獼猴桃茶酒工藝條件優(yōu)化及抗氧化活性分析

魏鑫，杜勇，賴曉琴，冷銀江，陳曉姣，謝李明，喻康杰，馬懿*

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644005；2.四川省釀酒專用糧工程技術研究中心，四川 宜賓 644000；3.五糧液集團有限公司，四川 宜賓 644000）

獼猴桃又名奇異果，富含維生素C、維生素A、氨基酸、可溶性膳食纖維、礦物質等營養(yǎng)成分[1-3]。除此之外，獼猴桃還富含黃酮類、多酚類、萜類等活性成分[4-6]，具有抗氧化、抗衰老、預防心血管疾病等多種功能[7-8]。獼猴桃果酒作為獼猴桃精深加工產品之一，具有獨特的風格，市場前景廣闊[9-10]。但單一的獼猴桃發(fā)酵果酒存在風味淡薄、香氣不突出等問題。為了改善獼猴桃果酒風味淡薄的問題，將獼猴桃與紅茶混合發(fā)酵，在酒香的基礎上賦予茶香，使果酒香氣更加馥郁。

近年來，對茶酒的研發(fā)引起人們的重視，將茶葉應用于釀造低度酒，如天麻茶酒[11]、檸檬茶酒[12]、卷丹百合茶酒[13]等。將水果與茶葉結合研發(fā)新型果茶酒是現(xiàn)在茶酒行業(yè)的發(fā)展趨勢，與傳統(tǒng)茶酒相比，新型果茶酒兼具茶香與果香的特點。目前，以獼猴桃和紅茶為原料進行發(fā)酵所制果茶酒的研究鮮有報道，且兩者結合是否能在豐富口感的基礎上增加其抗氧化活性也是待解決的主要問題。

綜上，本試驗以獼猴桃和紅茶為主要原料，采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化獼猴桃茶酒的生產工藝并對獼猴桃茶酒抗氧化活性進行研究。本研究基于獼猴桃和茶均具有極高的食用價值，將兩者結合以提高營養(yǎng)價值和經濟價值，以期獲得一款感官特性優(yōu)良且具有較強抗氧化活性的新型茶酒，為獼猴桃與紅茶資源綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃、白砂糖、紅茶：市售；釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（初始酶活500 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級）、沒食子酸標準品（純度≥98.0%）：成都市科龍化工實劑廠；福林酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：合肥博美生物科技有限責任公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JYZ-E25榨汁機：九陽股份有限公司；GZ-250-HS11培養(yǎng)箱：廣智科技設備有限公司；STARTER 2C pH計：奧豪斯儀器有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學儀器有限公司；AR1140電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 獼猴桃茶酒工藝流程

獼猴桃茶酒工藝流程見圖1。

圖1 獼猴桃茶酒工藝流程Fig.1 Processing technology of kiwifruit tea wine

將獼猴桃中的雜質等異形物去除，挑選無損傷的獼猴桃，清洗、去皮榨汁待用，果膠酶添加量為60 mg/L。1 g紅茶用100 mL水浸泡，在超聲功率300 W、超聲溫度80℃條件下，茶葉超聲提取15 min得到紅茶。前期預試驗結果表明，獼猴桃與茶汁體積比為1∶1發(fā)酵，酒香更加充盈。因此，后續(xù)試驗將超聲提取后的紅茶與獼猴桃果汁以體積比1∶1混合，用250mL錐形瓶發(fā)酵，加入白砂糖調整糖度，添加偏重亞硫酸鉀160 mg/L，添加檸檬酸調整發(fā)酵液pH值。酵母活化，在質量分數(shù)為5%的糖水中加入活性干酵母，其中酵母與糖水比為1∶30（g/mL），37℃保溫30 min。發(fā)酵結束后，過濾獼猴桃茶酒，并于65℃水浴保溫30 min，進行巴氏滅菌。

1.3.2 獼猴桃茶酒工藝優(yōu)化單因素試驗

1.3.2.1 酵母接種量對獼猴桃茶酒的影響

在初始發(fā)酵pH值為3.5、初始糖度20°Brix、獼猴桃與茶汁體積比為1∶1時，調整不同酵母接種量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%），26℃恒溫發(fā)酵 7 d，考察酵母接種量對獼猴桃茶酒的影響。

