順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控天然橡膠合成的研究進展

謝全亮，朱燁萌，馬子璇，馬璐瑤，楊起航，王厚德，李鴻彬

（石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

天然橡膠（NR）是關(guān)系民生、醫(yī)療、航天和國防等領(lǐng)域的重要戰(zhàn)略物資[1]。2017年，歐盟評估世界27種稀缺原材料中，NR是唯一的生物原料，這充分說明NR在稀缺資源中的重要地位[2]。全球90%以上的NR來源于巴西橡膠樹，巴西橡膠樹是極為重要的橡膠經(jīng)濟作物。因橡膠樹的原植地破壞、葉枯病侵蝕以及人工采膠耗時耗力等原因，NR產(chǎn)量受到嚴重影響。根據(jù)天然橡膠生產(chǎn)國協(xié)會報道顯示，2010，2014，2019和2020年全球NR消費量分別為1 000萬、1 200萬、1 155萬和1 259萬t[3]。我國已連續(xù)多年為全球NR消費量最高的國家[4]，而我國NR年產(chǎn)量不足年消費量的20%，遠低于國際公認30%的安全產(chǎn)量保障線。我國NR基本依賴于進口，一旦阻斷進口渠道，我國NR產(chǎn)業(yè)則難以持續(xù)發(fā)展。因此，提高NR產(chǎn)量和尋找NR替代經(jīng)濟作物是我國工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和國防安全需求亟待解決的重要問題。

巴西橡膠樹是唯一栽培種植生產(chǎn)NR的樹木[5]。目前，每年因橡膠樹病害和12%～50%的采收割膠死皮發(fā)生率，導(dǎo)致NR損失率高達40%左右[6]。

橡膠生物合成機制的精確解析是NR基礎(chǔ)研究中的重要課題。橡膠生物合成的2種主要途徑是甲羥戊酸（MVA）途徑（在細胞質(zhì)內(nèi)進行）和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP/DOXP）途徑（在質(zhì)體內(nèi)進行），2種途徑都可以合成類異戊二烯橡膠單體IPP（C5H8）[7]。然而，在其他產(chǎn)膠植物中也發(fā)現(xiàn)了順式-1，4-聚異戊二烯橡膠（如銀菊橡膠和蒲公英橡膠）和反式-1，4-聚異戊二烯橡膠（如杜仲橡膠）[8-10]。由于反式-1，4-聚異戊二烯橡膠分子是硬質(zhì)熱塑性材料，可在低于60 ℃的溫度下快速結(jié)晶，更適合作為高爾夫球套和假牙等的材料[11]。

B.L.ARCHER等[12]在1969年首次提出橡膠轉(zhuǎn)移酶（RTase）是橡膠生物合成的主要合成酶，也是橡膠碳骨架生物合成的關(guān)鍵酶。RTase是一種順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（CPT），通過順式構(gòu)型進行附加IPP縮合，具有確定NR分子鏈長度的專門機制。2013年，巴西橡膠樹基因組草圖被首次報道[13]，揭示了橡膠生物合成不是RTase單一酶作用的結(jié)果，奠定了NR生物信息學(xué)研究基礎(chǔ)。2016年，C.R.TANG等[14]對橡膠樹基因組進一步測序，獲得1.47 Gb基因組覆蓋率為93.8%的結(jié)果。2020年，J.LIU等[15]利用Hi-C技術(shù)和單分子實時深度測序，將橡膠樹基因組裝配到18條染色體上，鑒定了許多與產(chǎn)膠相關(guān)的候選基因，發(fā)現(xiàn)部分基因與橡膠樹栽培品種中的橡膠生物合成有關(guān)。

1 聚異戊二烯和NR的生物合成調(diào)控機制

聚異戊二烯與NR分子的基本碳骨架結(jié)構(gòu)極為相似，因此二者存在相同的生物合成機制。聚異戊二烯生物合成途徑可分為4階段。第1階段中2種IPP生物合成途徑（MVA和MEP/DOXP途徑）可在植物細胞中提供IPP和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。MVA途徑是由2個乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）分子縮合形成的乙酰乙酰輔酶A（acetoacetyl-CoA）引發(fā)，再通過Acetyl-CoA進一步縮合形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMGCoA），HMG-CoA在胞質(zhì)中進一步縮合形成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS），而HMGCoA在HMG-CoA還原酶作用下還原形成關(guān)鍵的中間分子MVA；隨后MVA被磷酸化和脫羧得到IPP，所得IPP通過IPP異構(gòu)酶（IDI）轉(zhuǎn)化為DMAPP。而MEP/DOXP途徑始于丙酮酸和3-磷酸-D-甘油醛的縮合，通過1-脫氧-木糖-5-磷酸合成酶（DXS）形成DXS，通過DXS還原異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵的中間MEP，再以（5～6）∶1的比例形成IPP和DMAPP的混合物[16]。

