-NC組、si-circEIF4G2組、si-circEIF4G2+anti-miR-NC組、sicircEIF4G2+anti-miR-144-3p組.孵育48 h后,通過檢測circEIF4G2或miR-144-3p表達進行轉(zhuǎn)染效率評估.收獲細胞用于進一步實驗.

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測circEIF4G2、miR-144-3p的表達 使用TRIzol試劑從結(jié)直腸癌組織或LoVo細胞中分離總RNA.使用NanoDrop 2000c分光光度計定量后,使用High Capacity cDNA RT試劑盒對RNA進行cDNA合成.qPCR在ABI 7900系統(tǒng)上使用SYBR Select Master Mix進行,GAPDH或U6作為內(nèi)部對照.PCR條件如下: 95 ℃ 3 min,然后95 ℃10 s、60 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s的40個循環(huán).引物序列(5′-3′): circEIF4G2 TTTTTCAACAAAGCAAGGTCAA(F)和TCTAGGTCCCACTGTCCTCA(R).GAPDH CTCT GCTCCTCCTGTTCGAC (F)和CGACCAAATCCGTT GACTCC (R).miR-144-3p TGCGGTACAGTATAGATGAT(F)和CCAGTGCAGGGTCCGAGGT(R).U6 CGCTTCGGC AGCACATATACTA (F)和CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA(R).2-ΔΔCt方法用于確定circEIF4G2、miR-144-3p相對基因表達水平.

1.4 雙熒光素酶報告實驗 使用預(yù)測軟件starbase預(yù)測與circEIF4G2相互作用的潛在miRNA.為了構(gòu)建重組熒光素酶載體,野生型(wild type,WT)和突變型(mutant,MUT)-circEIF4G2序列由上海GenePharma公司合成并克隆到pmirGLO熒光素酶載體,生成WT-circEIF4G2、MUT-circEIF4G2.使用Lipofectamine 3000,將結(jié)直腸癌細胞LoVo用50 nM miR-144-3p mimic或miR-NC與重組熒光素酶載體WT-circEIF4G2或MUT-circEIF4G2共轉(zhuǎn)染,孵育48 h后,在雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性.

1.5 細胞增殖測定 CCK-8檢測: 接種對數(shù)生長期的結(jié)直腸癌細胞LoVo在96孔板(1×104個細胞/孔)中培養(yǎng)過夜.細胞達到60%匯合時,根據(jù)1.2中分組進行轉(zhuǎn)染,然后培養(yǎng)48 h.加入10 μL CCK-8溶液4 h.使用酶標儀基于450 nm處檢測到的吸光度OD值來測量細胞增殖抑制率.抑制率(%)=100%-實驗組OD值/對照組OD值×100%.

克隆形成實驗: 將轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細胞LoVo(5×102個細胞)與DMEM混合,并接種到培養(yǎng)皿,在37 ℃和5% CO2下孵育2 wk.然后,克隆細胞用4%多聚甲醛固定15 min,室溫下用0.05%結(jié)晶紫染色30 min.使用光學(xué)顯微鏡(放大倍數(shù),×200)評估大于50的克隆數(shù).

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 轉(zhuǎn)染48 h后,在結(jié)直腸癌細胞LoVo中利用20 μL的槍頭在細胞層均勻的劃一條直線.用PBS洗細胞3次,加入無血清培養(yǎng)基,隨后對細胞進行拍照.繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,再一次對細胞進行拍照,計算劃痕愈合率.

1.7 Transwell法檢測細胞遷移、侵襲 將轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌細胞LoVo重懸于無血清DMEM中,并接種在具有8μm孔(2.5×103個細胞/孔)的Transwell上室中(侵襲實驗時,該上室預(yù)涂有Matrigel,遷移實驗則未涂Matrigel).將含有10%胎牛血清的DMEM添加到下室.孵育24 h后,遷移或侵襲性細胞在37 ℃下用甲醇固定30 min,并在37 ℃下用0.1%結(jié)晶紫染色30 min.隨后,捕獲3個視野細胞的圖像并使用IX71顯微鏡(放大倍數(shù),×200)對細胞進行計數(shù).

