我國不同產(chǎn)地黨參指紋圖譜分析比較

黃延盛，張欣，劉耀軍，胡流云，王長虹，王崢濤，黃曉君

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623；2.上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203；3.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江西省生物活性多糖實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

黨參屬（Codonopsis）隸屬桔?？疲–arnpanulaceae），全屬共40余種，我國有39種。野生黨參主要分布于西南各省區(qū)，栽培黨參則主產(chǎn)于西北、華北地區(qū)[1]。本屬植物黨參 [Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]、素花黨參[C.pilosula var.modesta（Nannf.）L.T.Shen]及川黨參（C.tangshen Oliv.）為2010版《中國藥典》收錄品種，其干燥根作為黨參入藥，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺功效[2-4]，可用于治療脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等癥[5-6]。黨參屬大多種類的根部均具有藥用價值，一些種類如管花黨參（C.tubulosa Kom.）、球花黨參（C.subglobosa Srnith.）、灰毛黨參（C.canescens Nannf.）、新疆黨參[C.clematidea（Schrenk）Clarke.]等在臨床上也作為黨參使用?，F(xiàn)代研究表明，黨參多糖具有保護(hù)胃黏膜、調(diào)節(jié)人體免疫、改善胃腸炎癥等作用[7-9]。

在《中國藥典》2010年版（一部）中，黨參只有醇溶性浸出物、薄層定性鑒別等指標(biāo)，無法全面評價和控制黨參質(zhì)量。有研究以薄層掃描法測定黨參中甾類或三萜類成分來控制黨參質(zhì)量，但甾類或三萜類成分不是黨參特有成分，缺乏專屬性?，F(xiàn)有關(guān)于黨參甙I的研究，主要集中在山西產(chǎn)黨參，缺乏對多產(chǎn)地品種進(jìn)行系統(tǒng)全面研究，難以成為表征黨參質(zhì)量的指標(biāo)[10]。蒼術(shù)內(nèi)酯III只存在于黨參（C.pilosula）中，素花黨參（C.Pilosula var.modesta）和川黨參（C.tangshen）中則不含有此成分，而在菊科、金粟蘭科中有分布，不能全面準(zhǔn)確反映《中國藥典》收錄的黨參類種類的質(zhì)量。黨參炔苷在黨參類種間、產(chǎn)地間相差懸殊。通過黨參指紋圖譜，可對不同品種和不同產(chǎn)地黨參的質(zhì)量進(jìn)行快速定性分析。此外，對黨參中黃酮類、氨基酸和微量元素的含量以及揮發(fā)油的組分和含量進(jìn)行測定，同樣因缺乏專屬性或尚未建立穩(wěn)定可靠的方法也不能作為黨參定性、定量的依據(jù)[11-12]。因此建立一種有效的方法來控制黨參質(zhì)量顯得尤為重要[13]。

黨參的指紋圖譜[14]已有眾多報(bào)道，主要集中在黨參炔苷（lobetyolin）、蒼術(shù)內(nèi)酯 III（atractylenolide III）等成分，而且多采用高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行指紋圖譜的建立，分析時間一般在60 min以上，很少采用超高速液相色譜儀（ultra performance liquid chromatography，UPLC）進(jìn)行黨參指紋圖譜分析[15-16]。本研究通過超高速液相色譜儀[17]對不同產(chǎn)地不同品種黨參進(jìn)行指紋圖譜分析，在黨參指紋圖譜的基礎(chǔ)上，生成具有9個特征峰的黨參特征圖譜，采用相似度分析、主成分分析對特征圖譜進(jìn)行評價。通過對主要產(chǎn)地和品種黨參指紋圖譜的分析及比較，為后續(xù)選擇適宜品種黨參作為食品或加工原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

35批黨參主要來源于甘肅、貴州、山西、湖北、重慶黨參主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心吳立宏研究員鑒定，其性狀與2015年版《中國藥典》所規(guī)定的黨參一致，鑒定為正品。具體信息見表1。

表1 黨參信息匯總Table 1 Information of Codonopsis pilosula

續(xù)表1 黨參信息匯總Continue table 1 Information of Codonopsis pilosula

乙酸乙酯、甲醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）：美國Fisher公司；紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品、蒼術(shù)內(nèi)酯III標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）：上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心；黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗儀：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；DFT-50型手提式高速粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；RE-56旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；PB203-N電子天平：上海分析儀器廠；PBL-M型離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；METTLER200型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；Waters ZQ 2000型單四極桿質(zhì)譜儀（Masslynx V4.1色譜工作站包，Waters Acquity PDA二極管陣列檢測器）、Acquity UPLCHSS T3 C18色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