第2和第3階段是通過異戊二烯鏈延長酶/CPT的作用，IPP與烯丙基二磷酸酯、DMAPP和低聚異戊二烯基二磷酸依次縮合形成線性類異戊二烯。實際上，有反式-異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶（tPT）和CPT 2種類型的轉(zhuǎn)移酶，其在稠合的異戊二烯單元中新形成的雙鍵的立體化學(xué)不同[17]。在第2階段中，全部E-低聚異戊二烯基二磷酸、香葉基二磷酸（GPP，C10）、法呢基二磷酸（FPP，C15）和香葉基香葉基二磷酸（GGPP，C20）都是由1—3種IPP分子通過與特定的tPT結(jié)合，再與DMAPP作用最終形成。在第3階段中，將全-E-短鏈異戊二烯基二磷酸酯用作底物，分別通過tPT或CPT構(gòu)型進行附加IPP縮合。通常RTase嚴格識別烯丙基二磷酸酯底物的異戊二烯鏈長度，并嚴格調(diào)節(jié)縮合異戊二烯單元中雙鍵產(chǎn)物的鏈長。由于難以確定異戊二烯單元的高相對分子質(zhì)量聚合物末端基團的精確結(jié)構(gòu)，因此橡膠生物合成途徑中第4階段所涉及的大多數(shù)機制仍然未知。

通過對多汁乳菇、向日葵和菊科植物等相對分子質(zhì)量小的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠進行詳細分子結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)了分配給伯醇和脂肪酸酯的低信號[18]，隨后證明橡膠樹的相對分子質(zhì)量大的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠分子具有與相對分子質(zhì)量小的順式-1，4-聚異戊二烯橡膠分子相似的部分[19]。橡膠樹的蛋白酶處理的NR的酯交換反應(yīng)表明：NR分子可能將具有飽和或不飽和C10脂肪酸結(jié)合到C20鏈上，其中18∶0和18∶1的脂肪酸占主導(dǎo)地位[20]。上述證據(jù)與混合（Z，E）型聚異戊二烯的分子結(jié)構(gòu)及其在高等植物中的酯化形式的整合顯示[21]：NR分子的α末端（與異戊二烯單元相反的一端）含有ω末端化合物，具有伯醇或脂肪酸酯的一部分。因此，橡膠生物合成的第4階段中可能是將第3階段中形成超長鏈聚異戊二烯基焦磷酸鹽至少部分去磷酸化并酯化，但是負責(zé)NR修飾的酶和確切機制仍然未知。

2 巴西橡膠樹的橡膠生物合成調(diào)控機制

橡膠生物合成是將IPP作為合成原料，先經(jīng)Acetyl-CoA的合成起始階段，接著HMG-CoA經(jīng)過轉(zhuǎn)化形成MVA，而MVA轉(zhuǎn)化成IPP，最后由多個IPP分子通過順式聚合的方式形成高分子聚合物[22]。橡膠粒子（RPs）是橡膠生物合成和貯存的特殊細胞器，RPs膜上有許多種蛋白質(zhì)共同調(diào)控橡膠生物合成[23]，主要通過調(diào)控RPs上蛋白質(zhì)的表達和酶的活性來起作用。在RPs膜上最豐富的蛋白質(zhì)是IPP、CPT、小橡膠粒子蛋白質(zhì)（SRPP）和橡膠伸長因子（REF）[24]，其中CPT占比較大，不僅影響橡膠生物合成的速度，還直接關(guān)系著膠乳的產(chǎn)量[25]。CPT、SRPP、REF和橋鏈蛋白（HRBP）等的合成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）緊密相關(guān)，質(zhì)膜上的CPT是被SRPP轉(zhuǎn)入到ER內(nèi)，而HRBP與CPT結(jié)合并相互作用后，再將CPT重新轉(zhuǎn)至質(zhì)膜中[26]。雖然這些蛋白質(zhì)在橡膠生物合成中起著積極和關(guān)鍵作用，但NR相對分子質(zhì)量大小的決定性因素仍不清楚。

