睪丸間質細胞傳代、凍存、復蘇初步研究

文│呂雙陽（山東省海陽市二十里店鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站）

隨著對細胞的不斷傳代，優(yōu)勢細胞逐漸生長，傳代培養(yǎng)的細胞梭形占比逐漸加大，而生長速度慢或是生長活力低的細胞會被逐漸淘汰。細胞凍存復蘇后的狀態(tài)與凍存保護劑種類、凍存時間、凍存方式、細胞復蘇方法等有關，也與各種生物學試驗結果有關。為了更好地建立細胞庫，實現(xiàn)其相應價值，筆者對此進行了試驗探索，下面則是具體的試驗過程和相關結論。

一、材料與方法

1.主要試劑。RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO）、胎牛血清（HyClone）、Ⅱ型膠原酶（Sigma）、胰酶、臺盼藍、二甲苯。

2.試驗動物。健康3周齡的榮昌公豬。為了增強試驗效果的普遍適用性，本次選擇過程采取隨機選擇的方式，盡量降低人為干擾。

3.試驗方法與檢測方法。試驗方法及檢測方法都會對最終的結果產生一定的影響，因而為了選擇更佳的榮昌仔豬睪丸間質細胞傳代及凍存復蘇培養(yǎng)方法，筆者嘗試進行如下方法。

（1）仔豬睪丸間質細胞的傳代及凍存與復蘇。睪丸間質細胞的傳代培養(yǎng)：為了試驗的精準性，在睪丸間質細胞傳代培養(yǎng)過程中有很多注意事項，下面對此進行具體剖析。進入試驗階段的原代細胞需要經過一定的篩選和過濾，這不僅是為了試驗的精準性，同時也是為了更好地普及和推廣相應方法?；驹瓌t為：細胞單層大概要長到95%左右最好，然后舍棄其中的營養(yǎng)液。先用新鮮培養(yǎng)液清洗、棄去，然后加入1～2毫升的0.25%胰酶，靜置5～10分鐘，棄去胰酶后加入培養(yǎng)液，用吸管吸取培養(yǎng)液，并反復吹打培養(yǎng)瓶瓶壁細胞，形成細胞懸液。將細胞懸液吸入10毫升離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)液，移入新的培養(yǎng)瓶中，37℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。24小時后換液，以后每天換液一次。

睪丸間質細胞的凍存與復蘇。細胞凍存：選用傳代第一次的細胞，細胞消化同傳代培養(yǎng)的方法，將細胞懸液收集至離心管中，1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，細胞沉淀中加入凍存培養(yǎng)液（含10%的DMSO），移入凍存管中，計數(shù)，細胞濃度為5×106/毫升左右。

采用兩種方法對細胞進行凍存。

慢凍方法：將培養(yǎng)的細胞分為4組，然后分批次、分溫度、分時間進行冷凍，具體溫度和時間如下：首先將凍存管放到4℃的冰箱中，靜置40分鐘，然后放到-20℃的冰箱中0.5～1小時，之后將其放到-80℃的冰箱中，這種冰箱屬于超低溫冰箱，此時需要將凍存管進行過夜放置，最后將其放到液氮罐中保留。這種方法環(huán)節(jié)較多且操作嚴格，需要格外細致。

快凍方法：第一步與慢凍方法一致，也是劃為4組，將凍存管（管口要朝上）放到紗布袋內，放入-80℃超低溫冰箱中過夜，第二天就可以觀察其變化，然后直接放入液氮罐中保存。雖然快凍方法中突出的是速度、時間問題，但其中所要注意的事項也不容忽視，尤其是紗布清潔度、溫度控制及第二天的觀察精細度等也都要格外注意。

細胞復蘇：既然是復蘇就需要有一個解凍過程，具體操作步驟如下：首先從液氮罐中提取細胞，整個過程中也應注意清潔度、緩慢度，確保提取出來的細胞生命體征及特點不受外界因素干擾。然后放到適宜的溫度中進行融化，溫度約為38℃，融化時間控制在1分鐘左右即可，然后用培養(yǎng)液稀釋，低速離心10分鐘，棄去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。將細胞懸液與0.4%臺盼藍染液以9∶1比例混勻，并取少量混合液滲入計數(shù)板和蓋玻片的間隙中，血球計數(shù)板計數(shù)，細胞復蘇率的計算公式如下：

