中藥補(bǔ)腎解毒方對(duì)輻射后孕鼠胎盤(pán)損傷的防護(hù)作用及氧化應(yīng)激的影響

高 慶 李延暉 譚德慧 楊云霜

(1 中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心中醫(yī)科，北京，100088； 2 北京市隆福醫(yī)院中醫(yī)科，北京，100010)

隨著近年科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，核能開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于軍事、醫(yī)學(xué)以及人類(lèi)的日常生活當(dāng)中，其造福人類(lèi)的作用顯而易見(jiàn)，但同時(shí)可能對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生一定的輻射損傷，有關(guān)輻射危害已然成為當(dāng)下全球亟待解決的重大問(wèn)題[1-2]。正常情況下，人類(lèi)日常生活中基本上不會(huì)接觸大劑量的輻射，但是人類(lèi)接觸中、低劑量輻射的概率較大[3]。生殖是人類(lèi)繁衍生息的重要方式，隨著人類(lèi)對(duì)輻射危害的認(rèn)知日益深入，中、低劑量的輻射對(duì)人類(lèi)生殖的影響開(kāi)始受到廣泛的關(guān)注[4]。鑒于此，本文通過(guò)研究中藥補(bǔ)腎解毒方對(duì)輻射后孕鼠胎盤(pán)損傷的防護(hù)作用及對(duì)氧化應(yīng)激的影響，為中藥補(bǔ)腎解毒方應(yīng)用于輻射后孕鼠防護(hù)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選擇清潔級(jí)健康C57 BL/6 J雌性小鼠50只，體質(zhì)量為(22±1)g；雄性小鼠25只，體質(zhì)量為(25±2)g，均為12周齡。所有大鼠均購(gòu)自北京鑫源順康科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0008。放置于醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，無(wú)飲食、飲水的限制。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)(倫理審批號(hào)：20200429)。

1.1.2 藥物 補(bǔ)腎解毒方(方藥組成：熟地黃10 g、山茱萸12 g、山藥10 g、牡丹皮10 g、茯苓10 g、澤瀉10 g、冬蟲(chóng)夏草3 g、白花蛇舌草10 g)由北京康仁堂藥業(yè)有限公司中藥顆粒劑配制而成。

1.1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)(北京瑞格博科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：019246)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)(北京瑞格博科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：02065)，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(北京瑞格博科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：020635)，戊二醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：0198)，多聚甲醛固定液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：0254)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：0366)，電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司，型號(hào)：BSA224S)，輻射源為60Coγ-射線照射(北京伽瑪高新有限公司，型號(hào)：GM-11-03-A)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1)分組：將所有受孕小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組，低劑量輻射組，中劑量輻射組，低劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組，中劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組，每組10只。2)模型制備:將所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行為期3 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)之后，排除動(dòng)情周期異常者，將雄鼠與處于動(dòng)情前期的雌鼠按1∶2比例合籠交配，于次日清晨行雌鼠陰道涂片檢查精子，以發(fā)現(xiàn)陰栓和查到精子為受孕標(biāo)志。

1.2.2 干預(yù)方法 低劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組和中劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組大鼠予以補(bǔ)腎解毒方灌胃干預(yù)，給藥劑量為13.5 g/(kg·d)?？瞻讓?duì)照組，低劑量輻射組，中劑量輻射組則予以等體積的生理鹽水灌胃。各組連續(xù)灌胃10 d后，除空白對(duì)照組外，其余4組大鼠均予以γ射線照射，其中低劑量輻射與低劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組γ射線照射劑量為2 Gy，中劑量輻射組與中劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組γ射線照射劑量為4 Gy。孕鼠分娩時(shí)取胎盤(pán)，稱(chēng)重后，一部分胎盤(pán)用生理鹽水漂洗，立即投入液氮中固定，于-80 ℃冰箱中保存，另一部分胎盤(pán)中性甲醛固定；仔鼠出生60 d，摘眼球取血，血液立即送檢；隨后斷頸處死，分別摘取卵巢、睪丸組織，稱(chēng)重后，中性甲醛固定。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 胎盤(pán)指數(shù)計(jì)算 取出孕鼠子宮，剖開(kāi)子宮后去除胎鼠胞衣，并將胎鼠和胎盤(pán)迅速剝離，逐一對(duì)應(yīng)后稱(chēng)重，胎盤(pán)指數(shù)=(胎盤(pán)質(zhì)量/胎鼠質(zhì)量)×100%。

1.2.3.2 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取部分稱(chēng)量后的胎盤(pán)組織，采用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗，制作成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿，并遵循試劑盒說(shuō)明書(shū)完成SOD、GSH-Px以及MDS的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠妊娠結(jié)局比較 低劑量輻射組與中劑量輻射組孕鼠的活胎率明顯低于空白對(duì)照組；且死胎率高于空白對(duì)照組，而低劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組、中劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組孕鼠的活胎率明顯高于低劑量輻射組與中劑量輻射組，且死胎率低于死胎率低劑量輻射組與中劑量輻射組，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組孕鼠妊娠結(jié)局比較[只(%)]