1.3.2.2 初始糖度對獼猴桃茶酒的影響

在初始發(fā)酵pH值為3.5、酵母接種量0.1%、獼猴桃與茶汁體積比為1∶1時，調整不同糖度（17、19、21、23、25 °Brix），26 ℃恒溫發(fā)酵 7 d，考察初始糖度對獼猴桃茶酒的影響。

1.3.2.3 發(fā)酵溫度對獼猴桃茶酒的影響

在初始發(fā)酵pH值為3.5、酵母接種量0.1%、初始糖度20°Brix、獼猴桃與茶汁體積比為1∶1時，調整不同發(fā)酵溫度（22、24、26、28、30 ℃），恒溫發(fā)酵 7 d，考察發(fā)酵溫度對獼猴桃茶酒的影響。

1.3.2.4 發(fā)酵pH值對獼猴桃茶酒的影響

在酵母接種量0.1%、初始糖度20°Brix、獼猴桃與茶汁體積比為1∶1時，調整不同初始初始發(fā)酵pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0），26 ℃恒溫發(fā)酵 7 d，考察初始發(fā)酵pH值對獼猴桃茶酒的影響。

1.3.3 獼猴桃茶酒工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設計正交試驗方案，確定最佳工藝條件組合。正交試驗因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.3.4 獼猴桃茶酒抗氧化活性分析

以0.3%維生素C溶液為陽性對照，獼猴桃茶酒稀釋20倍，測定獼猴桃茶酒的DPPH自由基、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS] 陽離子自由基、·OH清除能力和鐵離子還原能力，探究獼猴桃茶酒的抗氧化活性。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力參考金海炎等[14]的方法進行測定。

1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力測定

ABTS+自由基清除能力參考吳雙從等[15]的方法測定。

1.3.4.3 ·OH清除能力測定

·OH清除能力參考程宏楨等[16]的方法測定。

1.3.4.4 還原能力測定

還原能力參考程宏楨等[16]的方法測定。

1.3.4.5 總酚、總黃酮含量的測定

總酚含量采用福林酚法[17]測定。以沒食子酸作為標準品進行定量，繪制沒食子酸標準曲線，回歸方程：y=0.235 1x-0.007 3，y為吸光度，x為沒食子酸含量（mg/mL），相關系數(shù) R2=0.996 9。

總黃酮含量參考李少鵬等[18]的方法測定。以蘆丁作為標準品進行定量，繪制蘆丁標準曲線，回歸方程：y=0.189 8x-0.0177，y為吸光度，x為蘆丁含量（mg/mL），相關系數(shù)R2=0.996 4。

1.4 理化指標與感官指標的測定

1.4.1 理化指標的測定

總酸含量參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定[19]；酒精度采用酒精計測定；pH值采用pH計測定；可溶性固形物含量采用手持糖度計測定。

1.4.2 感官評定

挑選12名經過品評專業(yè)培訓人員組成品評小組，感官評分參考葡萄酒與果酒評分標準。評分標準見表2。

表2 獼猴桃茶酒的感官評分標準Table 2 Sensory scoring criteria of kiwifruit tea wine

1.5 數(shù)據分析

使用Excel 2010處理數(shù)據，每組試驗重復3次；使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析；使用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃茶酒單因素試驗結果

2.1.1 酵母接種量對獼猴桃茶酒品質的影響

酵母接種量對獼猴桃茶酒品質的影響見表3。

表3 酵母接種量對獼猴桃茶酒品質的影響Table 3 Effect of yeast inoculation amount on the quality of kiwifruit tea wine

由表3可知，獼猴桃茶酒的感官評分隨著酵母接種量的增加呈先升高后降低的趨勢。酵母接種量為1.0%時，感官評分最高，為77.84，且顯著高于其它接種量的感官評分（p＜0.05）。酵母接種量對獼猴桃茶酒精度影響較大，不同處理組間差異顯著（p＜0.05）。酵母接種量直接影響茶酒的品質，這是由于酵母接種量過大，導致菌體生長過快，快速代謝大量副產物，進而對酒的風味產生不良影響[20]。而酵母接種量過小會導致發(fā)酵不充分，發(fā)酵速率慢，酒精轉換量低。因此，選擇酵母菌接種量0.8%、1.0%、1.2%用于后續(xù)試驗。