黨參共35份樣本，從每份樣本中挑選200 g無霉變、外觀良好的黨參用粉碎機(jī)粉碎，過3號篩備用。

1.3.2 黨參主要成分測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

分別稱取紫丁香苷、阿魏酸、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III 4 種黨參標(biāo)準(zhǔn)品 6.32、10.12、8.14、9.67 mg，使用純化水溶解后分別定容于25 mL容量瓶中作為貯備液，貯備液濃度分別為紫丁香苷0.252 8 mg/mL、阿魏酸0.404 8 mg/mL、黨參炔苷0.325 6 mg/mL、蒼術(shù)內(nèi)酯III 0.386 8 mg/mL。吸取適量上述4種標(biāo)準(zhǔn)品貯備液于50 mL容量瓶中，作為稀釋一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的原液。

1.3.2.2 進(jìn)樣前處理

精密稱取黨參粉末置于100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯，超聲輔助提?。üβ?50 W、頻率40 kHz）30 min后過濾，收集乙酸乙酯提取液，置于25 mL梨形燒瓶中，減壓濃縮至干；沉淀再加80%甲醇溶液，超聲輔助提?。üβ?50 W、頻率40 kHz）50 min；收集醇提液，置于同一25 mL梨形燒瓶中，減壓濃縮至干，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)樣至UPLC，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2.3 色譜條件

流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）。梯度洗脫：0～14 min，0.5%～20%（A）；14 min～18.5 min，20%～30%（A）；18.5 min～23 min，30%～50%（A）；23 min～30 min，50%～98%（A）；30 min～32 min，98%（A）；32 min～34 min；98%～0.5%（A）。流速0.2 mL/min、柱溫30℃、檢測波長240nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004A版）軟件對35批的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。采用SIMCA13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參指紋圖譜檢測方法建立

選取色譜圖中12個具有代表性且分離度良好的色譜峰，其中3個色譜峰為已確認(rèn)的紫丁香苷、黨參炔苷、蒼術(shù)內(nèi)酯III，其余9個色譜峰以出峰時間（6.38、6.67、8.19、13.75、15.72、16.18、17.64、17.87、19.27 min）為標(biāo)記對象。

2.1.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

取 S12 樣品分別于 0、1、2、4、8、12、24、36 h 進(jìn)樣檢測。以黨參炔苷色譜峰（7號峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積，結(jié)果見表2。

表2 素花黨參（S12）、川黨參（S28）、黨參（S29）穩(wěn)定性試驗(yàn)相對保留時間、相對峰面積Table 2 Relative retention schedule and peak area of stability experiment of Codonopsis pilosula var.mdesta（S12），C.tangshen（S28）and Codonopsis pilosula（S29）

由表2可知，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于3%（n=6）。表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

分別取供試品溶液S12、S28、S29，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以黨參炔苷（7號峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積，結(jié)果見表3。

表3 素花黨參（S12）、川黨參（S28）、黨參（S29）精密度試驗(yàn)相對保留時間、相對峰面積Table 3 Relative retention schedule and peak area of precision experiment of Codonopsis pilosula var.mdesta（S12），C.tangshen（S28）and Codonopsis pilosula（S29）

由表3可知，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

分別精密稱取6份S12、S28、S29黨參樣品粉末，按1.3.2.2方法制備樣品溶液。液相進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。以黨參炔苷色譜峰（7號峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積，結(jié)果見表4。

表4 素花黨參（S12）、川黨參（S28）、黨參（S29）重復(fù)性試驗(yàn)相對保留時間、相對峰面積Table 4 Relative retention schedule and peak area of replication experiment of Codonopsis pilosula var.mdesta（S12），C.tangshen（S28）and Codonopsis pilosula（S29）

由表4可知，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%（n=6），表明檢測方法重復(fù)性良好。

2.2 相似度分析

2.2.1 素花黨參、川黨參和黨參相似度分析

采用中位數(shù)法，以S12為參照譜，生成素花黨參對照指紋圖譜；以S28為參照譜，生成川黨參對照指紋圖譜，以S29為參照譜，生成黨參對照指紋圖譜。素花黨參對照指紋圖譜中確定7個特征峰，生成素花黨參特征圖譜。川黨參對照指紋圖譜中確定6個特征峰，生成川黨參特征圖譜。黨參對照指紋圖譜中確定5個特征峰，生成黨參特征圖譜，具體結(jié)果見圖1。

