苦蕎總黃酮對酒精性脂肪肝細胞的作用

劉怡，張娜，吳萌萌，嚴馨，李姝，2，王松濤，沈才洪，黃敏，趙建*

（1.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064；2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川 瀘州 646000；4.四川省原子能研究院，四川 成都 610101）

苦蕎麥俗稱苦蕎，學名韃靼蕎麥[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn]，是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）雙子葉植物中的一種藥食兩用的小宗雜糧[1]。就其食用價值而言，被譽為“五谷之王”的苦蕎麥常作為飲料、酒類以及面食中的添加物[2]。就其藥用價值而言，苦蕎黃酮已被證實在人體抗氧化[3]、清除自由基、降“三高”[4-7]等方面均有作用，因此又被譽為“三降食品”。

目前，許多研究已證實長期飲酒或是過度飲酒會對人體肝臟產生負面影響，造成肝臟解毒能力降低，最終誘發(fā)酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）[8]。酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）是 ALD 的早期階段，若未及時治療還會誘發(fā)一系列炎癥反應。相關研究表明，長期飲酒發(fā)展為酒精性脂肪肝?。╝lcoholic fatty liver disease，AFLD）的概率為 90%[9]。目前，在臨床上治療AFLD主要是通過戒酒和在戒酒過程中補充高蛋白食物以及多種維他命和葉酸來進行營養(yǎng)支持。同時，還可以通過藥物來改善AFLD患者的臨床癥狀和生物化學指標，但近40年來有關治療AFLD的藥物研究并未取得明顯進展[10-11]。

前期研究了苦蕎總黃酮（total flavonoids of tartary buckwheat，TFTB）的制備及成分分析[12]，并證實了TFTB的體外抗氧化活性及解酒作用[13]。目前對于TFTB能緩解AFLD的機制研究尚不完全。因此，本實驗采用0.9%乙醇和0.01%硫酸亞鐵體外誘導L-02細胞，擬進一步探究TFTB是否具有體外抑制AFL細胞脂肪變性、氧化損傷以及降低細胞內炎性因子的作用，為TFTB緩解AFLD的機制研究及苦蕎黃酮類解酒護肝產品的開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎總黃酮：黃酮總含量為79.5%，由四川省資源微生物與生物技術重點實驗室制備；L-02細胞：四川省資源微生物與生物技術重點實驗室保藏。

RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%乙二胺四乙酸-胰酶（ethylenediamine tetraacetic acid-trypsin，EDTA-trypsin）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）：美國賽默飛世爾科技公司；油紅O染液、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：北京索萊寶科技有限公司；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）試劑盒：南京建成生物工程研究所；細胞增殖-毒性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）：賽國生物科技有限責任公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、白介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒、白介素-8（interleukin-8，IL-8）試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CO2培養(yǎng)箱（3111）、連續(xù)波長酶標儀（Multiskan go）、生物安全柜（1389）：美國賽默飛世爾科技公司；低速離心機（TDZ5B-WS）：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；倒置顯微鏡（DIAPHOT）：日本尼康公司；紫外分光光度計（UV-2600）：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

用RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%FBS）對37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內生長狀態(tài)正常的L-02細胞進行培養(yǎng)，每2 d～3 d 換液 1 次；每 4 d～6 d，使用 0.25%EDTA-胰酶37℃消化3 min～5 min，待細胞呈流沙狀脫落時停止消化，進行傳代培養(yǎng)和細胞凍存[14]。

1.3.2 CCK-8法篩選AFL細胞模型乙醇誘導濃度

取T25培養(yǎng)瓶中融合度達80%的L-02細胞，使用0.25%EDTA-胰酶37℃消化3 min～5 min，待細胞呈流沙狀脫落時停止消化，計數(shù)后接種于96孔培養(yǎng)板內，使每孔細胞數(shù)為5×103個。置于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h后，設置乙醇組、硫酸亞鐵組、空白對照組。乙醇組：L-02細胞懸液中乙醇體積終濃度分別為0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%；硫酸亞鐵組：L-02細胞懸液中FeSO4質量終濃度為0.01%；空白對照組：僅含L-02細胞懸液。于上述條件下培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，再培養(yǎng) 50 min，使用連續(xù)波長酶標儀檢測并記錄各孔OD450值，計算細胞活性，計算公式為細胞活性/%=[（實驗組OD值-空白OD值）/（空白對照組OD值-空白OD值）]×100[15]。實驗重復3次，每組3個復孔。

