肺癌干性樣細胞與耐藥

潘振華 劉紅雨 陳軍

據世界衛(wèi)生組織發(fā)布的2020年GLOBOCAN數據顯示，肺癌是全球發(fā)病率第二、致死率第一的腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占85%，小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）占15%。按照組織類型，NSCLC又分為肺腺癌、肺鱗癌和大細胞肺癌。對于中晚期的肺癌患者，單獨或者聯(lián)合化療是目前臨床的主要策略，盡管靶向治療和免疫治療大大改善了部分患者的生存狀態(tài)，但無論對于傳統(tǒng)化療還是新型療法，耐藥和復發(fā)仍然使肺癌臨床面臨困境[1-3]。

腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSCs）最早在急性髓系白血病中得到鑒定，隨后研究者們陸續(xù)在多種實體瘤中證實了CSCs的存在，并提出CSCs與腫瘤的發(fā)生、轉移、耐藥和復發(fā)密切相關[4]。2007年Maria的課題組[5]利用干細胞對Hoechst 33342染料的高外排能力從人肺癌細胞株和肺癌組織中均分離出了具有干性樣特征的細胞亞群，證實了這群細胞能夠自我更新和多向分化，在體內可以高效成瘤。2008年Levina的課題組[6]發(fā)現(xiàn)在多種化療藥物作用下存活下來的肺癌細胞高表達干性標志蛋白，同時這群細胞具有自我更新和體外成球等干性特征。近年來，更多的證據表明在肺癌組織和細胞中存在一小群干性樣腫瘤細胞，它們可以自我更新、多向分化，具有很強的成瘤能力，能夠在放療、化療、靶向治療和免疫治療中存活，是肺癌耐藥與復發(fā)的主要原因[7]。

本文主要針對肺癌干性樣細胞（lung cancer stem-like cells, LCSCs）及其耐藥機制的研究進展進行綜述，旨在為臨床靶向和逆轉耐藥提供思路。

1 肺癌干性樣細胞

1.1 來源 目前研究者們認為LCSCs的來源主要包括：正常成體干細胞或者前體細胞發(fā)生惡性轉化，以及已分化的腫瘤細胞通過去分化獲得干性。近來有團隊提出，在腫瘤組織中可能不僅僅存在單一的CSC亞群，而可能有多個亞群，它們可能是單來源，也可能是多來源，其惡性轉化途徑可能既存在重合，也存在各自的特異性，這對于干性樣腫瘤細胞的鑒定與靶向提出了更加嚴峻的挑戰(zhàn)[7]。

1.1.1 成體干細胞來源的LCSCs 研究最多的肺部成體干細胞包括基底細胞、II型肺泡表皮（alveolar epithelial type II, AT2）細胞和club細胞，它們除維系肺部組織平衡發(fā)育，在損傷修復中也發(fā)揮重要功能。研究[7]表明，細胞自身的DNA損傷修復應答、基因突變和炎性環(huán)境的誘導等多種因素可能引起這些成體干細胞在分裂和增殖過程中累積突變而發(fā)生惡性轉化。

Weeden團隊[8]發(fā)現(xiàn)基底細胞在吸煙等引起的肺損傷時更傾向于啟動非同源末端連接（non-homogenous end joining, NHEJ）途徑進行修復，從而增加了基因組的不穩(wěn)定性和突變幾率，基因表達分析進一步論證了肺鱗癌與基底細胞之間具有高度同源性，這為肺鱗癌的基底細胞來源提供了有力的證據。Jeong團隊[9]通過Trp53和Keap1雙突變，誘導小鼠氣道基底干細胞發(fā)生了向肺鱗癌的惡性轉化，證實了肺鱗癌可由基底細胞惡性突變形成，并成功建立了小鼠基底細胞發(fā)展為肺鱗癌的模型。