1.8 Western blotting檢測Ki-67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達 使用Pierce細胞裂解緩沖液從轉(zhuǎn)染后的結(jié)直腸癌細胞LoVo中提取總蛋白.二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒用于定量蛋白濃度.通過10% SDS-PAGE分離等量的蛋白(30 μg),隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上.將膜在5%脫脂牛奶中37 ℃封閉2 h,然后與一抗在4℃下孵育過夜.使用的一抗是抗E-cadherin(1:1000)、抗N-cadherin(1:1000)、抗Ki-67(1:1000)、PCNA(1:1000)和抗GAPDH(1:2000).隨后,將膜與辣根過氧化物酶標記二抗在室溫下孵育2 h.使用增強型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒使條帶可視化.

統(tǒng)計學(xué)處理每個獨立實驗均重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差(mean±SD).用SPSS 22.0軟件來評估統(tǒng)計顯著性.通過獨立樣本t檢驗進行兩組間差異分析,單因素方差分析進行多組間分析,SNK-q檢驗進行組間多重分析;Pearson法進行相關(guān)性分析.P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中circEIF4G2、miR-144-3p的表達 51例結(jié)腸癌組織中circEIF4G2表達量比癌旁組織增加約2.38倍,miR-144-3p表達量比癌旁組織減少約0.54倍(均P＜0.05),見圖1.Pearson法分析結(jié)腸癌組織中circEIF4G2、miR-144-3p表達量的相關(guān)性,結(jié)果顯示,circEIF4G2與miR-144-3p呈負相關(guān)(r=-0.7973,P＜0.0001),見圖2.

圖1 circEIF4G2和miR-144-3p在結(jié)腸癌組織中的表達分析.aP＜0.05.

圖2 circEIF4G2和miR-144-3p相關(guān)性分析結(jié)果.

2.2 circEIF4G2、miR-144-3p轉(zhuǎn)染效率的檢測 在結(jié)腸癌LoVo細胞中分別轉(zhuǎn)染si-circEIF4G2或anti-miR-144-3p后,si-circEIF4G2組circEIF4G2表達量比si-NC組減少約0.74倍,anti-miR-144-3p組miR-144-3p表達量比anti-miRNC組減少約0.60倍(均P＜0.05),見圖3.

圖3 circEIF4G2和miR-144-3p轉(zhuǎn)染效率的檢測.A: qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后circEIF4G2的相對表達;B: qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-144-3p的相對表達.aP＜0.05.

2.3 circEIF4G2靶向、調(diào)控miR-144-3p 預(yù)測軟件starbase預(yù)測的circEIF4G2和miR-144-3p的互補序列見圖4.與miR-NC組相比,miR-144-3p組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circEIF4G2的結(jié)直腸癌LoVo細胞的熒光素酶活性減少(P＜0.05),而共轉(zhuǎn)染MUT-circEIF4G2的結(jié)直腸癌LoVo細胞的熒光素酶活性無明顯波動(P=0.259),見圖5.si-circEIF4G2組結(jié)腸癌LoVo細胞內(nèi)miR-144-3p表達量為3.44±0.09,顯著高于si-NC組的1.00±0.00(t=81.333,P＜0.05).

圖4 circEIF4G2和miR-144-3p的互補序列.

圖5 雙熒光素酶報告實驗分析circEIF4G2和miR-144-3p轉(zhuǎn)染效率的靶向關(guān)系.aP＜0.05.WT: 野生型;MUT: 突變型.

2.4 circEIF4G2和miR-144-3p對結(jié)腸癌LoVo細胞增殖的影響 si-circEIF4G2組結(jié)腸癌LoVo細胞的增殖抑制率比si-NC組增加,克隆數(shù)卻比si-NC組減少;sicircEIF4G2+anti-miR-144-3p組結(jié)腸癌LoVo細胞的增殖抑制率比si-circEIF4G2+anti-miR-NC組減少,克隆數(shù)卻比sicircEIF4G2+anti-miR-NC組增加(均P＜0.05),見圖6.

圖6 circEIF4G2和miR-144-3p對結(jié)腸癌LoVo細胞克隆形成的影響.A: CCK-8檢測細胞增殖抑制率;B和C: 克隆形成實驗分析克隆數(shù).與si-NC組相比,aP＜0.05;與si-circEIF4G2+anti-miR-NC組相比,cP＜0.05.

