鹽堿脅迫下平邑甜茶的轉(zhuǎn)錄組分析

王新亮， 彭 玲， 王 健， 賈晶晶， 唐立平

(1.濱州學(xué)院學(xué)報(bào)編輯部，山東濱州 256603； 2.濱州學(xué)院山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濱州 256603)

土壤鹽堿化是影響植物生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約有 95 000萬(wàn)hm2的鹽堿地，占世界總陸地面積的7%以上[1]，預(yù)計(jì)至2050年將會(huì)有50%以上的耕地發(fā)生鹽堿化[2]。我國(guó)鹽堿地總面積約有 9 900萬(wàn)hm2[3]，主要分布在東北松嫩平原、東部濱海沿岸、西北內(nèi)陸干旱區(qū)等[4]。作為我國(guó)重要農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地的黃河三角洲，地勢(shì)平坦，具備農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)越條件，但由于地理位置和氣候等原因，鹽堿土分布非常廣泛，面積約占土地總面積的50%[5]。鹽堿脅迫不是簡(jiǎn)單的鹽脅迫與堿脅迫疊加，而是有一定的協(xié)同效應(yīng)，對(duì)植物的危害更為復(fù)雜和嚴(yán)重[6]。鹽堿脅迫對(duì)植物的傷害是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，主要包括滲透脅迫、離子毒害、高pH傷害和活性氧脅迫等[7]。多年來(lái)，人們從土壤改良、栽培技術(shù)、培育耐鹽堿品種等方面對(duì)提高鹽堿地利用率和植物耐鹽堿性進(jìn)行了大量研究[8-10]，而果樹(shù)耐鹽堿研究起步較晚。近年來(lái)，鹽堿脅迫響應(yīng)機(jī)理和選育耐鹽堿砧木已經(jīng)成為果樹(shù)耐鹽堿研究的熱點(diǎn)。

蘋(píng)果(Malus×domesticaBorkh.)是世界產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的4種水果之一[11]，2018年全球產(chǎn)量約為8 600萬(wàn)t，其中我國(guó)的蘋(píng)果產(chǎn)量最高，約為 3 900萬(wàn)t[12]，但土壤鹽堿化嚴(yán)重制約著我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。優(yōu)良的砧木能夠促進(jìn)果樹(shù)生長(zhǎng)，提高果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)[13]。因此，研究砧木對(duì)鹽堿脅迫響應(yīng)和耐受的分子機(jī)制對(duì)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[14]。一直以來(lái)，人們對(duì)植物耐鹽堿機(jī)理的研究大多集中在鹽脅迫或堿脅迫方面，而對(duì)鹽堿脅迫的研究較少。此外，報(bào)道側(cè)重于對(duì)草本植物的影響，對(duì)蘋(píng)果砧木的研究較少[15]。平邑甜茶(MalushupehensisRehd.)是我國(guó)廣泛使用的蘋(píng)果砧木之一，具有無(wú)融合生殖特性[16]，非常適合于分子研究。本研究利用RNA-seq技術(shù)分析了鹽堿脅迫下平邑甜茶幼苗的轉(zhuǎn)錄本，獲得了大量差異表達(dá)基因，通過(guò)基因表達(dá)模式聚類分析和功能注釋，分析了平邑甜茶在鹽堿脅迫過(guò)程中顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，及其響應(yīng)鹽堿脅迫的分子機(jī)制，為今后蘋(píng)果砧木抗鹽堿分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在濱州學(xué)院黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室苗圃進(jìn)行。種子和細(xì)沙分別用0.2% KMnO4浸泡30 min，再用自來(lái)水沖洗干凈。種子與細(xì)沙混勻后在4 ℃溫度下層積至露白。種子播種在塑料盆基質(zhì)(沙子、蛭石和土壤的體積比為3 ∶2 ∶1)中。幼苗在室外自然光和溫度條件下生長(zhǎng)，使用1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液(pH值=6.8±0.2)澆灌。

1.2 鹽堿脅迫處理

幼苗長(zhǎng)到6～8張真葉時(shí)被分為處理組和對(duì)照組。處理組幼苗用含有200 mmol/L混合鹽(NaCl、Na2SO4、NaHCO3摩爾比為2 ∶1 ∶1，pH值=8)的 1/2 霍格蘭溶液處理；對(duì)照組用1/2霍格蘭溶液澆灌。分別在處理0、1、3、6 d采集處理組和對(duì)照組的新根和葉片(新根樣品編號(hào)：R000、R001、R003、R006；葉片樣品編號(hào)：L000、L001、L003、L006)。樣品用液氮處理后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱。