通過小鼠模型，研究者們追蹤到在出生后，肺部損傷可以誘導AT2細胞分化產生新的AT1細胞，同時，體外添加表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）等可以誘導AT2細胞的自我更新。在KrasG12D突變型小鼠體內的AT2細胞可以被有效地激發(fā)出自我更新能力，并進一步發(fā)展為多灶位肺腺癌[10]。在最新的研究中，Chen的團隊[11]通過類器官模型證實表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）T790M/L858R突變的AT2細胞和支氣管肺泡來源的干性細胞能夠轉化為肺癌細胞，轉化后的癌細胞保留了它們各自的表觀遺傳學特征，并對不同的藥物表現(xiàn)出不同的敏感性。

當肺部受損嚴重，或者采用基因編輯的方式去除掉club細胞時，通常保持休眠狀態(tài)的神經內分泌（neuroendocrine, NE）細胞就會發(fā)生增殖并對周圍表皮細胞進行修復。而在腫瘤抑制因子Rb1和Trp53缺失的情況下，小鼠體內的NE細胞能夠轉化成為小細胞肺癌[12]。

1.1.2 前體細胞來源的LCSCs 與干細胞相比，前體細胞在組織中的含量明顯增加，同時前體細胞也存在一定的自我更新和多向分化能力。Sasai團隊[13]對人小氣道表皮細胞進行基因編輯，聯(lián)合hTERT的過表達、Rb和p53通路的失活、KRAS以及PIK3CA和CYCLIN-D1的活化，成功在裸鼠模型中轉化得到了肺腺癌細胞，當增加c-Myc活性，可以得到具有干性樣的低分化型肺腺癌細胞。不同于Sasai團隊復雜的基因編輯實驗，Wang的團隊[14]發(fā)現(xiàn)鎳元素可以直接誘導正常的人支氣管表皮細胞發(fā)生惡性轉化，同時，SOD1的高表達促使其中一部分細胞發(fā)生去分化獲得干性樣特征，這部分獲得干性樣特征的腫瘤細胞表現(xiàn)出更高的惡性程度。

1.1.3 肺癌細胞通過去分化獲得干性 干性細胞的分化受到c-Myc、SOX2、Oct-4和TP53等多種基因以及Wnt、Notch和Hedgehog等信號通路的調控，因此當這些與分化相關的基因或者通路活性發(fā)生改變時，細胞的分化和去分化狀態(tài)之間可以相互轉換[7]。

EGFR突變的肺腺癌向小細胞肺癌或者肺鱗癌的轉化，是臨床上腫瘤細胞獲得多向分化能力從而發(fā)生組織類型轉化的經典案例。研究[15]表明TP53和RB1的失活使腫瘤細胞獲得干性樣特征，具有了能夠多向分化的能力，在EGFR活化型突變的情況下會激活更利于表皮特征的轉錄程序并抑制細胞向神經內分泌型轉化的趨勢，但當采用酪氨酸激酶抑制劑分子（tyrosine-kinase inhibitors, TKIs）抑制EGFR信號時，則大大增加了這類細胞向SCLC轉化的能力。

另一個與肺癌耐藥直接相關的研究熱點是表皮間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），EMT主要受到SNAI1、TWIST1和ZEB1等轉錄因子的調控，促使表皮特征的蛋白減少而間充質特征的蛋白表達增多，其調控網絡與CSCs的調控之間存在很多重合。EMT既是腫瘤細胞獲得干性的一個重要途徑，同時也是一個重要表現(xiàn)[16]。

除此之外，包括基因突變，表觀遺傳修飾、代謝重編程和腫瘤微環(huán)境在內的多種內外因素都被證實可以誘導肺癌細胞發(fā)生去分化。比如，白介素-6（interleukin-6, IL-6）通過上調DNMT1促進了A549細胞p53和p21蛋白的甲基化，誘導出細胞的干性樣功能表型；而抑制DNMT3A可以通過上調CDH1來降低Wnt/β-catenin信號活性從而抑制NSCLC的干性特征[17,18]。缺氧壓力下，HOXA5通過上調SOX2的轉錄水平誘導肺腺癌細胞發(fā)生去分化；在營養(yǎng)和氧氣同時缺乏的情況下，間充質成纖維細胞通過旁分泌IL-6、Activin-A和G-CSF，促進肺癌細胞的去分化；CD90+的腫瘤相關成纖維細胞可以通過旁分泌胰島素樣生長因子II（insulin-like growth factor II, IGF-II）誘導肺癌細胞的Nanog表達和干性樣特征的獲得；一氧化氮分子可以促進Oct-4和Cav-1復合體的形成，從而誘導肺癌細胞去分化、獲得干性樣特征[19-22]。