2.5 circEIF4G2和miR-144-3p對結(jié)腸癌LoVo細胞遷移、侵襲的影響 si-circEIF4G2組結(jié)腸癌LoVo細胞的遷移和侵襲數(shù)均比si-NC組減少;si-circEIF4G2+antimiR-144-3p組結(jié)腸癌LoVo細胞的遷移和侵襲數(shù)均比sicircEIF4G2+anti-miR-NC組增加(均P＜0.05),見圖7.

圖7 circEIF4G2和miR-144-3p對結(jié)腸癌LoVo細胞遷移、侵襲的檢測.A: 劃痕實驗檢測細胞遷移率;B和C: Transwell實驗分析細胞遷移和侵襲.與si-NC組相比,aP＜0.05;與si-circEIF4G2+anti-miR-NC組相比,cP＜0.05.

2.6 circEIF4G2和miR-144-3p對結(jié)腸癌LoVo細胞中相關(guān)蛋白表達的影響 si-circEIF4G2組結(jié)腸癌LoVo細胞的E-cadherin蛋白表達量高于si-NC組,N-cadherin、Ki-67、PCNA蛋白表達量低于si-NC組;si-circEIF4G2+antimiR-144-3p組結(jié)腸癌LoVo細胞的E-cadherin蛋白表達量低于si-circEIF4G2+anti-miR-NC組,N-cadherin、Ki-67、PCNA蛋白表達量高于si-circEIF4G2+anti-miR-NC組(均P＜0.05),見圖8.

圖8 Ki-67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的檢測.A: Western blotting檢測Ki-67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的定量結(jié)果;B: Western blotting檢測Ki-67、PCNA、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的蛋白條帶.與si-NC組相比,aP＜0.05;與sicircEIF4G2+anti-miR-NC組相比,cP＜0.05.1: si-NC;2: si-circEIF4G2;3: si-circEIF4G2+anti-miR-NC;4: si-circEIF4G2+anti-miR-144-3p.

3 討論

文獻報道[12],circEIF4G2在正常組宮頸組織和血清中的表達顯著低于宮頸癌組,其在宮頸病變組織和血清中表達升高可作為宮頸病變診斷的標志物.在宮頸癌中,circEIF4G2通過促進細胞增殖、集落形成、遷移和侵襲起致癌基因的作用[6].在骨肉瘤中,circEIF4G2敲低顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲,從機制上講,circEIF4G2可以直接結(jié)合miR-218[7].這些研究表明,circEIF4G2在宮頸癌、骨肉瘤癌癥中作為腫瘤促進的circRNA加速腫瘤進展.但circEIF4G2在結(jié)直腸癌中的表達和功能尚未可知.本研究首先檢測了結(jié)直腸癌組織樣本中circEIF4G2的表達.結(jié)果表明,與癌旁組織相比,circEIF4G2在結(jié)直腸癌組織中上調(diào),這提示circEIF4G2可能在結(jié)直腸癌的發(fā)展中起關(guān)鍵作用.隨后,本研究在體外進行的細胞功能測定.在結(jié)直腸癌LoVo細胞中通過siRNA敲減circEIF4G2,結(jié)果顯示,成功敲減circEIF4G2后,結(jié)直腸癌LoVo細胞的增殖抑制率增加,克隆數(shù)、遷移、侵襲數(shù)減少,并且增殖相關(guān)蛋白Ki-67、PCNA下調(diào),遷移侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin上調(diào)、N-cadherin下調(diào),說明敲減circEIF4G2可以有效抑制結(jié)直腸癌LoVo細胞的增殖、遷移和侵襲的惡性特征,這些結(jié)果表明circEIF4G2在結(jié)直腸癌的腫瘤發(fā)生中發(fā)揮致癌作用,與先前的研究一致.