1.3 RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析

采用Trizol法提取樣品總RNA。RNA質(zhì)量用NanoDrop One超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))和Agilent 2100 生物分析儀(Agilent Technologies公司，美國(guó))測(cè)定。mRNA用帶有Oligo(dT)的磁珠從總RNA中富集，通過(guò)打斷buffer得到mRNA短片段，用隨機(jī)引物合成cDNA第1條鏈，接著形成雙鏈DNA，然后通過(guò)熱變性使產(chǎn)物形成單鏈，最后環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫(kù)。采用BGISEQ-500平臺(tái)(華大基因，深圳，中國(guó))進(jìn)行測(cè)序。

原始數(shù)據(jù)(raw data)經(jīng)過(guò)濾低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過(guò)高的片段得到純凈數(shù)據(jù)(clean data)。純凈數(shù)據(jù)與參考基因組序列(Malus×domesticaGDDH13 Whole Genome v1.，https：//www.rosaceae.org/species/malus/malus_x_domestica/genome_GDDH13_v1.1)[17-18]，并使用RSEM(RNA-Seq by expectation maximization)計(jì)算每個(gè)樣本的基因表達(dá)水平[19]，以FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)計(jì)算基因表達(dá)量。使用軟件Mfuzz對(duì)基因進(jìn)行時(shí)間序列分析[20]。各樣品間的Pearson’s相關(guān)系數(shù)通過(guò)R軟件的cor函數(shù)計(jì)算。

1.4 基因表達(dá)水平分析及功能注釋

差異倍數(shù)(fold change)≥2或≤-2并且Q值(矯正P-value)≤0.001的基因被定義為差異表達(dá)基因[21]。利用基因本體論(gene ontology，GO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.geneontology.org/)和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.genome.jp/kegg/pathway.html)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，Q值≤0.05為顯著富集。利用NCBI Nr數(shù)據(jù)庫(kù)blast功能檢索差異表達(dá)基因的同源蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

本研究23 個(gè)樣品，每個(gè)樣品平均產(chǎn)出6.48 Gb數(shù)據(jù)，43.82×106個(gè)原始數(shù)據(jù)；樣品產(chǎn)生的純凈數(shù)據(jù)為42.71×106～43.44×106個(gè)。各樣品所得數(shù)據(jù)與基因組的平均比對(duì)率為 80.01%，與基因的平均比對(duì)率為76.54%；共41 008個(gè)基因被檢測(cè)到表達(dá)，其中38 465 個(gè)為已知基因，2 543個(gè)為預(yù)測(cè)的新基因。通過(guò)計(jì)算樣品之間所有基因表達(dá)量的Pearson’s相關(guān)系數(shù)(圖1)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品的各個(gè)生物重復(fù)之間，只有L001_1和L001_2之間的相關(guān)系數(shù)小于0.8，表明其余生物學(xué)重復(fù)樣品之間的相關(guān)性較好。

2.2 基因表達(dá)模式聚類分析

根據(jù)基因的表達(dá)量信息，表達(dá)模式一致的基因被聚到同一個(gè)基因簇中，根和葉中的基因分別聚類成12個(gè)基因簇(圖2)。其中，根中基因簇1、10以及葉中基因簇8、10表達(dá)上調(diào)；根中基因簇7、9、11以及葉中基因簇4、7表達(dá)下調(diào)。

2.3 基因功能注釋

對(duì)根中基因簇1、7、9、10、11以及葉中基因簇4、7、8、10中的基因進(jìn)行了GO和KEGG 富集分析。結(jié)果顯示，GO富集分析包含生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3類，根和葉中基因富集情況基本一致：生物過(guò)程中的細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程富集數(shù)量最多，細(xì)胞組分中的膜、膜部分、細(xì)胞和細(xì)胞器富集數(shù)量最多，分子功能中的結(jié)合和催化活性富集數(shù)量最多(圖3)。KEGG富集分析顯示根中基因簇1、7、9、10、11顯著富集的途徑分別為2、3、2、17、2個(gè)(表1)；葉中基因簇4、7、8、10顯著富集的途徑分別為5、4、4、25個(gè)(表2)。

