基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究“CRPC治療方”治療CRPC的作用機(jī)制

李?lèi)?ài)玉 張志明 宋忠陽(yáng) 朱 鵬 徐 倩 李高勤

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院腫瘤科，甘肅蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，甘肅蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，甘肅蘭州 730000

根據(jù)2019年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的最新數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌高居美國(guó)男性新發(fā)癌癥的第1 位，其病死率居于第2 位[1]。在我國(guó)男性惡性腫瘤發(fā)病率中居于第6 位，病死率居于第9 位[2]。晚期前列腺癌患者通常采用內(nèi)分泌療法治療，但經(jīng)過(guò)中位時(shí)間18～24 個(gè)月后，大多數(shù)患者特異性標(biāo)志物前列腺特異性抗原（PSA）再度升高，提示腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了耐藥性，臨床稱(chēng)為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC）[3]。常規(guī)治療無(wú)效后，患者通常面臨著生存周期縮短，生活質(zhì)量下降等問(wèn)題，近年來(lái)，中醫(yī)藥在CRPC 患者生存周期以及生活質(zhì)量等方面取得了較大的進(jìn)展。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源、錄入及規(guī)范

電子計(jì)算機(jī)檢索CNKI、萬(wàn)方、維普以及CBM數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的已公開(kāi)發(fā)表的中醫(yī)藥治療CRPC 的個(gè)人醫(yī)案。檢索時(shí)間從2000年1月1日至2021年10月31日，篩選后共納入29 篇文獻(xiàn)，36 個(gè)中藥處方，將其錄入表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得出中藥113 味，后參照《中華人民共和國(guó)藥典》[4]以及《中藥大辭典》[5]對(duì)藥物名稱(chēng)進(jìn)行規(guī)范化處理。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①文章中提出西醫(yī)診斷為CRPC；②文獻(xiàn)中醫(yī)案處方、藥物組成明確，并有明確臨床療效者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷不明確或錯(cuò)誤的醫(yī)案；②醫(yī)案中就診次數(shù)過(guò)多且藥物變化描述及療效不明確者。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將處方錄入Microsoft Office Excel 2017 統(tǒng)計(jì)表格中，經(jīng)過(guò)中藥規(guī)范化處理后，通過(guò)矩陣分析等統(tǒng)計(jì)藥物頻次。

1.4 關(guān)鍵中藥治療CRPC可能機(jī)制探討

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，將OB、DL 分別設(shè)置為≥0.3、≥0.18[6]，以此為篩選條件獲取中藥活性成分，再次將活性成分的Smiles 結(jié)構(gòu)序列導(dǎo)入Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，以置信度閾值評(píng)估預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中以“castration-resistant prostate cancer”為關(guān)鍵詞檢索收集疾病相關(guān)靶點(diǎn)；并利用Venny 2.1.0得到潛在靶點(diǎn)。將潛在靶點(diǎn)上傳至String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)；并利用Cytoscape 3.8.2 的CytoNCA 插件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。最后應(yīng)用Metascape 進(jìn)行GO 富集分析與KEGG 通路分析，最后利用R 語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)藥治療CRPC的中醫(yī)藥統(tǒng)計(jì)

通過(guò)矩陣分析等統(tǒng)計(jì)藥物頻次，前十位分別為黃芪、熟地黃、茯苓、姜黃、白術(shù)、補(bǔ)骨脂、黨參、炙甘草、白花蛇舌草、莪術(shù)，取以上藥物組成“CRPC 治療方”。

2.2 “CRPC治療方”中藥物活性成分及治療CRPC的作用靶點(diǎn)

在TCMSP 中篩選后共得到174 個(gè)活性成分，其中黃芪20 個(gè)、熟地黃2 個(gè)、茯苓15 個(gè)、姜黃3 個(gè)、白術(shù)7 個(gè)、補(bǔ)骨脂4 個(gè)、黨參21 個(gè)、甘草92 個(gè)、白花蛇舌草7 個(gè)、莪術(shù)3 個(gè)，去除重復(fù)值共得到157 個(gè)活性成分，后通過(guò)PubChem 收集藥物活性成分的Smiles 結(jié)構(gòu)序列。

將收集到的Smiles 結(jié)構(gòu)序列導(dǎo)入至Swiss TargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)值后共得到136 個(gè)作用靶點(diǎn)。利用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選CRPC 靶點(diǎn)，整理并去除重復(fù)值后，共獲得1396 個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)Venny 2.1.0 取藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集，共得到99 個(gè)“CRPC 治療方”治療CRPC 的潛在作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

2.3 篩選“CRPC治療方”治療CRPC的核心靶點(diǎn)

通過(guò)String 數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建“活性成分-基因靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2，根據(jù)Degree 值排序可知核心化學(xué)成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、甘草查爾酮A、芒柄花黃素等；根據(jù)表示靶點(diǎn)之間相關(guān)性的Degree 值排序可知核心靶點(diǎn)為STAT3、c-jun、TP53、HIF1A、ESR1 等。

將疾病與處方的交集基因?qū)胫罜ytoscape 3.8.2 的CytoNCA 插件中，網(wǎng)絡(luò)共有91 個(gè)節(jié)點(diǎn)，716條邊，節(jié)點(diǎn)的平均Degree 值為15.7。根據(jù)BC、CC、DC、EC、LAC 及NC 的中位值進(jìn)行兩次過(guò)濾后，可得出“CRPC 治療方”治療CRPC 的核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