橡膠樹割膠后外施乙烯、茉莉酸或者通過多次割膠刺激產(chǎn)膠，從而使流膠時間延長，達到增產(chǎn)的目的。割膠刺激會使CPT，SRPP和REF的信使核糖核酸（RNA）在乳管層和膠乳中的表達量很高[27]。SRPP同源物在乙烯的刺激下參與橡膠生物合成，與REF不同，其只能在產(chǎn)生相對分子質(zhì)量大的橡膠的植物（如巴西橡膠樹和銀膠菊）中被發(fā)現(xiàn)，而不能在產(chǎn)生相對分子質(zhì)量小的橡膠的植物（如無花果和孟加拉榕）中被發(fā)現(xiàn)，這也從側(cè)面說明了SRPP在橡膠合成延伸中更為重要。但RPs定量蛋白質(zhì)組學(xué)最新研究表明：RPs膜及結(jié)合物幾乎包含橡膠生物合成途徑中所有的蛋白酶和輔助因子以及IPP前體等，RPs上至少含有或者結(jié)合有幾百種蛋白質(zhì)及其復(fù)合物。復(fù)合物調(diào)控并不在基因水平，而在蛋白質(zhì)，特別是蛋白質(zhì)翻譯后修飾水平，這些蛋白質(zhì)包括CPT（RTase）、HMGCoA、SRPP和REF等幾種重要蛋白質(zhì)或酶的不同異構(gòu)體，其中REF可能通過其結(jié)構(gòu)域和其他REF或SRPP進行聚合，再通過轉(zhuǎn)移酶F-ATPase的β-亞基和其它亞基聚合，形成復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物，共同執(zhí)行橡膠生物合成的相關(guān)功能[28]。乙烯刺激橡膠樹增產(chǎn)的機制很可能是RPs上的蛋白質(zhì)復(fù)合物啟動關(guān)鍵調(diào)控開關(guān)，但相關(guān)功能研究還需組學(xué)分析以及在產(chǎn)膠植物中的進一步轉(zhuǎn)基因驗證。

3 CPT是橡膠生物合成中的關(guān)鍵酶

3.1 CPT可通過多條途徑影響橡膠生物合成過程

CPT又稱為橡膠轉(zhuǎn)移酶（HRT），是NR生物合成中的關(guān)鍵酶[22]，其家族成員可分別與法呢基焦磷酸（FPP）、SRPP、HRBP和REF等互相作用，調(diào)控這些關(guān)鍵蛋白的活性，從而在橡膠生物合成過程中起到重要的調(diào)控作用。橡膠樹RPs蛋白質(zhì)分離的初步研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)乙烯和機械傷害等刺激后，CPT發(fā)生蛋白質(zhì)翻譯后修飾，從而激活一系列生物學(xué)反應(yīng)，這很可能是RPs膜上的蛋白質(zhì)復(fù)合物啟動關(guān)鍵調(diào)控開關(guān)，使單分子IPP聚合形成長鏈聚合物[29]。在短角蒲公英（TB）RPs上的短角蒲公英順式-1，4-聚異戊二烯轉(zhuǎn)移酶（TbCPT）蛋白質(zhì)與SRPP共定位的結(jié)果為橡膠生物合成和應(yīng)激反應(yīng)之間的聯(lián)系提供了進一步證據(jù)[30]。

TB膠乳中共鑒定到3個CPT基因，而其他含有順式-1，4-聚異戊二烯橡膠的植物膠乳中有CPT同系物，如蒲公英、萵苣和大戟屬等植物中的CPT已被分離并重組，重組蛋白質(zhì)在體外沒有顯示出CPT活性[31]，其中的作用機制尚不清楚。但RNA干擾TB乳膠中CPT表達結(jié)果顯示[32]：膠乳含量明顯降低，橡膠轉(zhuǎn)移酶活化子（TbRTA）可結(jié)合RPs表面的CPT形成復(fù)合體，提高TbRTA活性；RNA干擾抑制TbCPT和TbRTA基因的表達，均可抑制橡膠生物合成過程，這都表明CPT參與了NR的形成。

橡膠樹橡膠轉(zhuǎn)移酶1（HRT1）、橡膠樹橡膠轉(zhuǎn)移酶2（HRT2）和橡膠樹橡膠轉(zhuǎn)移酶1-2（HRT1-2）是CPT的家族成員。據(jù)報道[33]，HRT1是來自橡膠樹HbCPT，HRT1和HRT2的重組蛋白質(zhì)，在體外是不會表現(xiàn)出CPT獨特的活性。在體外并當(dāng)引入洗滌劑洗脫的橡膠粒子（WRP）時，HRT1才能顯示出明顯的RTase活性，并且HRT1-2主要在膠乳中表達。RTases具有多種組分構(gòu)成，其中一些是膜的組分，另一些是與WRP膜蛋白質(zhì)的非共價強烈相互作用相關(guān)聯(lián)的組分，經(jīng)預(yù)測可能是橡膠生物合成蛋白質(zhì)對應(yīng)的底物以及活化劑的復(fù)雜性阻止了RTases復(fù)合物的完全重構(gòu)，從而抑制了RTases的活性[34]。WRP蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析揭示了HRT1，REF以及HRT1-REF連接蛋白質(zhì)組成了蛋白質(zhì)復(fù)合物，從WRP上組裝的該蛋白質(zhì)復(fù)合物觀察到RTases的活性增強，表明含有HRT1的復(fù)合物為橡膠生物合成機制起到重要的調(diào)控作用。

