CXCLs通過(guò)免疫浸潤(rùn)對(duì)皮膚黑色素瘤患者預(yù)后的影響

邵珊珊 黃俊星▲ 張 虎 金紅松

1.江蘇省泰州市人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇泰州 225300；2.江蘇省泰州市人民醫(yī)院急診外科，江蘇泰州 225300

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）的發(fā)病率以每年3%～5%的速度快速上漲[1]。由于其具有高度的惡性和侵襲性，導(dǎo)致大多數(shù)皮膚癌患者病死。SKCM 已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[2]，給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找合適的預(yù)后標(biāo)志物對(duì)提供新的治療靶點(diǎn)具有重要臨床價(jià)值。趨化因子是一個(gè)大家族的低分子量（8～14 kDa）趨化細(xì)胞因子，其與特定受體結(jié)合，并在受體細(xì)胞中引發(fā)定向趨化運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖、血管形成、腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞特性、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]，直接和間接地影響腫瘤免疫和癌癥進(jìn)展。CXC 是這個(gè)家族的重要成員[4]，腫瘤微環(huán)境中的CXC 趨化因子可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和腫瘤細(xì)胞活性，起到抗腫瘤免疫的作用，影響患者預(yù)后[5]。然而趨化因子CXC 在SKCM 中的表達(dá)水平及對(duì)預(yù)后的影響尚不清楚。有研究報(bào)道了CXC 趨化因子在SKCM 中的表達(dá)和功能[6]，但尚不清楚哪種CXC 趨化因子可作為SKCM 預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究將從CXC 趨化因子中尋找可作為SKCM 預(yù)后的標(biāo)志物，并試圖揭示其影響SKCM預(yù)后的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 患者樣本

本研究包括兩個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集：①腫瘤與癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA），提供了472 位SKCM 患者的轉(zhuǎn)錄組信息和臨床信息；②組織基因型表達(dá)圖譜（genotype-tissue expression，GTEx）的正常人轉(zhuǎn)錄組信息和臨床信息。TCGA 患者特征下載自http://www.portal.gdc.cancer.gov。GTEx 患者特征下載自http://commonfund.nih.gov。

1.2 Oncomine

Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)是腫瘤相關(guān)基因研究的數(shù)據(jù)庫(kù)，整合了TCGA、基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus data base，GEO）和已發(fā)表的文獻(xiàn)等來(lái)源的RNA 和DNA-seq 數(shù)據(jù)[7]。在本研究中，利用Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索功能，導(dǎo)出17 種CXC趨化因子mRNA 在SKCM 中的表達(dá)差異圖（設(shè)定P-value 閾值為0.05，F(xiàn)old Change 閾值為2，Gene Rank 閾值為T(mén)OP 10%）。

1.3 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析網(wǎng)站（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）

GEPIA 網(wǎng)站云端包含TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)的9736 個(gè)腫瘤樣本和8587 個(gè)正常樣本的RNA 測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)[8]。本研究通過(guò)使用GEPIA 的“單基因分析”功能來(lái)分析16 種CXC 趨化因子在SKCM腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異及在SKCM 不同病理分期的表達(dá)情況。利用“生存分析”模塊分析16 種CXC 趨化因子表達(dá)水平對(duì)SKCM 患者預(yù)后的影響。篩選出與臨床病理分期和預(yù)后相關(guān)的CXC 家族基因。

1.4 TISIDB

TISIDB 是腫瘤免疫相關(guān)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)，囊括2530 種出版物中的4176 條記錄，記錄了988 個(gè)與抗腫瘤免疫相關(guān)的基因、高通量篩選和基因組圖譜數(shù)據(jù)結(jié)合分析與T 細(xì)胞殺傷或免疫治療相關(guān)的基因[9]。本研究中通過(guò)TISIDB 網(wǎng)站分析篩選CXC 家族基因與腫瘤浸潤(rùn)淋巴結(jié)細(xì)胞的相關(guān)性，分析腫瘤免疫特征。

1.5 Cibersort

Cibersort 是基于線性支持向量回歸原理對(duì)免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積的工具，可用RNA-Seq 的數(shù)據(jù)來(lái)估計(jì)SKCM 組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相對(duì)豐度[10]。然后利用R 語(yǔ)言的Limma 包進(jìn)行差異分析，根據(jù)篩選出的CXC 家族基因表達(dá)的高低將SKCM 樣本分組，比較不同表達(dá)組織中的免疫浸潤(rùn)差異。

1.6 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA 是可下載后免費(fèi)使用的全基因組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析工具。本研究利用LinkedOnmic 網(wǎng)站模塊[11]，對(duì)篩選出的CXC 家族基因的相關(guān)基因進(jìn)行GSEA 富集分析，研究該基因主要影響哪些免疫功能通路。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用R 語(yǔ)言（v4.0.0）和相應(yīng)的R 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)變量分析采用Studentt檢驗(yàn)，進(jìn)行Spearman 相關(guān)分析，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXC趨化因子在SKCM中的差異表達(dá)