2.1.2 初始糖度對獼猴桃茶酒品質的影響

初始糖度對獼猴桃茶酒品質的影響見表4。

表4 初始糖度對獼猴桃茶酒品質的影響Table 4 Effect of initial sugar content on the quality of kiwifruit tea wine

由表4可知，隨著初始糖度的升高，獼猴桃茶酒感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。初始糖度為23°Brix時，感官評分最高，為79.46，且顯著高于其它組（p＜0.05）；當初始糖度為 17 °Brix～25 °Brix時，酒精度隨著初始糖度的增加呈上升的趨勢。當初始糖度為25°Brix時，其酒精度為 12.09%vol，顯著高于其它組（p＜0.05）。糖作為酵母細胞生長的能源物質，決定了酵母新陳代謝的快慢，從而影響發(fā)酵進程及酒精生產。但糖度過高，會影響酒的感官品質[21]，基質中糖度過高可能會對其它微生物活動產生不利影響。因此，選擇初始糖濃度 21、23、25 °Brix用于后續(xù)試驗。

2.1.3 發(fā)酵溫度對獼猴桃茶酒品質的影響

發(fā)酵溫度對獼猴桃茶酒品質的影響見表5。

表5 不同發(fā)酵溫度對獼猴桃茶酒品質的影響Table 5 Effect of fermentation temperature on the quality of kiwifruit tea wine

由表5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，獼猴桃茶酒的感官評分與酒精度均呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵溫度為26℃時，酒精度達到最高值11.58%vol，而感官評分在28℃時達到最大值78.61，發(fā)酵溫度對獼猴桃茶酒精度影響較大，不同處理組差異顯著（p＜0.05）。發(fā)酵溫度越高，獼猴桃茶酒揮發(fā)性香氣成分越容易損失，所以發(fā)酵溫度的升高不利于酒的感官品質；由于26℃與28℃時的獼猴桃茶酒感官評分差異不大，且酵母生長代謝有最適溫度區(qū)間，過高或過低的溫度均會影響酵母生長代謝，不利于酒精的生產轉化[22]。因此，選擇發(fā)酵溫度24、26、28℃用于后續(xù)試驗。

2.1.4 初始發(fā)酵pH值對獼猴桃茶酒品質的影響

初始發(fā)酵pH值對獼猴桃茶酒品質的影響見表6。

表6 初始發(fā)酵pH值對獼猴桃茶酒品質的影響Table 6 Effect of initial pH on the quality of kiwifruit tea wine

由表6可知，獼猴桃茶酒的感官評分與酒精度隨著pH值的升高均呈先升高后下降的趨勢。pH值為3.5時，獼猴桃茶酒的酒精度和感官評分均為最高值，分別為11.38%vol和77.53，與其他各組差異顯著（p＜0.05）。但當pH值高于3.5時，獼猴桃茶酒的酒精度與感官評分均迅速下降，可能是由于pH值的升高，會導致獼猴桃茶酒發(fā)生不良化學反應，如氧化褐變。因此，選擇初始發(fā)酵pH3.0、3.5、4.0用于后續(xù)試驗。

2.2 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，選擇酵母接種量（A）、初始糖度（B）、發(fā)酵溫度（C）和初始發(fā)酵 pH 值（D）4個因素，以感官評分與酒精度為評價指標，采用L9（34）正交試驗設計對獼猴桃茶酒發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。正交試驗設計方案及結果分析見表7。

表7 正交試驗結果Table 7 Orthogonal test results

續(xù)表7 正交試驗結果Continue table 7 Orthogonal test results

由表7可知，以酒精度和感官評分作為評價指標的最優(yōu)組合分別為A2B2C1D3和A3B1C2D3，由極差R可知，影響獼猴桃茶酒酒精度和感官評價因素主次順序分別為 C＞A＞B＞D，C＞A＞D＞B；綜合考慮酒精度與感官評分，獼猴桃茶酒工藝的理論最優(yōu)組合為A2B2C2D3（驗證組）。由L9（34）正交試驗結果可知A2B1C2D3組合酒精度與感官評分均為最高，因此，將直觀分析所得的最優(yōu)組合A2B1C2D3作為對照組和由均值k得到的理論最優(yōu)組合A2B2C2D3作為驗證組同時進行3次重復驗證試驗，結果見表8。