復蘇率/%＝（活細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100

總之，復蘇過程相對復雜，涉及的環(huán)節(jié)比較多，在試驗過程中要格外注意。

（2）仔豬睪丸間質細胞的鑒定。臺盼藍染色的活力測定：臺盼藍染色的活力測定需要一定的配比控制，具體將細胞懸液與0.4%臺盼藍染液按9∶1的比例混勻。取少量混合液滲入到計數(shù)板和蓋玻片的間隙中，在顯微鏡下計數(shù)，主要觀察藍色的死細胞數(shù)量變化以及無色透明的活細胞數(shù)量變化，活細胞就代表細胞的活力，活細胞越多會導致活細胞率逐漸提升，具體計算公式如下：

活細胞率/%＝[活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)＋死細胞總數(shù)）]×100

3β-HSD細胞純度鑒定：在倒置顯微鏡下觀察經3β-HSD染色的細胞懸液，細胞質中會出現(xiàn)一些藍色顆粒狀細胞，這就是常說的睪丸間質細胞。此時用陽性來代表純度，純度鑒定由此展開，具體計算公式如下。

陽性細胞率/%＝（3β-HSD陽性細胞數(shù)÷總細胞數(shù)）×100

二、試驗結果

1.仔豬睪丸間質細胞傳代及凍存與復蘇。

（1）睪丸間質細胞傳代生長狀況。傳代細胞經過1天左右的變化就可以觀測到睪丸間質細胞貼壁的動態(tài)，基本是次日開始出現(xiàn)觸角，此時隨著代數(shù)的不斷增多，細胞梭形也會開始產生變化，如占比逐漸提升。如圖1、圖2。

（2）睪丸間質細胞凍存與復蘇結果。本試驗中應用的凍存劑是10%二甲亞砜，其具有分子量小、溶解能力強、滲透能力強等特點，也是應用最廣的凍存保護劑。試驗采用兩種不同的冷凍方法后發(fā)現(xiàn)，采用慢凍方法冷凍后細胞復蘇率較高。冷凍速度對細胞內部的影響十分明顯，尤其是生理變化值得探究。經過試驗可以得出如下結論，冷凍速度直接會影響細胞水分及體積，具體表現(xiàn)特征為如果冷凍速度偏慢，細胞脫水問題比較明顯，導致細胞體積縮小，一旦達到一定程度，細胞活性將會受到影響，這種影響屬于溶質性損害。如果冷凍速度偏快，細胞內部的冰晶也會受到一定影響，直接影響融化速度。兩種凍存方法比較發(fā)現(xiàn)，慢凍方法的細胞復蘇率大于快凍方法的細胞復蘇率，復蘇率見表1。

由表1可知，凍存方法不同，細胞復蘇率也呈現(xiàn)一定變化，雖然本次試驗分為4組，但通過橫向對比可以看出，不論哪組都可以很好地證明慢凍方法的細胞復蘇效果更好。這也很好地詮釋了凍存、復蘇之間的關系。

表1 兩種凍存方法的復蘇率 %

三、討論

在細胞體外培養(yǎng)中，為了試驗實際操作，需要長期保存細胞的生物活性，細胞凍存與復蘇是經常使用的試驗操作。細胞凍存復蘇后的狀態(tài)與凍存保護劑的種類、凍存時間、凍存方式、細胞復蘇方法等有關，也與各種生物學試驗結果有關。

試驗采用兩種不同的冷凍方法，即慢凍方法和快凍方法，結果發(fā)現(xiàn)，慢凍方法冷凍后細胞復蘇率較高。也有研究發(fā)現(xiàn)，兩種方法之間的過渡方法凍存復蘇后，細胞復蘇率高于其他兩種凍存方法，這可能與試驗材料、試驗方法有關。

因此，在細胞復蘇過程中對溫度控制和觀察力度都要格外注意，因為溫度變化會影響解凍速度，觀察的敏銳性可以很好地進行調整。因此，需要思考如何在不影響細胞質量的前提下進行緩慢解凍，既可以保證細胞復蘇的進程，同時又可以很好地控制細胞損傷度，雖然存在一定難度，但只要協(xié)調就可以很好地為細胞庫建立和細胞活性保持提供更強的后盾。

◎圖1 傳代1天的睪丸間質細胞（100×）

◎圖2 傳代3天的睪丸間質細胞（100×）