利用NCBI Nr數(shù)據(jù)庫(kù)blast功能檢索了上述9 個(gè)基因簇的基因的同源蛋白，并將根和葉中表達(dá)變化顯著(差異倍數(shù)≥2或≤-2)且表達(dá)量高的前10個(gè)基因分別列于表3、表4，根中基因簇11中只有3個(gè)基因，至少有一個(gè)樣品的FPKM≥1。結(jié)果表明，這些基因編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCⅡ)、查爾酮合成酶、查爾酮-黃酮異構(gòu)酶、 熱休克蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞色素P450蛋白等。

3 結(jié)論與討論

本研究利用BGISEQ-500平臺(tái)對(duì)鹽堿脅迫不同時(shí)間的平邑甜茶根和葉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共有41 008個(gè)基因被檢測(cè)到表達(dá)，其中已知的基因有 38 465 個(gè)，預(yù)測(cè)的新基因有2 543 個(gè)。基因表達(dá)聚類分析顯示，根和葉中的基因分別聚類成12 個(gè)基因簇，其中，根中基因簇1、10和葉中基因簇8、10基因的表達(dá)被上調(diào)；根中基因簇7、9、11以及葉中基因簇4、7基因的表達(dá)被下調(diào)。表明這些基因可能在平邑甜茶受鹽堿脅迫過(guò)程中持續(xù)起作用。為了解這些基因的功能，對(duì)它們進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，分子功能中的結(jié)合和催化活性富集基因的數(shù)量最多，此外，細(xì)胞組分中的膜、膜部分、細(xì)胞和細(xì)胞器以及生物過(guò)程中的細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程富集基因的數(shù)量也較多。這與葡萄和白刺在鹽脅迫后富集基因數(shù)量最多的是結(jié)合和催化活性的研究結(jié)果[22-23]一致。這些結(jié)果表明結(jié)合和催化活性是植物對(duì)鹽堿脅迫的主要響應(yīng)過(guò)程；膜、膜部分、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞過(guò)程和代謝過(guò)程同樣也在植物響應(yīng)鹽堿脅迫中發(fā)揮重要作用。KEGG富集分析顯示，根和葉中富集基因較多的途徑有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)加工、碳代謝、氨基酸的生物合成、核糖體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在受到鹽、堿脅迫時(shí)，高粱和榆葉梅的碳代謝途徑富集的基因數(shù)量較多[24-25]，表明植物可能需要大量能量來(lái)應(yīng)對(duì)鹽、堿脅迫，并且脅迫可能通過(guò)改變植物碳代謝相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響植物生長(zhǎng)[25]。

表1 根中基因的KEGG 途徑富集分析

表2 葉中基因的KEGG 途徑富集分析

鹽脅迫能引起果樹(shù)葉片凈光合速率下降[26]。葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCⅡ)能夠促進(jìn)光合作用正常進(jìn)行，平邑甜茶葉片中葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHCⅡ)編碼基因(MD09G1292900、MD17G1281900)的表達(dá)量在受到鹽堿脅迫后顯著降低。另外，活性氧還會(huì)在植物體內(nèi)大量積累，為清除這些活性氧，植物會(huì)啟動(dòng)如過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶等酶類保護(hù)體系和類黃酮(黃酮類化合物)、谷胱甘肽、抗壞血酸等非酶類保護(hù)體系[1]。平邑甜茶根中過(guò)氧化物酶編碼基因MD11G1061100的表達(dá)被顯著上調(diào)，而MD13G1053000的表達(dá)被顯著下調(diào)。查爾酮合成酶是類黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[27]，查爾酮-黃酮異構(gòu)酶也在類黃酮合成途徑中起重要作用[28]，類黃酮在抗氧化方面具有重要作用。本研究中平邑甜茶葉片中查爾酮合成酶編碼基因(MD04G1003300、MD04G1003400)和查爾酮-黃酮異構(gòu)酶編碼基因(MD01G1167300、MD07G1233400)的表達(dá)均顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明平邑甜茶在受到鹽堿脅迫后光合作用減弱，并通過(guò)酶類和非酶類保護(hù)體系清除體內(nèi)的活性氧。