表8 驗證試驗數(shù)據Table 8 Data of validation test

由表8可知，A2B2C2D3（驗證組）的感官評分與酒精度均大于A2B1C2D3（對照組）。綜合上述分析，確定正交試驗的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即最佳獼猴桃茶酒生產工藝條件為酵母接種量1.0%、發(fā)酵溫度26℃、初始糖度23°Brix、初始發(fā)酵pH4。該工藝條件發(fā)酵后的獼猴桃茶酒酒精度為11.9%vol，感官評分為80.4。

3 獼猴桃茶酒的理化指標測定結果

3.1 理化指標結果

最優(yōu)工藝條件發(fā)酵所得的獼猴桃茶酒的可溶性固形物含量 8.5 °Brix、酒精度 11.9%vol、總酸含量7.7 g/L、pH3.8、總酚含量1.57 mg/mL、總黃酮含量0.84 mg/mL。獼猴桃茶酒外觀呈黃色，清亮透明，有光澤；具有優(yōu)雅的獼猴桃果香氣，茶香、酒香和諧；口感鮮美，醇和、爽口柔和，酸度適宜；酒體較協(xié)調，具有果酒的典型風格。綜上，根據正交試驗所得最優(yōu)發(fā)酵條件生產的獼猴桃茶酒的感官指標、理化指標均符合國標要求。

3.2 抗氧化活性檢測結果

抗氧化活性檢測結果見圖2。

圖2 獼猴桃茶酒的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant capacity of kiwifruit tea wine

由圖2（a）可知，獼猴桃茶酒DPPH自由基清除率隨著獼猴桃茶酒用量增加而逐漸升高，在獼猴桃茶酒超過0.8 mL時抗氧化能力大于維生素C，此時的DPPH自由基清除率為93.7%，且在獼猴桃茶酒使用量超過0.8 mL時，其抗氧化能力逐漸趨于平緩，僅有輕微的上下浮動。

由圖2（b）可知，獼猴桃茶酒ABTS+自由基清除率隨著獼猴桃茶酒用量增加而逐漸升高，在樣品用量超過1.6 mL時抗氧化能力與維生素C溶液的抗氧化能力接近，ABTS+自由基的清除率為93.4%。當樣品用量低于1.6 mL時，維生素C溶液ABTS+自由基的清除率優(yōu)于發(fā)酵的獼猴桃茶酒。

由圖2（c）可知，獼猴桃茶酒·OH清除率在樣品用量為0.2 mL～1.6 mL時，隨著獼猴桃茶酒樣品用量的增加，抗氧化能力明顯增強，在樣品用量1.6 mL時，獼猴桃茶酒·OH清除率為試驗組內·OH自由基清除率的最大值，此時·OH的清除率為78.78%。維生素C溶液·OH的清除率一直優(yōu)于發(fā)酵的獼猴桃茶酒。

由圖2（d）可知，獼猴桃茶酒還原能力隨著樣品用量的增加呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。在獼猴桃茶酒樣品用量為1.6 mL時，吸光度為0.947，與VC還原能力相當。還原能力的變化趨勢區(qū)別于其他抗氧化指標的變化趨勢可能與其抗氧化機制有關，其檢測原理是抗氧化物質將三價鐵還原為二價鐵，二價鐵與2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪生產藍色物質，在593 nm處有最大吸收，吸光度越大表明獼猴桃茶酒的抗氧化性越高。

4 結論

以獼猴桃和紅茶為原料，獼猴桃茶酒的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為酵母接種量1.0%、獼猴桃果汁與紅茶湯體積比1∶1、初始發(fā)酵pH值為4、初始糖度23°Brix，26℃發(fā)酵7 d，發(fā)酵制成獼猴桃紅茶復合茶酒DPPH自由基、ABTS+自由基清除率均大于90%，總酚含量達到1.57 mg/mL，獼猴桃茶酒兼具獼猴桃果香與紅茶清香，使兩者在營養(yǎng)、香氣及口感上互補且具有一定的抗氧化性。獼猴桃紅茶復合茶酒的研發(fā)為茶酒產業(yè)發(fā)展開辟了新途徑，對豐富獼猴桃產品及開發(fā)新型的茶酒具有一定的研究意義。