1.3.3 AFL細胞模型的建立

取T25培養(yǎng)瓶中融合度達80%的L-02細胞，按照1.3.2中的消化條件進行消化，計數(shù)后接種于6孔培養(yǎng)板內，使每孔細胞數(shù)為6×105個。細胞貼壁后，將實驗設為空白對照組、陰性對照組、模型組?？瞻讓φ战M：僅含L-02細胞懸液；陰性對照組：L-02細胞懸液中FeSO4質量終濃度為0.01%；模型組：向陰性對照組中添加乙醇，使乙醇體積終濃度為1.3.2中篩選濃度。5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，2 d換液1次，4 d傳代1次。誘導至第4代，命名為H4。使用油紅O染色法并測定各組細胞上清液中TG、AST、ALT含量以檢測AFL細胞模型是否構建成功[16]。實驗重復3次，每組3個復孔。

1.3.4 CCK-8法篩選TFTB作用濃度

參考1.3.2中的方法，設置以下組別，空白對照組：僅含L-02細胞懸液；實驗組：L-02細胞懸液中TFTB質量終濃度分別為 10、20、40、80、160、320 μg/mL[17]。實驗重復3次，每組3個復孔。

1.3.5 TFTB處理模型組細胞

參考1.3.3中6孔培養(yǎng)板接種方法接種細胞，待細胞貼壁后設置以下組別?？瞻讓φ战M：僅含L-02細胞懸液；處理前H4組：僅含H4組細胞懸液；TFTB處理組：向H4組細胞懸液中添加TFTB，使TFTB作用濃度為1.3.4中篩選濃度。37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，2 d換液1次，觀察16 d并收集各組細胞上清液。實驗重復3次，每組3個復孔。

1.3.6 生化指標檢測

對1.3.5中收集的各組細胞上清液進行生化指標檢測，測定 TG、ALT、AST、MDA、NEFA、T-SOD、GSH-Px水平，均按照試劑盒說明書進行操作。同時，采用酶聯(lián)免疫吸附法[18]測定各組細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad Prism 8進行數(shù)據(jù)分析與作圖。數(shù)據(jù)表示為（平均值±標準差），通過單因素方差分析（Oneway ANOVA）進行組與組之間的統(tǒng)計學比較，p＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 乙醇誘導濃度的確定

不同濃度的乙醇對L-02細胞的影響結果見表1。

表1 不同濃度的乙醇對L-02細胞生長的影響Table 1 Effect of C2H5OH at different concentration on the growth of L-02 hepatocytes

由表1可知，在本實驗中，空白對照組細胞活性設為100%。與空白對照組相比，0.01%硫酸亞鐵組細胞活性為100.77%，表明0.01%硫酸亞鐵對細胞活性無明顯影響；0.1%乙醇組細胞活性為100.54%，表明當乙醇濃度為0.1%時對細胞活性無明顯影響，并且還可略微促進細胞生長；1.3%和1.7%乙醇組細胞活性分別為84.71%、77.28%，分別降低了15.29%和22.72%，差異高度顯著（p＜0.000 1），顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞體積增大、邊緣模糊、胞內有較多雜質，細胞大量脫壁，細胞活性明顯降低；0.5%和0.9%乙醇組細胞活性分別為96.11%、87.22%，雖然分別降低了3.89%、12.78%，但在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞體積只略微增大，活細胞數(shù)目仍然較多，脫壁細胞較少。阮雪青[19]的研究表明，構建體外AFL模型時為在細胞功能衰退前獲得AFL的若干指標，通常選擇較高乙醇濃度和較短誘導時間。因此，本實驗選擇0.9%乙醇濃度來構建AFL細胞模型，該濃度乙醇對細胞形態(tài)及貼壁能力影響較小，且乙醇濃度適中，可縮短誘導時間，提高誘導效果。

2.2 細胞模型的鑒定

2.2.1 油紅O染色倒置顯微鏡觀察結果

油紅O染色倒置顯微鏡觀察結果見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下油紅O染色結果Fig.1 Results of oil red O staining under inverted microscope

經油紅O染色后，通過倒置顯微鏡可觀察到空白對照組（圖1A）與陰性對照組（圖1B）中有少數(shù)被染成橘紅色的脂滴正常分布于細胞內；模型組（圖1C）細胞中出現(xiàn)大量橘紅色脂滴，呈連珠狀有序排列，集中分布于細胞膜周圍，表明0.9%乙醇和0.01%FeSO4共同誘導后的H4細胞產生了脂肪累積，AFL細胞模型構建成功。

2.2.2 細胞上清液肝功能指標驗證

TG是人體內含量最多的脂類，其含量通常保持在一定范圍內，過度飲酒會導致TG升高，產生脂肪累積[20]。AST和ALT常被用來反映肝細胞損傷程度，乙醇作用于L-02細胞導致AFLD發(fā)生發(fā)展的過程中會伴隨著細胞膜通透性增加，AST、ALT從細胞內釋放，細胞上清液中AST、ALT水平升高[21]。當L-02細胞經乙醇誘導至第4代，各組細胞上清液中TG、AST和ALT的變化結果見表2。