1.2 對LCSCs的鑒定

1.2.1 側群細胞 采用Hoechst 33342染色，在流式細胞儀檢測下鑒定到的低染細胞群，也被稱為側群（side population,SP）細胞。SP鑒定干細胞最早是由Goodel團隊在對小鼠造血干細胞研究中提出的，是基于干性樣細胞高表達ABCG2和ABCB1的特征，而這兩種蛋白可以將Hoechst 33342排出細胞，在染色上使得這部分細胞表現(xiàn)為低染[5]。研究者們最早就是通過SP的方法在肺癌組織和細胞系中分離并鑒定到干性樣細胞亞群[5]。

1.2.2 標志性蛋白 目前在肺癌中常常采用細胞表面標志性蛋白CD133、CD44、CD90、CD117、CD166、EpCAM（CD326）、ALDH以及EMT的標志性蛋白Nanog、SOX2和Oct-4來鑒定干性樣細胞群，但是尚沒有得到一致認同的標志物分子[7,23,24]。比如，Eramo[25]和Chen[26]的課題組都在肺癌組織和細胞系中證實了CD133+的細胞可體外成球生長，能夠分化出CD133-的細胞，104個細胞足夠在免疫缺陷小鼠體內形成腫瘤，然而Qiu的團隊[27]從H446細胞中分離到的CD133+與CD133-細胞在成球能力和分化能力上并沒有顯著差異，提出相比于CD133，uPAR更適合作為干性樣特征標記。Masciale等[28]在最新的研究中對比了從肺腺癌和肺鱗癌患者組織標本中分離出的LCSCs，提出不同組織分型的NSCLCs應該采用不同的標志物。

因此，一方面研究者們常常采用多標記聯(lián)合鑒定的方法，另一方面對于分離到的干性樣腫瘤細胞需要進行功能驗證。

1.2.3 功能鑒定 對干性樣腫瘤細胞的鑒定，公認的金標準是在免疫缺陷小鼠體內的成瘤能力評估，早期Al-Hajj團隊通過這個模型證實了100個CD44+/CD24(-/low)的乳腺癌細胞即可形成腫瘤，與對照組之間成瘤能力差到幾十倍[29,30]。

體外功能驗證包括成球實驗和克隆形成實驗。成球實驗通常是將細胞置于低吸附培養(yǎng)皿中，以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，定期添加適量生長因子，檢測其形成細胞球的能力?？寺⌒纬蓪嶒炇菍⒈侗认♂尩募毎臃N到普通培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，一定時間之后采用甲醛固定并染色以觀察克隆的數目[28,31,32]。

1.2.4 干性指數評估 2018年，Malta等[33]來自包括哈佛、斯坦福、MD Anderson癌癥研究中心等多個重要研究機構的研究者們基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中33種腫瘤的轉錄組數據采用機器學習的方法得到并驗證了可以作為腫瘤細胞干性指數的mRNAsi。2020年Zhang的課題組[34]即發(fā)表了利用該指數挖掘肺腺癌干性樣腫瘤細胞標志物的相關工作。通過對TCGA和GEO數據庫中的數據進行整合分析，Zhang課題組的工作證實了mRNAsi的分值與肺腺癌患者的臨床分期正相關，與5年生存率負相關，同時進一步鑒定到細胞周期相關基因對肺癌細胞干性樣特征的重要調控作用。

