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    血友病A的定點基因治療研究進展*

    2022-12-13 15:40:16
    罕少疾病雜志 2022年10期
    關鍵詞:內含子基因治療外顯子

    吳 涌

    暨南大學附屬深圳市寶安區(qū)婦幼保健院婦幼醫(yī)學研究所 (廣東 深圳 518101)

    血友病A(hemophilia A, HA)是由于人凝血因子VIII基因(F8)缺陷導致的X連鎖出血性遺傳病,在活產(chǎn)男嬰中的發(fā)病率約為1/10000-1/5000。臨床上根據(jù)凝血因子VIII活性,可將其分為重度(活性<1%)、中度(1%~5%活性)和輕度(5~30%活性)患者[1]。血友病A可因反復關節(jié)內出血而導致不同程度殘疾,重型患者甚至可能由于顱內自發(fā)出血而危及生命[2-3]。目前尚無成熟的根治療法,臨床上主要通過定期輸注血液來源的或者重組的凝血因子VIII行替代治療。大部分嚴格接受替代療法的患者可以享受正常人的生活質量,但此療法價格昂貴,在中國這樣的發(fā)展中國家甚至有大量血友病A患者終身未接受過任何治療。

    由于HA是一種循環(huán)系統(tǒng)單基因遺傳病,在正常人體內,凝血因子Ⅷ的含量也不需要很精確的調控。針對重度HA患者,僅需將凝血因子含量提高到可檢測水平(1%)以上,就能將其轉變成中度患者,大幅提高生活質量。由于這些特性,導致HA成為了基因治療研究的經(jīng)典疾病模型[4]。甚至早在世紀初的基因治療研究熱潮中,就有研究者開展了HA的基因治療人體試驗[5]。

    F8于1984年被成功克隆,在過去的近四十年中, HA的基因治療研究取得了巨大進展[6]。但是絕大部分研究采取的策略都是將治療F8表達框導入細胞[4]。治療基因多隨機插入到基因組當中,也有以不整合的附加體形式游離存在于細胞中。這樣的選擇一定程度上取決于技術以及效率的限制,其不足之處也是顯而易見的。治療基因的表達受到整合位點染色質環(huán)境的影響,由于整合位點是不確定的,所以治療基因的表達強度并不能得到保證。更嚴重的情況是治療基因有一定幾率會插入原癌基因,導致細胞出現(xiàn)異常增殖,這在早期的基因治療研究中已有前車之鑒。而對于不整合的方案,附加體在細胞增殖中并不會像染色體那樣倍增,因此會隨著時間而被稀釋,從而無法獲得長期治療效果[7]。

    隨著各種人工核酸酶(artificial nucleases)技術的興起和成熟,同源重組的效率可以獲得指數(shù)級的提高[8-10]。近年來有一些學者開始嘗試基因打靶的方式來定點整合治療基因或者直接修復缺陷的內源F8。HA的定點基因治療有不同的技術路線,本綜述將分別介紹目前該研究方向所取得的一些進展。

    1 定點基因添加這類策略適用于所有突變類型的HA患者,就是將完整的治療基因表達框通過基因打靶的方式定點整合至預先設計好的基因組位點。這類策略一方面避免了隨機整合的不安全因素,另一方面由于一般會選擇轉錄活躍的區(qū)域,可以確保治療基因整合后有一定的轉錄活性。另外,可以通過使用比較強的啟動子,以進一步增強治療基因的表達[11]。比如,2006年劉雄昊等就報道了將CMV-BDDF8表達框定點整合至人核糖體DNA區(qū)。由于該區(qū)域是轉錄活躍區(qū),并且人正常二倍體細胞有數(shù)百個核糖體DNA拷貝,因此這個策略可以同時獲得較高的定點整合效率以及基因表達強度。定點整合后,治療基因可以在細胞系中長期表達[12]。

    2 利用內源性強啟動子

    如果以單拷貝的形式整合到細胞中,治療基因的表達量一般都比較有限。因此大量研究的焦點都是想方設法提高治療基因的表達。其中一個效果顯著的策略就是使用強啟動子,代表性的方法是將無啟動子的治療基因定點整合到肝細胞白蛋白(Alb)啟動子的下游。因為肝臟每天合成多達12~20g的白蛋白,占血漿總蛋白的50%,因此Alb顯然是一個很強的肝細胞特異性啟動子,同時肝細胞還具有其他細胞無法比擬的蛋白分泌能力。因此,上述策略理論上可以獲得較高的治療基因表達及產(chǎn)物分泌效率。

    這個策略最早是斯坦福大學的Kay課題組在血友病B的基因治療研究中使用的[13]。費城兒童醫(yī)院的High課題組在HA模型鼠中測試了這一策略,可以糾正HA小鼠的臨床表型[14]。

    這種方法雖然整合效率不高,但是治療基因的蛋白表達量相當可觀,是一個很有前景的方案,后續(xù)也有其他課題組發(fā)表了一些跟隨研究[15]。

    雖然已發(fā)現(xiàn)的F8致病突變類型已超過3000種,但在重度HA患者中約有一半都是由兩種大片段染色體倒位突變所致,分別是22號內含子倒位和1號內含子倒位。這兩種倒位的機制比較類似,都是由于F8內部以及外部存在同源序列,在雄性配子生成過程中,同源序列會誘發(fā)重組進而導致染色體倒位。兩種染色體倒位的結果都是將186kb的F8分成了方向相反的兩段,完全破壞F8導致重度HA表型[16-18]。由于這兩種倒位的患者數(shù)量在HA中占比最高,并且都是重度表型,本課題組研究了這兩種突變的特點,分別設計了針對性的基因修復策略。