3.2 CPT是NR生物合成中的關(guān)鍵酶

RTases是唯一能夠形成CPT家族的獨特亞組，RTases對IPP底物具有較強的親和力，可防止橡膠生物合成過程中IPP的短缺，只有在IPP超過細胞代謝需求時才能產(chǎn)生長分子鏈聚合物[35]。在非產(chǎn)膠植物中，CPT與RTase易被混淆，除去RPs上35 kDa的CPT后，RTase的活性并不會產(chǎn)生影響。因此，CPT可以影響橡膠生物合成，而不影響RTase的活性。CPT還參與甾醇合成，從而形成細胞膜（可能包括RPs膜）。此外，大多數(shù)長分子鏈CPT的直接產(chǎn)物是相對短分子鏈的順式-烯丙基焦磷酸鹽，其可作為橡膠生物合成的引發(fā)劑。

不同類型CPT蛋白質(zhì)的定位是不同的，具有不同的底物結(jié)合位點，從而產(chǎn)生不同的聚合產(chǎn)物，CPT家族成員具體定位及功能必須解析清楚，這是研究CPT在NR生物合成中具體作用的前提。

自20世紀80年代R.THOMAS提出基因組學(xué)概念后，以基因組學(xué)為核心的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)、等組學(xué)相繼展開。生物信息學(xué)與多組學(xué)技術(shù)結(jié)合已經(jīng)成為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)以及系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要研究手段。產(chǎn)膠經(jīng)濟作物巴西橡膠樹[36]和蒲公英屬已相繼開展了組學(xué)研究。在轉(zhuǎn)錄組研究方面，F(xiàn).PANARA等[37]在低含膠量（LR）和高含膠量（HR）的俄羅斯蒲公英（TKS）中進行轉(zhuǎn)錄組比較顯示，LR TKS和HR TKS參與順式-1，4-聚異戊二烯生物合成的基因高度表達，并證明了倍半萜類化合物、苯丙烷類以及次級代謝單萜類化合物生物合成的基因在LR TKS中上調(diào)。用茉莉酸甲酯（JA）處理TKS幼苗根后進行轉(zhuǎn)錄組差異表達分析[38-39]，羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）、法呢基焦磷酸合酶（FPPS），IDI，GGPP和REF/SRPP的表達增加，但這些關(guān)鍵基因在轉(zhuǎn)基因功能驗證方面并未進一步闡明。JA可以調(diào)節(jié)TKS根中的次生代謝途徑，參與橡膠生物合成的幾種候選基因的表達增加，JA響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子與基因間相互作用，這些基因蛋白質(zhì)組學(xué)層面的研究現(xiàn)在還不深入。Z.LUO等[40]基于LR TKS和HR TKS根轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP），確定了合適的脫氧核糖核酸（DNA）標(biāo)記，可以在TKS生長發(fā)育早期確定橡膠產(chǎn)量。轉(zhuǎn)錄組學(xué)雖然在TKS研究中逐漸展開并取得了突破性進展，但單組學(xué)研究不能夠全面解析TKS橡膠生物合成調(diào)控機制，還需利用多組學(xué)及轉(zhuǎn)基因等手段深入研究橡膠生物合成的機制。

在蛋白質(zhì)組研究方面，2012年D.WAHLER等[41]通過雙向電泳（2-DE）分離TB的膠乳全蛋白，首次報道TB膠乳的凝膠圖譜，共鑒定了278個獨特的蛋白質(zhì)點。結(jié)果顯示，TB膠乳蛋白質(zhì)中參與脂質(zhì)代謝和運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)較多，而參與應(yīng)激反應(yīng)的蛋白質(zhì)相對較少。2019年，Q.L.XIE等[42]對TKS成熟根全蛋白質(zhì)的研究顯示：由2-DE和鳥槍法（shotgun）分別鑒定231和3 545種蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)，TKS的CPT基因啟動子具有乙烯響應(yīng)元件，這也是乙烯能促進TKS產(chǎn)膠的根本依據(jù)。結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)的2種方法分析TKS成熟根的全蛋白質(zhì)得出：橡膠生物合成的2種途徑中所包含的所有蛋白質(zhì)幾乎得到鑒定，但每種蛋白質(zhì)的家族成員鑒定還不夠全面，有些蛋白質(zhì)在TKS成熟期時并未表達，還需要進一步通過外界刺激讓其表達產(chǎn)生作用。