2 肺癌干性樣細胞的耐藥機制

2.1 ABC家族轉運蛋白促進了藥物外排 ABCB1、ABCG2和ABCC1是多藥耐藥（multidrug-resistant, MDR）蛋白家族中三個最為主要的成員，廣泛調控親水物質、親脂物質在胎盤、腸道以及血腦屏障中的轉運。其中，ABCB1和ABCG2被證實在干性細胞中普遍高表達，并與多種干性樣腫瘤細胞的多藥耐藥表型相關[24,35,36]。Chen的團隊[37]鑒定到ABCB1高表達是NSCLC細胞HCC827、HCC4006和H1299對多西他賽（Docetaxel）耐藥的主要原因，當采用依克立達（Elacridar）靶向抑制ABCB1時，能夠抑制耐藥細胞亞群的干性樣特征，并增強對Docetaxel的敏感性。Su的團隊[38]證實通過抑制SLC27A2，可以負向調控ABCG2的表達從而逆轉肺腺癌原代細胞中干性樣細胞對順鉑的耐受。

2.2 抗氧化能力強 CSCs中的活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平普遍降低，主要原因之一是細胞內自由基清除系統(tǒng)的表達水平增高[39]。研究[40]發(fā)現(xiàn)，ROS與調控干細胞生物學特性的信號通路相互調控，比如，WNT配體能刺激NADPH氧化酶（NADPH oxidase, NOX）家族成員NOX1產生ROS，產生的ROS又促進了核氧化還原蛋白（nucleoredoxin, NRX）的氧化，破壞了NRX與蓬亂（Dishevelled, DVL）蛋白的相互作用，與NRX解離的DVL能增加β-catenin的穩(wěn)定性，繼而增加其與T細胞因子（T cell factor, TCF）家族轉錄因子的相互作用，進一步調控WNT的靶基因，或者與叉形頭轉錄因子O亞型（forkhead box protein O, FOXO）家族作用，調控細胞的還原狀態(tài)。Lei的團隊[41]證實，改變細胞內的ROS水平可以通過激活Nrf2誘導Notch信號的活化，從而促進基底干細胞的自我更新，與此同時激活細胞內的抗氧化途徑來減少細胞內的ROS，以保持細胞內的氧化還原穩(wěn)態(tài)。ALDH1可以通過上調SOD2和GPX4來調控ROS-RCS代謝通路，以平衡厄洛替尼引起的細胞內ROS毒性。

由ROS水平升高誘導細胞凋亡是多種藥物毒性的重要途徑之一，CSCs中低水平的ROS，以及增強的氧化還原平衡能力，加強了其對治療的耐受性。這種還原調控機制對于干細胞的生物學特征、肺損傷修復以及腫瘤等疾病具有重要的研究價值[42]。

2.3 凋亡逃逸 CSCs可以通過多種機制來降低藥物引起的細胞凋亡，包括改變Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的平衡，抑制線粒體介導的凋亡通路，促進凋亡抑制因子的表達等[24,30,43]。Zeuner和同事[44]證實了從肺癌組織中提取出的LCSCs普遍高表達Bcl-XL，當采用抑制劑分子ABT737時能夠有效誘導干性樣細胞的凋亡、阻斷LCSCs移植瘤的生長。Zakaria的團隊[45]也報道了NSCLC細胞系中的CSCs高表達抗凋亡蛋白BCL-2、Bcl-XL和凋亡抑制因子survivin，并且核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信號在其中起到了關鍵調控作用。

此外，與正常成體干性細胞一樣，干性樣腫瘤細胞也會通過進入休眠狀態(tài)來維持組織平衡，并且在微環(huán)境不利于其生存的情況下，起到自我保護的作用[46]。休眠狀態(tài)的細胞周期一般停滯在G0期，這就降低了對靶向細胞快速增殖特征的傳統(tǒng)化療藥物的敏感性，同時，休眠的LCSCs被證實促凋亡蛋白活性顯著降低，并能通過自噬和內質網應激等途徑適應性生存[24,46,47]。