利用Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)分析16 種CXC 趨化因子在SKCM 中的表達(dá)（圖1）。結(jié)果顯示，與正常皮膚組織相比，SKCM 患者的CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10 轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。CXCL12、CXCL14 轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL11、CXCL13、CXCL16、CXCL17 的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異。

通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了16 種CXC 趨化因子在SKCM 患者和正常皮膚組織中的表達(dá)差異（圖2），結(jié)果表明，與正常皮膚組織相比，CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在腫瘤組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），CXCL12、CXCL14 在正常皮膚組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL16、CXCL17 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。

2.2 CXC趨化因子與SKCM患者病理分期的關(guān)系

通過(guò)GEPIA 對(duì)CXC 趨化因子與SKCM 患者的病理分期相關(guān)性進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，CXCL4（F=2.620，P=0.035）、CXCL9（F=6.180，P=0.000）、CXCL10（F=6.010，P=0.000）、CXCL11（F=4.950，P=0.000）、CXCL12（F=3.370，P=0.010）、CXCL13（F=4.830，P=0.001）與SKCM 的病理分期顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見(jiàn)圖3。CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13 高表達(dá)促進(jìn)SKCM 的進(jìn)展。因此，本研究結(jié)果提示CXC 趨化因子與SKCM 的病理過(guò)程密切相關(guān)。

2.3 CXC趨化因子對(duì)SKCM患者預(yù)后的影響

利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析16 種CXC 趨化因子與SKCM 患者預(yù)后的關(guān)系，熱圖（圖4A）顯示了不同CXC 趨化因子的對(duì)數(shù)比例（log10）。下方和上方（原圖中分別為藍(lán)色和紅色）分別表示風(fēng)險(xiǎn)較高和較低。帶有框架的矩形意味著顯著相關(guān)。結(jié)果表明，CXCL4（P=0.003）、CXCL9（P=0.000）、CXCL10（P=0.007）、CXCL11（P=0.006）、CXCL13（P=0.008）、CXCL16（P=0.016） 與SKCM 患 者預(yù)后顯著相關(guān)。其中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 在SKCM 中是低風(fēng)險(xiǎn)基因，CXCL4 是高風(fēng)險(xiǎn)基因。同時(shí)使用GEPIA Survival Analysis 模塊，分別對(duì)CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 與SKCM 總生存期（overall survival，OS）的關(guān)系進(jìn)行Log-Rank 分析，結(jié)果表明（圖4B），CXCL4（χ2=14.401，P=0.003）低表達(dá)的SKCM 患者有更好的OS，CXCL9（χ2=27.887，P=0.000）、CXCL10（χ2=32.733，P=0.000）、CXCL11（χ2=27.194，P=0.000）、CXCL13（χ2=29.958，P=0.000）、CXCL16（χ2=10.819，P=0.004）高表達(dá)的SKCM 患者有更好的OS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。見(jiàn)圖4C～G。

綜合以上結(jié)果，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在SKCM 患者腫瘤組織中高表達(dá)，同時(shí)又是SKCM 患者預(yù)后的低風(fēng)險(xiǎn)基因，即在腫瘤組織中高表達(dá)的基因提示預(yù)后較好。提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可能具有潛在的抗腫瘤作用。因此，后續(xù)將研究這4 種CXC 趨化因子是通過(guò)何種途徑影響SKCM 患者預(yù)后的。

2.4 CXC趨化因子與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

CXCL 家族基因?yàn)橼吇蜃?，?shì)必會(huì)影響腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。首先在TISIDB 網(wǎng)站采用Spearman 相關(guān)檢驗(yàn)，分別研究SKCM 患者中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可 能 調(diào) 控哪些類(lèi)型的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）。結(jié)果表明，這四種基因與ACT CD8+T、Tem CD8、ACT CD4+T、Tfh、Th1、ACT B、Lmm B、NK 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在SKCM 中呈正相關(guān)（圖5、表1）。

表1 趨化因子與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞Spearman相關(guān)系數(shù)列表

運(yùn)用CIBERSORT 算法計(jì)算每位SKCM 患者的22 種免疫細(xì)胞豐度，驗(yàn)證根據(jù)CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 基因表達(dá)模式確定的SKCM 患者在高表達(dá)組和低表達(dá)組中腫瘤免疫微環(huán)境的差異狀態(tài)。結(jié)果表明，漿細(xì)胞、幼稚B 細(xì)胞、Tfh 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、活化的NK 細(xì)胞等抗腫瘤免疫細(xì)胞在CXC 趨化因子高表達(dá)的患者中浸潤(rùn)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見(jiàn)圖6。

2.5 CXC趨化因子的生物過(guò)程分析

用LinkedOmic 網(wǎng)絡(luò)工具對(duì)CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 及其相互作用密切的基因進(jìn)行GSEA 富集分析，以明確其主要影響的生物過(guò)程。結(jié)果顯示，炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、白細(xì)胞趨化性以及細(xì)胞對(duì)干擾素、白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子的反應(yīng)與SKCM 的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。KEGG 信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，CXC 趨化因子及其相關(guān)基因的功能主要集中在趨化因子結(jié)合、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-受體相互作用、TNF 信號(hào)通路、NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 與SKCM 的抗腫瘤免疫力相關(guān)。見(jiàn)圖7。以上結(jié)果表明，CXC 趨化因子影響SKCM 患者的預(yù)后可能與CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 介導(dǎo)的腫瘤免疫浸潤(rùn)相關(guān)。