    在22號內含子倒位突變中,倒位的片段長達600kb,將F8分成了141kb和45kb的兩段。由于基因內的斷裂點位于22號內含子,因此F8的26個外顯子中有22個都包含在141kb部分,而另外長達45kb的部分僅包含627bp的編碼序列。因此我們將這627bp和一個外源polyA元件通過基因打靶的方式定點整合至22號外顯子下游,從而完全修復突變的F8。我們在HA患者來源的iPSCs中驗證了這個策略,并使用TALENs來促進基因打靶效率,可以獲得50%以上的相對打靶效率。進一步將基因修復后的iPSCs定向分化為間充質干細胞和內皮細胞,均可以檢測到這些細胞獲得了表達并分泌FVIII的能力[19]。

    1號內含子倒位的斷裂點位于1號內含子,因此對于2~26號外顯子部分來說,僅缺少1號外顯子和啟動子。而1號外顯子中僅包含146bp的編碼序列,此外再整合一個啟動子即可完全修復F8。本課題組建立了一株模擬1號內含子倒位突變的HA模型鼠,然后使用腺相關病毒將肝特異性強啟動子和146bp的編碼序列定點插入到模型鼠肝細胞的2號外顯子上游。注射治療一個月之后,HA模型鼠的肝臟獲得了表達并分泌功能性FVIII的能力,并且HA疾病表型得到了有效糾正[7]。

    3 其它策略

    首爾國立大學的Kim課題組針對兩種倒位突變設計了特殊的治療策略。由于這兩類突變的直接原因都是特定染色體片段發(fā)生了倒位,因此Kim課題組通過使用CRISPR/Ca9來定點切割染色體以誘導倒位片段再次發(fā)生倒位,從而使F8能夠正常表達。針對1號內含子倒位,作者直接在同源序列內部切割,以誘發(fā)同源序列再次發(fā)生重組。對于22號內含子倒位,則在倒位片段兩側分別切割,倒位的片段會有一定的概率以非同源末端連接的方式發(fā)生倒位。他們分別制備了兩種突變HA病人來源的iPSCs,通過上述方法誘導倒位,再把成功發(fā)生倒位的細胞克隆分化成內皮細胞。修復后的內皮細胞能夠表達F8,將內皮細胞輸注到HA模型鼠體內后,對HA疾病表型有一定改善,但治療效果非常有限,大部分小鼠仍然會在剪尾試驗中死亡[20]。這種策略目前還停留在概念階段,因為要分別促使140kb、600kb的片段發(fā)生倒位,雖然在實驗室中確實能成功獲得這樣的細胞克隆,但是效率極其低下,對于臨床應用來說還是不現(xiàn)實的。

    另外,也有一些針對F8散發(fā)突變的基因治療研究。例如F8中的B區(qū)功能并不重要,理論上B區(qū)部分缺失不會影響FVIII功能,因此在大多數(shù)HA基因治療中使用的都是B區(qū)缺失的F8。在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)中已報道的發(fā)生在B區(qū)的突變有近500種,但是其中約90%會導致移碼突變導致嚴重的HA表型[16]。本課題組在臨床中就發(fā)現(xiàn)了一例14號外顯子發(fā)生了4bp缺失的HA重度患者,我們培養(yǎng)了該患者的尿液上皮細胞并將其誘導成iPSCs。再使用CRISPR/Cas9技術聯(lián)合單鏈寡核苷酸(single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN)在突變位點附近再切除14bp。這樣F8在B區(qū)總共缺少了18bp的編碼序列,可以糾正移碼突變。糾正后的iPSCs分化成內皮細胞后可以表達并分泌功能性的FVIII蛋白,并且移植到HA模型鼠體內可以糾正HA表型[21]。

    4 展 望

    在HA基因治療中,以往的完整F8表達框替代的策略最顯著的優(yōu)點是適用于任何F8突變類型的患者。其不足之處一方面是隨機整合導致的安全性擔憂和表達強度的不確定性。附加體方案又存在長期療效的問題。而且由于F8太大,全長186kb,即使使用B區(qū)缺失的BDD-F8, 編碼序列也有約4.4kb,過大的基因表達框勢必會降低導入效率。

    而定點基因編輯技術,特別是直接修復突變的基因具有諸多優(yōu)點?;虬l(fā)生了突變,猶如人的一個肢體受傷,只要把損傷處修復好即可,理論上另外安裝一個完整的肢體當然可以替代功能,但并不能說是完美的策略。

    定點基因治療可以很大程度上規(guī)避安全性和基因沉默的問題。如果突變的基因拷貝能夠在原位得到修復,則理論上可能得到跟正常人類似的結果。另外,如果能夠充分利用患者已突變的基因拷貝,則可能通過較小的序列改動就可以修復嚴重的突變。序列改動越小,則基因編輯的效率越高,這更增加了這一策略的可行性。

    F8的突變類型已超過3000種,但約一半的重度患者都是由兩種倒位突變導致[16]。由于80%以上的血友病患者為HA,僅15%左右為HB,而50%~60%的HA為重度患者,據(jù)此推算僅僅兩種突變的HA的患者數(shù)量就和HB的患者總數(shù)相當。筆者認為專門針對這兩種倒位突變設計合理、高效的基因治療策略是非常有價值的。因此本綜述花費了較多篇幅進行講述。這兩種突變倒位的片段分別長達140kb和600kb,而本課題組設計的定點修復策略僅通過定點整合幾百bp的小片段就可原位修復這類大片段倒位。

    早幾十年的HA基因治療幾乎全部使用隨機整合策略。近些年才逐漸有一些定點基因治療的研究。唯一的瓶頸就是基因定點整合的效率還有待提高。但是基因編輯技術目前正處于黃金發(fā)展期,相信最終的突破很快就會來到。因此筆者認為,HA定點基因治療是一個非常有前景的研究方向。

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