2.4 DNA損傷修復能力增強 研究發(fā)現(xiàn)，CSCs的DNA損傷修復能力很強。DNA損傷的主要感受蛋白包括ATM和ATR相關的蛋白激酶，ATM識別雙鏈DNA斷裂，ATR識別單鏈斷裂。當DNA發(fā)生損傷，ATM和ATR激酶會與PARP-1、BRCA1形成復合體，磷酸化CHK1和CHK2，繼而促進下游靶蛋白的活化，包括p53和CDC25A，促進細胞周期停滯，給細胞足夠的時間進行DNA損傷修復或者誘導凋亡。目前認為與CSCs的耐藥有關的DNA修復蛋白主要包括CHK1、CHK2、ATR、MSI1、RAD50和RAD51。

Bartucci團隊[48]驗證到，由NSCLC患者組織就分離到的干性樣腫瘤細胞，在化療藥物引起的損傷應答過程中，CHK1是最早也是最顯著的活化指標，并且不依賴于p53的狀態(tài)。而在已經分化的肺癌細胞中，CHK1的活化很微弱。體內、體外采用CHK1的抑制劑聯(lián)合化療能夠顯著地抑制干性樣肺癌細胞。

Yu的團隊[49]對比了干性樣和非干性樣肺腺癌細胞在順鉑作用下的DNA損傷修復能力，證實前者細胞中DNA損傷更小，可能是由于AQP2和CTR1的下調，因此具有對順鉑引起的DNA雙鏈間的損傷修復能力更強。

2.5 與腫瘤微環(huán)境的相互影響 多項研究證實，CSCs與其所處的微環(huán)境之間存在相互調控關系。如前所述，營養(yǎng)和氧氣的缺失、炎性反應，以及藥物作用等都可能促進腫瘤細胞通過去分化獲得干性。此外，細胞外基質的改變可以通過應力傳導影響細胞骨架、形態(tài)和粘附力，并調控在CSCs干性維系中發(fā)揮重要作用的轉錄因子YAP/TAZ的活性。YAP/TAZ的靶基因中包括了參與EMT調控的重要蛋白，而同時細胞EMT過程中伴隨的形態(tài)與粘附力等的改變又作為上游調控因子直接影響了YAP/TAZ的活性[50]。近來不少研究者們提出，YAP/TAZ的磷酸化能夠對非干性腫瘤細胞重編程，使其具備完整的CSCs屬性[50,51]。Kurppa等[47]通過試驗證實LCSCs在藥物的作用下可以通過啟動YAP介導的重編程進入休眠狀態(tài)而逃避凋亡，Pisanu的團隊[52]也提到在LCSCs中硬脂酰輔酶A脫氫酶SCD1主要是通過調控YAP/TAZ的活性維系細胞的干性特征以及對順鉑的耐受表型。

此外，CSCs的自我更新和多向分化能力會造成腫瘤細胞的異質性，并且抑制腫瘤微環(huán)境對免疫細胞的招募[53,54]。

3 靶向肺癌干性樣細胞逆轉耐藥的策略

3.1 誘導分化 Zhai的團隊[55]證實神經表皮生長因子樣蛋白NELL1能夠通過抑制c-MET-Notch信號誘導LCSCs的分化，Huang的團隊[56]證實綠原酸（chlorogenic acid）可以增強SUMO1的表達，引起c-Myc的類泛素化繼而促進LCSCs的分化。這些研究結果表明，通過誘導LCSCs的分化可以有效降低腫瘤細胞的成瘤能力、增強腫瘤細胞對藥物的敏感性。

3.2 靶向調控細胞干性的關鍵蛋白和信號通路 早期用來戒酒的雙硫侖（Disulfiram）能夠抑制ALDH活性，近來在包括肺癌在內的多種腫瘤中被證實具有抑制腫瘤的作用[57]。Ouyang等[58]在實驗中鑒定到芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor, AhR）可以通過與干性特征基因ABCG2、KLF4和c-Myc啟動子的結合來促進這些基因的表達，而小分子抑制劑TCID可以通過靶向抑制泛素羧基末端水解酶L3的活性，增強AhR的降解，最終達到抑制LCSCs的效果。