熱休克蛋白對(duì)植物熱應(yīng)激損傷的恢復(fù)及提高植物耐熱性具有重要作用[29]，它能穩(wěn)定染色質(zhì)、蛋白質(zhì)和膜，并通過(guò)再折疊促進(jìn)蛋白質(zhì)在脅迫期間或脅迫后的修復(fù)[30]。熱休克蛋白的表達(dá)受溫度或鹽度等環(huán)境條件的影響[31]。NaHCO3脅迫條件下，檉柳根中熱休克蛋白編碼基因的表達(dá)有的被上調(diào)，有的被下調(diào)[30]。在本研究中，5個(gè)熱休克蛋白編碼基因(MD01G1126500、MD01G1144400、MD01G1208700、MD07G1196500、MD13G1108500)的表達(dá)被顯著下調(diào)。熱休克響應(yīng)由2個(gè)重要成員——熱休克蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子組成。熱激轉(zhuǎn)錄因子在熱脅迫防御響應(yīng)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[32]，通過(guò)識(shí)別高度保守的熱休克元件并與‘nGAAnnTCCn’基序特異結(jié)合調(diào)節(jié)熱休克蛋白編碼基因的表達(dá)，來(lái)控制植物對(duì)不同環(huán)境脅迫的反應(yīng)[33-34]。平邑甜茶一個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子編碼基因(MD13G1199700)的表達(dá)被下調(diào)，表明熱休克響應(yīng)可能在平邑甜茶響應(yīng)鹽堿脅迫過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。

表3 根中基因簇中表達(dá)量高且表達(dá)變化顯著(差異倍數(shù)≥2或≤-2)的部分基因

表4 葉中基因簇中表達(dá)量高且表達(dá)變化顯著(差異倍數(shù)≥2或≤-2)的部分基因

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽堿物脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[35-37]。除熱激轉(zhuǎn)錄因子，本研究還發(fā)現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子(MD08G1092000)、WRKY轉(zhuǎn)錄因子(MD04G1167700)、鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域蛋白(MD01G1154000、MD07G1222900)、鋅指蛋白ZAT10(MD01G1041900、MD08G1086500)、鋅指蛋白(MD15G1037200)的表達(dá)被顯著下調(diào)；ORG2轉(zhuǎn)錄因子(MD14G1086500)、COL結(jié)構(gòu)域類轉(zhuǎn)錄因子(MD17G1243400)的表達(dá)被顯著上調(diào)。MYB家族是植物體重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[38]。在干旱和鹽脅迫下，向日葵55 個(gè)MYB基因中有9 個(gè)的表達(dá)被下調(diào)，4 個(gè)被上調(diào)[39]。超表達(dá)AtMYB111的擬南芥耐鹽性強(qiáng)于野生型，而AtMYB111缺失顯著降低了擬南芥耐鹽性[40]。鋅指蛋白是一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，它由CCCH、C2H2、C2HC、C2HC5、C3HC4、C4、C4HC3、C6和C8(C和H分別代表半胱氨酸和組氨酸)9大類組成[41]，在植物耐非生物脅迫方面具有重要作用[42]。本研究中的6 個(gè)鋅指蛋白的編碼基因(MD01G1154000和MD07G1222900屬于CCCH類，MD01G1041900、MD08G1086500、MD04G1167700 和MD15G1037200屬于C2H2類)的表達(dá)均被顯著下調(diào)，可以推測(cè)這些轉(zhuǎn)錄因子與平邑甜茶抗鹽堿調(diào)控密切相關(guān)。

細(xì)胞色素P450是一個(gè)酶蛋白大家族[43]。它們參與細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、赤霉素等植物內(nèi)源激素的生物合成以及許多次生代謝[44-45]。Khanom等研究發(fā)現(xiàn)，人參中PgCYP736A12在NaCl處理后轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，該基因參與除草劑的代謝[46]。本研究中1 個(gè)細(xì)胞色素P450編碼基因MD11G1220400的表達(dá)受鹽堿脅迫誘導(dǎo)而持續(xù)升高，表明細(xì)胞色素P450可能在平邑甜茶鹽堿響應(yīng)的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶和TMK1受體蛋白激酶等的表達(dá)也受鹽堿脅迫的誘導(dǎo)，說(shuō)明這幾類蛋白激酶在平邑甜茶鹽堿脅迫響應(yīng)中也可能發(fā)揮一定作用。研究中還發(fā)現(xiàn)一些未知蛋白可能與鹽堿脅迫相關(guān)，如MD14G1226200、MD02G1030600、MD15G1189900 和MD08G1127700等，它們的具體功能有待進(jìn)一步驗(yàn)證。