RNAm6A去甲基化酶FTO在體外培養(yǎng)肝細胞中的脂肪代謝作用研究

王 倩 折瑞蓮 沙文瓊 林湖濱

深圳市人民醫(yī)院產(chǎn)科，廣東深圳 518020

代謝性疾病是肥胖人群健康的主要威脅，通過多種方法尋找克服肥胖問題仍然不能有效合理調(diào)控肥胖人群肝臟細胞代謝平衡[1-2]。脂肪與肥胖相關基因（fat mass and obesity-associated，F(xiàn)TO）于1999年被發(fā)現(xiàn)，2007年經(jīng)鑒定其編碼為去甲基化酶[3-4]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)FTO 與多種疾病有關，如代謝紊亂、腫瘤、肥胖、心腦血管疾病等[5-7]。FTO 編碼去甲基化酶，其底物是RNA，催化RNA 上的6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）發(fā)生去甲基化，調(diào)控基因表達，參與細胞的多種生命活動[8]。FTO 在不同組織中的功能不同，如在黑色素瘤、宮頸癌、乳腺癌、急性髓性白血病中具有癌基因的功能；在肝內(nèi)膽管癌、卵巢癌、腎癌則發(fā)現(xiàn)其具有抑癌基因的作用[9-10]。對于正常肝細胞的代謝調(diào)控作用尚不清楚，本研究采用正常肝細胞HL-7702，研究FTO 如何通過m6A 調(diào)控肝細胞增殖、脂肪代謝相關基因水平變化，為脂肪肝等肝臟疾病提供治療與指導。

1 材料與方法

1.1 一般材料

RPMI-1640 培養(yǎng)基（KGM31800）、CCK-8 試劑（KGA317）、TMG、cycloleucine 均購自南京凱基；m6A甲基化檢測試劑盒（ab233488）、甘油（ab133130）均購自Abcam；甘油檢測試劑盒購自Elabscience（E-BCK261-M）；胎牛血清購自杭州四季青（11011-8611）；FTO-OE 過表達載體購自廣州基旦生物；FTO-sh干擾載體購自廣州艾基生物；RT-qPCR 反轉錄試劑盒購自Bio-Rad（1725121）；qPCR 引物購自上海生工?？贵w購自CST 公司；人肝正常細胞HL-7702 購自武漢普諾賽公司（CL-0111）；293T 細胞購自中國科學院上海細胞庫（GNHuh7）；SDSPAGE 凝膠試劑盒（P0012A）、蛋白裂解液RIPA（P0013C）均購自碧云天；lipofectamine 2000（11668030）、TRIzol（1590618）均購自Invitrogen。

1.2 儀器與設備

qPCR 儀器（Bio-Rad，M400）、酶標儀（博璐騰，型號DC220）、超凈臺（蘇州超凈，型號WT-2ND）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，型號BB150）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 使用RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝正常細胞HL-7702、293T 細胞，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.3.2 FTO-OE 及FTO-sh 載體構建 構建FTO 過表達及干擾載體，使用293T 細胞。DNA（帶有綠色熒光蛋白標簽）與轉染試劑的比例為1∶2～1∶3。250 μl Opti-MEM 稀釋2 μg 目的基因載體，室溫靜置5 min。將脂質體混合液慢慢滴加到質?；旌弦汗苤屑尤爰毎?。4～6 h 后，棄掉培養(yǎng)基，補入含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)基。

1.3.3 外源性甲基化激活劑三甲基甘氨酸與外源性甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸分別對細胞增殖的影響 不同濃度的TMG 對肝細胞增殖的影響：HL-7702細胞貼滿96 孔板后進行處理，試驗分為7 組，三甲基甘氨酸終濃度分別為0、1、2、4、8、16、32 mmol，處理48 min 后CCK-8 法檢測細胞增殖情況，并使用Graphpad Prism 6.0 計算IC50。不同濃度的cycloleucine 對肝細胞增殖的影響：HL-7702 細胞貼滿96 孔板后進行處理，隨機分為4 組，cycloleucine終濃度分別為0、10、20、40 mmol，處理24 min 后采用CCK-8 法檢測細胞增殖情況。

1.3.4 qPCR 分析 收集藥物作用后48 h 的細胞，加入200 μl Trizol。加入0.2 ml氯仿，輕微振蕩15 s，靜置2 min。4℃離心，12 000 g，離心15 min，取上清。加入0.5 ml 異丙醇，室溫靜置10 min。4℃離心，12 000 g，離心10 min，棄上清。加入1ml 75%乙醇，洗滌沉淀。4℃離心，7500 g，離心5 min，棄上清，加入DEPC水溶解。反轉錄條件：37℃，15 min；85℃，5 s。qPCR 體系：模板，1 μl；F 引物，0.4 μl，R 引物（10 μmol），0.4 μl；2x PerfecStar qPCR SuperMix，10 μl；Nuclease free-Water，8.2 μl。使用兩步法分析基因表達，程序如下，95℃ 5 s，60℃ 5 s，然后42 個循環(huán)擴增分析基因表達（95℃，15 s；60℃，1 min）。使用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達，以GAPDH 表達為對照。