由表2可知，與空白對照組比較，陰性對照組細胞上清液中 TG、AST、ALT 含量無顯著差異（p＞0.05）；模型組細胞上清液中TG、AST、ALT含量分別上升了185.71%、790.48%、193.44%，具有高度顯著差異（p＜0.0001）。以上結果表明，空白對照組細胞通過0.9%乙醇和0.01%FeSO4的誘導轉化成模型組細胞，且胞內產生了脂肪累積與變性，同時伴隨細胞膜的損傷，造成ALT、AST大量滲漏到細胞上清液中，與卜曉芬等[17]、Kong等[22]的研究結果一致。因此，經0.9%乙醇和0.01%FeSO4誘導后的H4細胞上清液指標發(fā)生變化且符合酒精肝指標變化趨勢，AFL細胞模型構建成功。

表2 各組細胞上清液TG、AST和ALT的變化Table 2 Levels of TG，AST and ALT in supernatant of cells

2.3 TFTB作用濃度的確定

使用 10、20、40、80、160、320 μg/mL TFTB 處理 H4細胞48 h后，H4細胞活性見表3。

表3 不同濃度的TFTB對H4細胞生長的影響Table 3 Effect of TFTB at different concentration on the growth of H4cells

由表3可知，與空白對照組相比，TFTB濃度大于80 μg/mL時，H4細胞活性下降明顯且低于80%，差異高度顯著（p＜0.000 1）；10、20、40 μg/mL TFTB 處理組細胞活性分別為102.53%、99.92%、96.37%，對H4細胞分裂生長無顯著影響（p＞0.05），但低濃度的TFTB會延長處理時間，降低作用效果；而80 μg/mL TFTB處理組細胞活性為84.55%，雖有所降低，但顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)活細胞數(shù)目仍較多且形態(tài)與空白對照組接近。同時，該作用濃度適中，節(jié)約處理時間，提高作用效果。因此，選擇80 μg/mL作為TFTB的作用濃度。

2.4 TFTB對AFL細胞的影響

2.4.1 TFTB對AFL細胞上清液中肝功能指標TG、AST、ALT水平的影響

各組細胞上清液中TG、AST和ALT的變化見表4。

表4 各組細胞上清液TG、AST和ALT的變化Table 4 Levels of TG，AST and ALT in supernatant of cells

由表4可知，與處理前H4組比較，經80μg/mL TFTB處理后細胞上清液中TG、AST、ALT高度顯著減少（p＜0.000 1），分別降低了15.00%、61.50%和68.71%。表明經80 μg/mL TFTB處理后，可抑制乙醇誘導后L-02細胞脂肪變性與堆積，也可減輕肝細胞的損傷程度。袁葉飛等[15]在體外構建的AFL細胞模型中觀察到趕黃草總黃酮能明顯降低細胞內TG水平且能明顯緩解脂肪變性。閆帥峰等[23]通過構建大鼠AFLD模型，證明了苦蕎能夠減少脂肪在大鼠肝臟中的積蓄，但并未提出發(fā)揮效應的成分。綜上，苦蕎中的黃酮成分能夠抑制體外誘導的AFL細胞模型脂肪變性與堆積。

2.4.2 TFTB對AFL細胞上清液中氧化應激指標MDA、NEFA、T-SOD、GSH-Px水平的影響

MDA含量能夠反映機體抗氧化潛在能力與組織過氧化損傷程度，NEFA與機體的氧化應激有關，當NEFA處于較高濃度時，不僅會對細胞造成損傷，機體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的平衡狀態(tài)也會發(fā)生變化。TSOD、GSH-Px則是生物體系中抗氧化系的重要組成成員。Masarone等[24]的研究表明，酒精長期作用于肝臟可誘導肝臟氧化應激，MDA、T-SOD和GSH-Px的水平變化可用來表示經乙醇誘導后以及藥物作用后肝臟氧化損傷程度。Grummer等[25]認為奶牛血液中NEFA升高會導致氧化應激并伴隨脂肪肝的產生。各組細胞上清液MDA、NEFA、T-SOD和GSH-Px的變化見表5。

表5 各組細胞上清液MDA、NEFA、T-SOD和GSH-Px的變化Table 5 Levels of MDA，NEFA，T-SOD and GSH-Px in supernatant of cells

由表5可知，與空白對照組比較，處理前H4組細胞上清液中MDA水平顯著升高13.25%（p＜0.05），NEFA水平高度顯著升高 133.51%（p＜0.000 1），T-SOD、GSH-Px水平分別高度顯著降低18.00%、22.28%（p＜0.0001），表明乙醇能夠誘導L-02細胞產生氧化損傷。