3 討論

SKCM 是最常見(jiàn)的黑色素瘤類(lèi)型，占所有黑色素瘤病例的91.2%[12]，為侵襲性皮膚癌，是造成皮膚癌患者病死的主要原因[13]。近年來(lái)，腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑在SKCM 的治療中已經(jīng)顯示出顯著的臨床效果，然而，大部分SKCM 患者免疫治療的總體應(yīng)答率仍有待提高。因此，尋找SKCM 預(yù)后特征，對(duì)SKCM 患者預(yù)后進(jìn)行分層并制訂精確的個(gè)體化治療方案顯得尤為重要。

趨化因子是組織內(nèi)協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞遷移和定位的一種微小的蛋白質(zhì)分子[14]，其與特定受體結(jié)合，是誘導(dǎo)趨化性、促進(jìn)免疫細(xì)胞分化和導(dǎo)致組織外滲的重要分子。在腫瘤微環(huán)境中，趨化因子為促進(jìn)免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境提供了豐富的“土壤”[15]，分為五個(gè)主要家族：CXC、CC、CX3C、XC 和CX，其中CXC 趨化因子在家族中占有重要地位。CXC 趨化因子及其受體在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，能促進(jìn)血管生成以及腫瘤細(xì)胞增殖、存活和擴(kuò)散[16]。然而，關(guān)于CXC 趨化因子在SKCM 中的表達(dá)及預(yù)后研究卻很少。

本研究應(yīng)用Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)和GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)16 種CXC 趨化因子mRNA 進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示，8 種CXC 趨化因子（CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14）在SKCM 患者腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），其中CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13 高表達(dá)促進(jìn)SKCM 的進(jìn)展。提示CXC 趨化因子可能與SKCM 的病理過(guò)程密切相關(guān)。有研究指出，CXCL1通過(guò)激活VEGF 途徑促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的存活、侵襲和增殖[17]。CXCL8 通過(guò)維持內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和活性促進(jìn)腫瘤血管生成[18]。CXCL9、CXCL10、CXCL13 通過(guò)增強(qiáng)腫瘤血管的通透性促進(jìn)黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[19]，也可通過(guò)抑制T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)率增加[20]。而CXCL11 在各種人類(lèi)癌癥的致癌過(guò)程中均起到調(diào)控作用[21]。以上研究與本研究的數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果相吻合。

通過(guò)進(jìn)一步分析CXC 趨化因子與生存率之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 表達(dá)與SKCM 患者OS 密切相關(guān)，有研究表明，血小板水平高的患者比CD8+T 細(xì)胞水平高和血小板水平低的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其總體生存率低，而CXCL4 由血小板產(chǎn)生，當(dāng)CD8+T細(xì)胞和血小板之間的平衡被破壞時(shí)，CXCL4 可通過(guò)抑制CD8+T 細(xì)胞功能而影響預(yù)后[22]。CXCL9、CXCL10、CXCL11 有幾個(gè)相似的特征，其在生物結(jié)構(gòu)和生物功能方面表現(xiàn)出相同的特性，在膀胱癌中可通過(guò)招募表達(dá)CXCR3 的T 淋巴細(xì)胞或通過(guò)抑制血管生成而具有有效的抗腫瘤特性[23]。CXCL10 的表達(dá)可吸引CTL 進(jìn)入ESCC 組織，并可能對(duì)患者生存起到積極作用[24]，以上研究也驗(yàn)證了本研究的數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

需要注意的是，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在腫瘤組織中高表達(dá)，同時(shí)又是預(yù)后的低風(fēng)險(xiǎn)因素，提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 是SKCM 的重要基因，可能具有某些潛在的抗腫瘤作用。眾所周知，趨化因子是介導(dǎo)免疫細(xì)胞趨化和淋巴組織發(fā)育的趨化性細(xì)胞因子，那么這些趨化因子勢(shì)必會(huì)影響腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞。CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 影響腫瘤預(yù)后的途徑可能與其相關(guān)。在TISIDB 網(wǎng)站分別研究泛癌中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可能調(diào)控的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞類(lèi)型。結(jié)果表明，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 與抗腫瘤免疫細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。運(yùn)用ciBersort 算法計(jì)算出每位SKCM患者的22 種免疫細(xì)胞豐度，在高表達(dá)CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 的患者中，B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞等抗腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)更高，這可能與更佳的預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，本研究主要確定了4 個(gè)CXC 趨化因子成員（CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13），為SKCM 腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要生物標(biāo)志物，其表達(dá)水平與預(yù)后和免疫浸潤(rùn)密切相關(guān)。需要注意的是，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 有共同的受體CXCR3，因此，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 是否通過(guò)CXCR3 軸來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。