4 利用TKS研究橡膠生物合成的必要性

TKS是菊科，主要分布于我國新疆、哈薩克斯坦及歐洲。其根部含有大量以順式-1，4-聚異戊二烯為主的橡膠，其橡膠的分子結(jié)構(gòu)和性能與NR極為相似，由于生育期短、組織培養(yǎng)簡單、遺傳轉(zhuǎn)化容易，已成為研究產(chǎn)膠機理的模式植物[43]，同時由于其適應(yīng)性強、分布范圍廣、機械化采收便利等，被認為是最有商業(yè)化前景的NR替代資源植物。但TKS在很大程度上未被馴化，存在一些固有問題，尤其是其橡膠生物合成能力未達到規(guī)?；N植要求，制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。解析TKS橡膠生物合成機理是快速提高TKS橡膠產(chǎn)量的重要途徑之一。前期蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TKS的MVA和MEP途徑中所有蛋白質(zhì)都參與橡膠合成，TKS基因組中鑒定了8種CPT和2種編碼RPs蛋白質(zhì)基因CPTL，并且其家族成員CPTL1在乳膠中高度表達，這些家族成員為后續(xù)CPT基因的具體功能研究提供了更多靶標(biāo)基因[42]，但調(diào)控橡膠生物合成的關(guān)鍵基因/蛋白質(zhì)還未精確解析。深入研究TKS中CPT在橡膠合成調(diào)控復(fù)合物的組成及不同組成部件的具體生物學(xué)功能，很可能為揭示橡膠生物合成和調(diào)控的精準(zhǔn)機制提供新的研究思路。

5 TKS是補充或替代NR的新型產(chǎn)膠植物

TKS是二倍體多年生草本植物，根部橡膠質(zhì)量分數(shù)可達約0.24，其產(chǎn)膠周期短、生長適應(yīng)性強、具有較高成活率和大規(guī)模栽培的能力[43-44]。然而，TKS具有與其他蒲公英屬高雜合性、自交不親和性以及橡膠含量未達到商業(yè)上規(guī)?；N植要求等特性[45]。TKS高雜合性對于產(chǎn)生完整的基因組序列和以其作為產(chǎn)膠經(jīng)濟作物提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。

從TKS中已克隆了控制橡膠生物鏈延長及合成的基因，并且對其功能進行了初步分析[46-48]，但研究僅局限于其橡膠生物合成的代謝途徑等方面。

基于TKS基因組的公布[48]，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究[49]也不斷深入。利用TKS基因組深入分析數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)一些與自交衰退相關(guān)的可能候選區(qū)域，證實了TKS自交不親和性的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。TKS基因組成功解析大大降低了克隆橡膠生物合成的關(guān)鍵基因的難度，加速推進基于基因組信息的TKS農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析，從而提升通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因編輯技術(shù)提高TKS分子育種的能力，也加速TKS中橡膠生物合成的分子機制研究和遺傳改良優(yōu)質(zhì)品種的進程。

6 結(jié)語

目前橡膠生物合成和調(diào)控很可能主要是在RPs膜上進行的，通過促進RPs膜上蛋白質(zhì)復(fù)合物中重要蛋白質(zhì)的磷酸化、泛素化和糖基化等翻譯后修飾來精準(zhǔn)調(diào)控橡膠的生物合成。然而，調(diào)控CPT家族關(guān)鍵成員與上下游相關(guān)蛋白質(zhì)以及橡膠生物合成的具體調(diào)控機制還不清楚。未來應(yīng)主要開展產(chǎn)膠植物CPT的關(guān)鍵家族成員的研究，以及利用植物激素等刺激產(chǎn)膠植物尋找CPT在橡膠生物合成中的規(guī)律。通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合，找到橡膠生物合成的關(guān)鍵RNA和蛋白質(zhì)，確定蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控方式，挖掘和篩選橡膠生物合成的關(guān)鍵基因/蛋白質(zhì)，同時結(jié)合基因編輯和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，精確解析橡膠生物合成的關(guān)鍵代謝途徑和關(guān)鍵基因/蛋白質(zhì)，獲得較為重要的原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)，為今后優(yōu)質(zhì)TKS的分子育種提供理論依據(jù)和基因資源，以及為NR產(chǎn)業(yè)多元化升級提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。