一些靶向Wnt、Notch、Hedgehog和Hippo信號通路的單克隆抗體分子已經進入了臨床試驗階段，包括DLL4的抗體Demcizumab、Wnt/Fzd的廣譜抗體Vantictumab、Hedgehog通路的抗體Taladegib和Saridegib，以及靶向Hippo通路的Pevonedistat等，但是效果和毒性仍然有待評估。由于這些調控CSCs干性的蛋白和信號通路同樣也在正常成體干細胞中發(fā)揮重要功能，因此在臨床應用中需要更加謹慎[4]。

值得關注的是，姜黃素和異硫氰酸鹽等天然藥物成分，在靶向LCSCs中同樣表現(xiàn)出了重要潛力。比如，姜黃素能有效抑制LCSCs的Wnt和Hedgehog通路，而異硫氰酸鹽能夠通過調控miR-214，繼而抑制MYC的轉錄[59,60]。

3.3 靶向腫瘤微環(huán)境 鈣調蛋白的抑制劑分子CBP501，在小鼠模型中可以抑制巨噬細胞分泌的IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF），從而阻斷了肺腺癌中ABCG2的表達及細胞的成球能力和成瘤能力，限制了肺癌細胞的轉移[61]。阿帕替尼近來在晚期肺癌患者的II期臨床試驗中表現(xiàn)良好，研究者們發(fā)現(xiàn)阿帕替尼可以通過靶向血管內皮細胞生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2）降低腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞誘導的肺癌細胞EMT重編程而達到有效抑制肺癌發(fā)展的效果[62]。

4 小結與展望

LCSCs是一群具有自我更新、多向分化和無限增殖能力的細胞亞群，被提出并證實是肺癌發(fā)生、耐藥、復發(fā)和轉移的主要原因。LCSCs既能由正常成體干細胞或前體細胞惡性轉化而來，也可由普通肺癌細胞發(fā)生去分化獲得干性而產生。具有干性特征的肺癌細胞由于其較強的藥物外排與解毒能力、增強的抗凋亡與DNA損傷修復能力，以及對腫瘤微環(huán)境的適應與調節(jié)能力，對傳統(tǒng)化療、靶向治療和免疫治療均表現(xiàn)出了耐受，同時，在腫瘤的異質性調控中也發(fā)揮了重要作用。因此，鑒定和靶向LCSCs是臨床克服耐藥與復發(fā)的關鍵之一。

LCSCs的干性主要受到Wnt、Notch、Hedgehog和Hippo通路以及SOX2、c-Myc、Oct-4和TP53等基因的調控，并受到氧化還原水平和腫瘤微環(huán)境中細胞外基質（extracellular matrix, ECM）與多種細胞因子的影響，然而由于LCSCs與正常成體干細胞和前體細胞具有相似的調控網絡，鑒定到其特異性調控靶點對于臨床具有重要的意義。同時，由于LCSCs對藥物分子的高外排能力，CSCs的特異性藥物運載方法對于提高藥物吸收也很有幫助。

LCSCs的調控因素復雜，并受到微環(huán)境的多重影響，因此在研究過程中需要更加接近人體腫瘤實際結構與微環(huán)境的培養(yǎng)模式，包括腫瘤細胞的立體生長、多種細胞的共培養(yǎng)等，人源腫瘤異種移植（patient-derived xenografts,PDX）模型、類器官以及更新的仿生系統(tǒng)能夠更好地增加研究結果的可靠性。同時，干性樣腫瘤細胞的異質性、細胞分化狀態(tài)的可逆性和調控機制的多樣性，增加了肺癌臨床對精準醫(yī)療的需求，以及依靠無創(chuàng)技術對患者進行長期監(jiān)測的需求。