2.2 各組仔鼠一般情況和胎盤(pán)指數(shù)比較 低劑量輻射組與中劑量輻射組仔鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)以及胎盤(pán)指數(shù)均明顯低于空白對(duì)照組，而低劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組，中劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組仔鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)以及胎盤(pán)指數(shù)均明顯高于低劑量輻射組與中劑量輻射組，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 各組仔鼠一般情況以及胎盤(pán)指數(shù)比較

圖1 各組光鏡下胎盤(pán)組織病理學(xué)情況(HE染色，×400)

2.3 各組孕鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 低劑量輻射組與中劑量輻射組孕鼠SOD、GSH-Px水平均低于空白對(duì)照組，而MDA水平高于空白對(duì)照組；低劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方與中劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組孕鼠SOD、GSH-Px水平均高于空白對(duì)照組，而MDA水平低于空白對(duì)照組；各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組孕鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

3 討論

既往，國(guó)內(nèi)外針對(duì)輻射防護(hù)以及輻射防護(hù)藥物的研究主要集中在腫瘤治療、美容、農(nóng)業(yè)以及原子能工業(yè)中，雖然越來(lái)越多的輻射防護(hù)藥物不斷被開(kāi)發(fā)應(yīng)用，但有關(guān)中藥復(fù)方進(jìn)行輻射防護(hù)的研究并不多見(jiàn)[5-7]。隨著近年來(lái)人類(lèi)對(duì)中醫(yī)藥的研究日益深入，具備標(biāo)本同治、防治結(jié)合以及低毒高效特點(diǎn)的中藥受到了廣泛的關(guān)注，更是成功進(jìn)入了從事輻射防護(hù)研究者的視野，然而有關(guān)專(zhuān)門(mén)針對(duì)生殖技能以及子代健康防治的中藥復(fù)方研究仍處于探索階段[8-10]。中醫(yī)認(rèn)為，腎主生殖，乃藏精之所，于人體成長(zhǎng)發(fā)育以及繁衍后代等多個(gè)方面起著至關(guān)重要的作用，和生殖系統(tǒng)關(guān)系密切，而電離輻射當(dāng)屬火熱暴戾之邪，可直中臟腑，耗損肝腎之陰精，干擾生殖根本[11-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，輻射會(huì)在一定程度上降低孕鼠的活胎率，同時(shí)提高死胎率，且對(duì)仔鼠的體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)以及胎盤(pán)指數(shù)均會(huì)產(chǎn)生明顯不利的影響。而采用中藥補(bǔ)腎解毒方干預(yù)之后，孕鼠的活胎率明顯提高，且仔鼠的體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)以及胎盤(pán)指數(shù)均得到不同程度的改善。這與喬祚等[15]的研究結(jié)果一致：加中藥治療孕鼠的活胎率明顯高于僅用輻射治療，且仔鼠的體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)以及胎盤(pán)指數(shù)均明顯高于僅用輻射治療。提示了中藥補(bǔ)腎解毒方可能具有輻射防護(hù)的作用，可明顯減輕輻射對(duì)孕鼠胎盤(pán)造成的損傷，同時(shí)降低輻射對(duì)仔鼠正常生長(zhǎng)發(fā)育的影響程度。考慮原因可能在于：補(bǔ)腎解毒方主要是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上化裁而來(lái)，且相應(yīng)加入了冬蟲(chóng)夏草以及白花蛇舌草，其中六味地黃丸可發(fā)揮調(diào)節(jié)大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的作用，繼而可促進(jìn)卵巢功能的恢復(fù)以及改善，對(duì)女性生殖具有積極促進(jìn)作用[16]。余雷等[17]的研究報(bào)道也說(shuō)明了這一點(diǎn)。而冬蟲(chóng)夏草味甘性溫，秘精益氣，專(zhuān)補(bǔ)命門(mén)；白花蛇舌草性寒苦，具有清熱解毒、瀉火熱邪盛的功效，從而有利于減少輻射造成的熱性損傷[18-20]。另外，本研究結(jié)果顯示，低劑量輻射組與中劑量輻射組孕鼠SOD、GSH-Px水平均低于空白對(duì)照組，而MDA水平高于空白對(duì)照組；低劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方與中劑量輻射+補(bǔ)腎解毒方組孕鼠SOD、GSH-Px水平均高于空白對(duì)照組，而MDA水平低于空白對(duì)照組。這提示中藥補(bǔ)腎解毒方對(duì)輻射后孕鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有一定的緩解作用。究其原因可能在于冬蟲(chóng)夏草可有效調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達(dá)，從而在一定程度上提升放射損傷小鼠的抗氧化能力；而白花蛇舌草具有一定的抗氧化作用。二者聯(lián)合應(yīng)用具有一定的協(xié)同作用，繼而使氧化應(yīng)激指標(biāo)水平得到改善。由此可推測(cè)補(bǔ)腎解毒方對(duì)孕鼠的輻射防護(hù)作用機(jī)制可能和預(yù)防、修復(fù)胎盤(pán)組織氧化損傷有關(guān)。

綜上所述，中藥補(bǔ)腎解毒方對(duì)輻射后孕鼠胎盤(pán)損傷的防護(hù)作用顯著，可明顯減輕氧化應(yīng)激損傷，改善孕鼠妊娠結(jié)局，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。