2.4 GO富集分析

在Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)入99 個(gè)疾病藥物交集靶點(diǎn)并進(jìn)行GO 富集分析。分析結(jié)果顯示，共包括1777 個(gè)生物過(guò)程、40 個(gè)細(xì)胞組分以及153 個(gè)分子功能。根據(jù)P值大小進(jìn)行排序，選擇前10 個(gè)結(jié)果繪制柱狀圖，見(jiàn)圖4。由圖可知，GO 富集分析結(jié)果主要涉及應(yīng)答氧化應(yīng)激、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過(guò)程以及膜區(qū)、膜微區(qū)、膜筏等細(xì)胞組分，泛素-如蛋白質(zhì)連接酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性等分子功能。

2.5 KEGG通路分析

將99 個(gè)疾病藥物交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果顯示與PI3K-Akt信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、前列腺癌等148 條信號(hào)通路有關(guān)，并根據(jù)通路富集基因的個(gè)數(shù)排序，取前30 條通路繪制柱狀圖，見(jiàn)圖5。由圖可知，基因富集數(shù)目最多、最顯著的通路是PI3K-Akt 信號(hào)通路。并對(duì)PI3K-Akt 信號(hào)通路進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖6，由圖可知，“CRPC 治療方”通過(guò)多個(gè)上下游蛋白調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路。

3 討論

前列腺癌癌細(xì)胞對(duì)雄激素途徑有高度敏感性，通過(guò)激素調(diào)控和去勢(shì)可導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，目前CRPC 臨床仍常用雄激素剝奪治療聯(lián)合糖皮質(zhì)激素進(jìn)行治療，但常出現(xiàn)耐藥的問(wèn)題[6]。因此，尋找一種療效佳、安全且復(fù)發(fā)率低的治療手段具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿、姜黃素、人參皂苷等中藥單體可通過(guò)相關(guān)靶點(diǎn)直達(dá)疾病要點(diǎn)[7]，使中醫(yī)藥治療CRPC 取得更進(jìn)一步的發(fā)展，也為CRPC 的治療提供新的思路及方向。

本研究通過(guò)整理近年公開(kāi)發(fā)表的治療CRPC的中醫(yī)處方后發(fā)現(xiàn)，用藥頻率前十位的中藥分別是黃芪、熟地黃、茯苓、姜黃、白術(shù)、補(bǔ)骨脂、黨參、炙甘草、白花蛇舌草、莪術(shù)；此組方中黃芪、黨參、炙甘草益氣扶正，茯苓、白術(shù)健脾運(yùn)脾，熟地黃、補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎填精，姜黃、莪術(shù)行氣活血，白花蛇舌草兼清里熱。CRPC 的中醫(yī)病機(jī)可概括為本虛標(biāo)實(shí)、脾腎兩虛，兼有濕、痰、瘀、毒，綜合分析，上述處方治法可總結(jié)為“補(bǔ)腎健脾、益氣活血、兼清里熱”，符合上述病機(jī)。遂后期加以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析以期揭示其潛在治療靶點(diǎn)及機(jī)制。

分析“活性成分-基因靶點(diǎn)”圖，Degree 值排名前三的中藥活性成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚；以上三種均為黃酮類(lèi)化合物，具有多種生物活性、廣泛的藥理作用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，單用槲皮素、木犀草素、山奈酚或與化療藥物聯(lián)合使用表現(xiàn)出抑癌性，其抗癌作用在前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等幾種癌癥中已經(jīng)顯現(xiàn)[8]，對(duì)于前列腺癌的抗癌作用可總結(jié)如下：①抑制癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡；②抑制癌細(xì)胞的侵襲與遷移；③抑制腫瘤血管新生及增加抗癌藥物的敏感性；④逆轉(zhuǎn)耐藥性；⑤誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯等[9-13]。這與本研究結(jié)果相符。

GO 富集分析主要涉及在細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、應(yīng)答氧化應(yīng)激、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)等生物過(guò)程，膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等細(xì)胞組分，泛素-如蛋白質(zhì)連接酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性等分子功能。KEGG 富集分析主要涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、前列腺癌等通路，其中PI3K-Akt 信號(hào)通路富集數(shù)目最多，提示該信號(hào)通路可能與“CRPC 治療方”的治療作用密切相關(guān)。CRPC 細(xì)胞可表達(dá)出大量活化的PI3K和Akt，對(duì)癌細(xì)胞的增殖、代謝及凋亡起到一定的調(diào)節(jié)作用，且會(huì)影響細(xì)胞周期，對(duì)CRPC 的發(fā)展起到十分重要的作用[14]。除此之外，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Akt 的激活程度會(huì)顯著影響預(yù)后，且呈正相關(guān)[15]。本研究KEGG 通路分析亦提示與人巨細(xì)胞病毒感染、前列腺癌等通路密切相關(guān)，以上通路亦與CRPC 的發(fā)病密切相關(guān)，本研究提示，以上分析提示“CRPC 治療方”的作用機(jī)制與多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路相關(guān)，“CRPC治療方”治療CRPC 可能通過(guò)PI3K-Akt 通路等多條信號(hào)通路發(fā)揮抗癌等治療作用。

綜上所述，本研究通過(guò)處方統(tǒng)計(jì)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析探討了“CRPC 治療方”治療CRPC 的潛在作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)“CRPC 治療方”可能通過(guò)槲皮素、木犀草素、山奈酚等多種活性成分，作用在STAT3、c-jun、TP53、HIF1A、ESR1 等多個(gè)疾病靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、前列腺癌等通路調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、代謝及凋亡，進(jìn)而延緩CRPC 的疾病進(jìn)程，改善患者生活質(zhì)量。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)“CRPC 治療方”通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療CRPC，這為后續(xù)進(jìn)一步深入研究CRPC 的治療方法奠定了一定的基礎(chǔ)。