圖1 相似度分析圖譜Fig.1 Similarity analysis atlas

以S12為參照譜，對35批黨參樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見表5。

表5 35批樣品相似度分析結(jié)果Table 5 Similarity analysis results of 35 batches of samples

續(xù)表5 35批樣品相似度分析結(jié)果Continue table 5 Similarity analysis results of 35 batches of samples

由表5可知，3種黨參整體相似度在0.35～0.85，35批樣品相似度差異較大，說明3種黨參指紋圖譜之間差異較大，有必要分別對其進(jìn)行相似度分析。

2.2.2 素花黨參（C.pilosula.var.modesta）相似度分析

以S12為參照譜，對19批黨參樣品色譜圖進(jìn)行相似度分析，19批素花黨參整體相似度范圍在0.36～0.87，存在較大種間差異，原因可能是19批樣品產(chǎn)自不同產(chǎn)地[18]。甘肅省文縣的素花黨參（S1、S2），甘肅省渭源縣不同村落的白條黨參（S4～S10），指紋相似度均在0.6～0.7之間，證明產(chǎn)自同一產(chǎn)區(qū)指紋相似度較高；樣品S13和S14產(chǎn)自同一黨參實(shí)驗(yàn)基地，使用壯根靈的14號樣品相似度（0.65）較未使用壯根靈13號樣品相似度（0.52）高，說明使用壯根靈對黨參的生長有促進(jìn)作用。

鑒于19批素花黨參批間一致性較差，因此對19批素花黨參進(jìn)行批間主成分分析，19批樣品的偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）見圖 2。

圖2 素花黨參樣品主成分分析PLS-DA圖Fig.2 Principal component analysis（PLS-DA）of Codonopsis pilosula var.mdesta

由圖2可知，19批素花黨參主要被分為3組，產(chǎn)自貴州省遵義市陽溪鎮(zhèn)的S11樣品進(jìn)行了單獨(dú)分類，其余的樣品分居Y軸兩側(cè)，較密集區(qū)域多產(chǎn)自甘肅省渭源縣黨參十里鎮(zhèn)示范園試驗(yàn)田及農(nóng)民專業(yè)合作社；也有產(chǎn)自甘肅省渭源縣不同村落的白條黨，如S5、S6、S7、S8，說明素花黨參也存在組內(nèi)差異，這是造成素花黨參間整體相似度不高的主要原因。

2.2.3 川黨參（C.tangshen）相似度分析

以S20為參照譜，對9批川黨參色譜圖進(jìn)行相似度分析，9批川黨參的整體相似度不高，取值在0.47～0.80。S20～S24產(chǎn)自湖北省恩施板橋鎮(zhèn)的不同村落，S25、S26分別為來自重慶巫山的廟黨，其中S25為主根，S26為須根，二者在7號峰的含量上存在差異，須根（S26）為主根（S25）的兩倍左右，說明此物質(zhì)多集中于須根生長；S27、S28分別為產(chǎn)自湖北省恩施市的精裝白條黨參和精裝毛條黨參；其中3號峰為S28獨(dú)有，含量約為0.12 mg/g，較其他色譜峰含量適中。川黨參的另一個特點(diǎn)是蒼術(shù)內(nèi)酯III的含量較素花黨參低，生長年限4～5年的川黨參幾乎不含蒼術(shù)內(nèi)酯III，只有生長年限為2年的樣品S23含有極少的蒼術(shù)內(nèi)酯III（低于千分之一），這說明蒼術(shù)內(nèi)酯III不是川黨的特征峰，含量與生長年限也有一定的相關(guān)性，生長年限越久，蒼術(shù)內(nèi)酯III含量越低。

相似度分析結(jié)果表明：川黨作為黨參基源的一種黨參，與其他品種黨參區(qū)別明顯，有必要對其分別進(jìn)行質(zhì)量控制。所建立的特征圖譜對其具有鑒別意義[19]。

圖3為9批川黨參成分的主成分分析。

圖3 川黨參樣品主成分分析PLS-DA圖Fig.3 Principal component analysis（PLS-DA）of C.tangshen

由圖3可知，9批川黨參被聚為2類，其中樣品S26為產(chǎn)自重慶巫山的廟黨，S27為湖北恩施的精裝白條黨，其余批次主要來自湖北恩施的板黨，一致性較好，被聚為一組。