已有文獻記載,circRNA可以通過充當miRNA海綿來發(fā)揮其調(diào)節(jié)能力[12].例如circEIF4G2通過海綿miR-218加重糖尿病腎病的腎纖維化[13].本研究還評估了circEIF4G2影響結(jié)直腸癌進展的潛在機制.使用生物信息學(xué)預(yù)測方法,本研究發(fā)現(xiàn)circEIF4G2可以靶向miR-144-3p.幾項研究指出,miR-144-3p是一種促癌基因,例如在透明細胞腎細胞[9]、甲狀腺[14]中高表達,促進甲狀腺腫瘤的發(fā)展.但據(jù)多項研究報道,miR-144-3p是多種人類癌癥的抑癌基因,包括結(jié)直腸癌[10]、口腔鱗狀細胞癌[15]、非小細胞肺癌[16]、肝癌[17]和胃癌[18].例如miR-144-3p通過靶向EZH2癌基因抑制口腔鱗狀細胞癌的腫瘤細胞生長和侵襲[19].結(jié)直腸腺癌組織中miR-144-3p的表達下調(diào),miR-144-3p顯著抑制結(jié)直腸腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[20].可見miR-144-3p是結(jié)直腸癌中的腫瘤抑制因子.本研究同樣檢測到結(jié)直腸癌組織中miR-144-3p表達下調(diào).雙熒光素酶報告實驗數(shù)據(jù)顯示,circEIF4G2直接與miR-144-3p結(jié)合,且敲減circEIF4G2提升了miR-144-3p的水平.此外,miR-144-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)了敲減circEIF4G2對結(jié)直腸癌LoVo細胞增殖、遷移和侵襲的抑制效果.這些結(jié)果表明,circEIF4G2促進結(jié)直腸癌LoVo細胞惡性增殖、遷移和侵襲的作用是通過靶向miR-144-3p來實現(xiàn)的.

4 結(jié)論

總之,本研究結(jié)果首次表明circEIF4G2可能是結(jié)直腸癌中的一種新型致癌基因.此外,circEIF4G2通過靶向miR-144-3p,促進結(jié)直腸癌LoVo細胞的生長和轉(zhuǎn)移.本研究提供了結(jié)直腸癌發(fā)病機制的新見解.

文章亮點

實驗背景

結(jié)直腸癌發(fā)病機制較為復(fù)雜,已知circRNA在結(jié)直腸癌組織/細胞中表達異常,并可作為結(jié)直腸癌診斷的潛在生物學(xué)標志物及治療的潛在靶點,目前circEIF4G2在結(jié)直腸癌發(fā)病過程中的作用機制尚未明確.

實驗動機

circEIF4G2在其他腫瘤中表達上調(diào),并可發(fā)揮癌基因作用,但其在結(jié)直腸癌中的表達尚未可知,本研究分析circEIF4G2在結(jié)直腸癌組織/細胞中表達,探究其對結(jié)直腸癌細胞生物學(xué)行為的影響,為結(jié)直腸癌靶向治療尋找新型靶點.

實驗?zāi)繕?/p>

探究circEIF4G2/miR-144-3p在結(jié)直腸癌細胞生長、轉(zhuǎn)移中的作用機制.

實驗方法

逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測結(jié)直腸癌組織中circEIF4G2、miR-144-3p的表達.實驗分組: si-NC組、si-circEIF4G2組、si-circEIF4G2+anti-miR-NC組、sicircEIF4G2+anti-miR-144-3p組.利用雙熒光素酶報告實驗分析circEIF4G2與miR-144-3p之間的靶向結(jié)合.采用CCK-8法和克隆形成實驗進行四組結(jié)直腸癌LoVo細胞的增殖抑制率、克隆形成情況測定,Transwell法檢測細胞遷移、侵襲,并利用Western blotting檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達.

實驗結(jié)果

circEIF4G2在結(jié)直腸癌組織中高表達,miR-144-3p表達量降低;circEIF4G2可靶向結(jié)合miR-144-3p,并充當miR-144-3p海綿分子;抑制circEIF4G2表達可抑制結(jié)直腸癌LoVo細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲,下調(diào)miR-144-3p表達可減弱抑制circEIF4G2表達對LoVo細胞生物學(xué)行為的作用.

實驗結(jié)論

circEIF4G2通過充當miR-144-3p的海綿分子而促進LoVo細胞的生長和轉(zhuǎn)移.

展望前景

下一步將進行體內(nèi)移植瘤實驗,驗證circEIF4G2/miR-144-3p分子軸對裸鼠移植瘤生長、體積的影響.