與處理前H4組比較，TFTB處理組細胞上清液中MDA水平顯著降低 13.83%（p＜0.05），NEFA 水平高度顯著降低 47.51%（p＜0.000 1），T-SOD、GSH-Px水平分別高度顯著升高 17.44%、101.57%（p＜0.000 1），表明80 μg/mL TFTB可能是通過提高L-02細胞內T-SOD和GSH-Px的酶活性以及降低MDA、NEFA的水平來提高細胞的抗氧化能力。Li等[26]研究結果表明，醉酒小鼠模型組肝臟中的MDA明顯升高，T-SOD、GSH-Px明顯降低，而經枸杞色素和多糖治療后可逆轉前述情況。童鈺琴等[13]在體外抗氧化活性實驗中觀察到苦蕎麩皮總黃酮對超氧陰離子自由基（O2-·）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基及NO2-具有一定的清除能力，且在一定范圍內呈現(xiàn)出量效關系。因此，TFTB可能通過提高L-02細胞內T-SOD和GSH-Px的酶活性并降低MDA、NEFA水平來抑制O2-·、DPPH·及NO2-等的產生，從而提高細胞的抗氧化能力，改善AFL細胞氧化損傷，因此具有緩解AFLD的潛能。

2.4.3 TFTB對AFL細胞上清液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α 水平的影響

IL-6主要用于檢測積累性肝損傷，TNF-α可加速中性粒細胞的轉移導致活性氧增加，進而造成肝臟的損傷[27]，這兩項指標的升高意味著嚴重的肝病甚至惡性腫瘤[28]。IL-8是一種有效的趨化因子，由巨噬細胞、肝細胞等多種細胞產生，多項研究表明患有AFLD患者的血漿及肝臟中的IL-8水平會增加[29]。Li等[26]的研究發(fā)現(xiàn)AFLD模型小鼠血清中IL-6、TNF-α顯著上升（p＜0.05）。Wang等[30]的研究表明IL-8可通過蛋白激酶B/缺氧誘導因子-1α通路（protein kinase B/hypoxia inducible factor-1α pathway，Akt/HIF-1α pathway）加劇肝脂變性。各組細胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的變化見表6。

表6 各組細胞上清液IL-6、IL-8和TNF-α的變化Table 6 Levels of IL-6，IL-8 and TNF-α in supernatant of cells pg/mL

由表6可知，與空白對照組比較，處理前H4組細胞上清液中IL-6、IL-8水平分高度顯著升高128.22%、595.68%（p＜0.000 1），TNF-α 水平升高 18.77%（p＞0.05），表明乙醇能夠誘導L-02細胞產生炎癥反應。

與處理前H4組比較，80 μg/mL TFTB處理組細胞上清液中IL-6水平下降8.31%（p＞0.05），IL-8水平高度顯著下降 32.61%（p＜0.000 1），TNF-α 水平顯著下降27.85%（p＜0.05），表明 80 μg/mL TFTB 能夠降低 AFL細胞產生炎性因子的水平，起到緩解相關炎癥反應的作用。王雪等[31]在體外構建小鼠腹腔巨噬細胞RAW 264.7炎癥模型中觀察到天山堇菜總黃酮在0.78μg/mL～12.5 μg/mL 能明顯降低促炎癥因子 TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，具有較好的抗炎活性。而本研究表明，80 μg/mL的TFTB能明顯降低AFL細胞上清液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α的水平。由此可見，黃酮緩解相關炎癥反應的作用濃度因黃酮來源不同而呈現(xiàn)較大的差異。胡一冰等[32]研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎籽提取物也可緩解炎癥反應，抑制小鼠耳腫脹及大鼠蛋清性足腫脹。目前，還未有文獻報道TFTB對體外誘導的AFL細胞炎癥反應的抑制作用。結合上述實驗結果，TFTB可通過降低炎性因子水平來緩解AFL細胞損傷，從而發(fā)揮保肝潛能。

3 結論

本文以TFTB為原料，以0.9%乙醇和0.01%FeSO4成功建立體外AFL細胞模型，研究了TFTB對AFL細胞的影響。研究結果顯示，80 μg/mL的TFTB可以減少酒精性脂肪肝L-02細胞上清液中TG、AST、ALT、MDA、NEFA的含量，并升高T-SOD、GSH-Px的含量，表明TFTB不僅可以抑制AFL細胞模型脂肪積累與變性，還可以減輕乙醇對肝細胞膜及肝細胞的氧化損傷，從而具有緩解AFLD的潛能。同時，80 μg/mL TFTB也可降低酒精性脂肪肝L-02細胞上清液中IL-8、TNF-α的含量，表明TFTB能夠緩解炎癥反應。因此，在保健食品及相關產品的開發(fā)中，考慮其能夠改善AFLD的潛能及緩解炎癥的功效作用，為產品開發(fā)提供新的理論依據(jù)。