2.2.4 黨參（C.pilosula）相似度分析

以S29為參照譜，對7批黨參進(jìn)行相似度分析，7批黨參的整體相似度不高，取值在0.48～0.79。樣品S29～S32產(chǎn)自同一產(chǎn)地，S29和S30為對照，未施農(nóng)藥S29蒼術(shù)內(nèi)酯III的含量超過施過農(nóng)藥S30的3倍，推測農(nóng)藥的使用對蒼術(shù)內(nèi)酯III的含量也有一定的影響，農(nóng)藥的使用量越大，蒼術(shù)內(nèi)酯III的含量越低。S33為野生黨參，此樣品色譜信息最為豐富，因此相似度也最低，僅為 0.48（S29為參照譜）。黨參（C.pilosula）指紋圖譜與素花黨參（C.pilosula.var.modesta）指紋圖譜較為相似，主要差異是素花黨參存在2號峰和4號峰（丁香苷），并且這兩個物質(zhì)在素花黨參中含量也相對較少，因此僅以相似度分析很難區(qū)分黨參（C.pilosula）和素花黨參（C.pilosula.var.modesta），需進(jìn)一步進(jìn)行聚類分析和主成分分析[20]。

對7批產(chǎn)自山西省陵川縣以及貴州威寧的黨參（C.pilosula）進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，樣品S33和S35在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析分析時缺少色譜信息，而未被納入數(shù)據(jù)分析中，因此缺少分組信息?？梢园l(fā)現(xiàn)產(chǎn)自山西的這幾批黨參（C.pilosula）被分為了兩類，其中S29和S30為一組對照組，二者一致性較好，其余批次黨參（C.pilosula）較離散。

圖4 黨參樣品主成分分析PLS-DA圖Fig.4 Principal component analysis（PLS-DA）of Codonopsis pilosula

2.3 主成分分析

以 35批黨參（C.pilosula）、素花黨參（C.pilosula.var.modesta）、川黨參（C.tangshen）樣品為研究對象，以黨參炔苷為參照峰，將各特征峰相對峰面積作為原始數(shù)據(jù)矩陣，結(jié)果見圖5。

由圖5A可知，35批樣品主要聚為3類，川黨參（C.tangshen）均位于 X 軸左側(cè)，而黨參（C.pilosula）和素花黨參（C.pilosula.var.modesta）均位于X軸右側(cè)，黨參（C.pilosula）居Y軸右上方，素花黨參（C.pilosula.var.modesta）居 Y 軸右下方；9批川黨參（C.tangshen）分布較為緊密，只有28號樣品較為離散，究其原因是28號樣品有一獨(dú)特的3號色譜峰，被歸到了素花黨參（C.pilosula.var.modesta）的區(qū)域；素花黨參（C.pilosula.var.modesta）較為離散，樣品種間差異較大；S16（十里鎮(zhèn)）離其余素花黨參較遠(yuǎn)。7批黨參（C.pilosula）分布也較為離散，其中33號樣品偏離較遠(yuǎn)，原因在于33號樣品是35批中唯一一批野生黨參，其1、5、7、9號特征峰較同批次的黨參（C.pilosula）含量高；并且色譜保留時間在14 min～20 min的色譜信息非常豐富，這與指紋相似度結(jié)果一致。由圖5B可知，6號峰、1號峰、5號峰的VIP值均大于1.0。其中，6號峰為川黨（C.tangshen）參特征峰，1號峰和5號峰為三者共有峰，這些峰對黨參（C.pilosula）、素花黨參（C.pilosula.var.modesta）、川黨參（C.tangshen）的分類具有顯著性。

圖5 黨參樣品主成分分析結(jié)果Fig.5 Principal component analysis of Codonopsis pilosula

3 結(jié)論

本文對我國主要黨參產(chǎn)區(qū)（甘肅、貴州、山西、湖北、重慶）的不同品種（黨參C.pilosula；素花黨參C.pilosula var.mdesta；川黨參C.tangshen）黨參分別建立了3種基源黨參的指紋圖譜。同時對3種基源黨參的相似度進(jìn)行了研究分析。結(jié)果表明，3種基源黨參的相似度跨度范圍均較大，說明在不同產(chǎn)地的同一品種黨參化學(xué)成分含量及種類變化較大。主成分分析表明，湖北恩施產(chǎn)川黨參分布較為集中，批間一致性較好。而黨參和素花黨參批間差異較大，這和種植范圍廣有一定的關(guān)系。通過對主要產(chǎn)地和品種黨參指紋圖譜的分析及比較，為后續(xù)選擇適宜品種黨參作為食品或加工原料時提供一定的理論參考。