1.3.5 Western blot 實驗 收集藥物作用后的細胞，蛋白裂解變性，BCA 法測定蛋白濃度。SDSPAGE 膠電泳分離樣品，并通過濕轉法將蛋白轉移到PVDF 上。5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，TBST 洗膜3 次，將稀釋好的一抗浸沒PVDF 膜，4℃孵育過夜。第2 天，TBST 洗膜3 次，然后加入相應的二抗，室溫孵育1 h，化學發(fā)光法進行顯影。

1.3.6 m6A 甲基化定量檢測 細胞加藥處理后48 h收集細胞。RNA 結合：加80 μl 結合液到酶標板。m6A RNA 捕獲：加50 μl 稀釋的捕獲抗體液。50 μl 稀釋的抗體檢測液，孵育30 min。50 μl 稀釋的增強液，孵育30 min。標準曲線制作，使用1x TE 緩沖液稀釋陽性對照物，濃度為0.5 ng/μl。洗脫緩沖液以1∶2000 比例稀釋抗體檢測液。根據(jù)使用0.5 ng/μl 陽性對照液和1×TE 緩沖液制備6 種不同濃度，分別為0、0.2、0.4、0.8、1.6 和3.2 ng/μl，繪制標準曲線。

1.3.7 甘油水平檢測 甘油水平檢測按照試劑盒說明書進行。細胞加藥處理，48 h 后收集細胞。按比例每（1～2）×106細胞加100 μl 裂解液，混勻裂解。65℃左右加熱10 min 滅活脂肪酶，可見絮狀沉淀出現(xiàn)。5000 r/min 離心5 min。工作溶液的配制，按R1∶R2=4∶1 比例，即取4 ml 試劑R1 試劑與1 ml 試劑R2 試劑混合。標準品稀釋，用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，繪制標準曲線。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，行t檢驗，計數(shù)資料用[n（%）]表示，行χ2檢驗，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。使用Graphpad Prism 6.0 軟件作圖。

2 結果

2.1 Western blot及qPCR分析FTO表達水平

在人正常肝細胞HL-7702 過表達FTO，Western blot 及qPCR 分析其表達，發(fā)現(xiàn)FTO 的mRNA 與蛋白表達水平皆有提高（圖1A～B）。接下來，使用同樣的方法干擾FTO 表達，發(fā)現(xiàn)FTO 的mRNA 與蛋白表達水平皆有降低，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）（圖1C～D）。這些結果表明，構建的FTO 過表達載體（FTO-OE）及干擾載體（FTO-sh）均有效果。

2.2 三甲基甘氨酸與cycloleucine對肝細胞活性影響

參考相關研究報道[11-12]，TMG 具有抑制細胞活性的效果，細胞經(jīng)過TMG 作用后，經(jīng)計算其IC50 為8.32 mmol，為了便于藥物濃度計算，在后續(xù)的實驗里TMG 濃度均為8.5 mmol（圖2A）。cycloleucine具有促進細胞衰老的效果，在一定的濃度范圍內(nèi)具有促進細胞增殖的效果，結合圖2B，本研究選定其濃度為10 mmol 開展后續(xù)研究。

2.3 FTO對肝細胞增殖活性效果

與NC-OE 對照組相比，當FTO 過表達后，F(xiàn)TO-OE 組增殖活性變化顯著增高（圖3A）；細胞增殖活性受到TMG 抑制（圖3A）；當細胞過表達FTO 時，其增殖活性受到TMG 抑制（圖3A）。與NC-sh 對照組相比，加入cycloleucine 后，其本身增殖活性變化差異不明顯（圖3B）；與NC-sh 對比，F(xiàn)TO-sh 增殖活性顯著降低（圖3B）；但加入cycloleucine 后，F(xiàn)TO-sh 增殖活性降低得到緩解（圖3B），差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。

2.4 FTO對肝細胞產(chǎn)生甘油效果影響

與NC-OE 對照組相比，當FTO 過表達，細胞甘油產(chǎn)生水平顯著提高（圖4A）；甲基激活劑TMG 藥物降低了細胞甘油水平（圖4A）；FTO 過表達逆轉了TMG 的效果，導致細胞甘油水平提高（圖4A），差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。與NC-sh 對照組相比，干擾FTO 的表達，細胞甘油產(chǎn)生水平降低（圖4B）；抑制劑cycloleucine 藥物顯著提高細胞甘油水平（圖4B），且FTO-sh 逆轉了cycloleucine 對甘油水平的提高，導致細胞甘油水平降低（圖4B），差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。

2.5 FTO對肝細胞代謝基因表達水平分析

FTO 調(diào)控脂肪分解相關基因（ATGL）、成脂分化基因（c/EBPβ）、脂肪酸從頭合成相關基因（FAS）等脂肪代謝基因水平[13-15]。當FTO 過表達，ATGL 表達水平顯著降低，c/EBPβ、FAS 水平顯著提高（圖5A）；當被TMG 藥物作用后，ATGL 表達水平有所提高，仍然低于NC-OE 對照組（圖5A）；c/EBPβ 與FAS 表達水平顯著提高（圖5A），差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。FTO-OE 逆轉了TMG 藥物的效果，導致ATGL 表達水平降低，c/EBPβ 與FAS 水平顯著提高（圖5A）。

當干擾FTO 表達時，ATGL 水平升高（圖5B），c/EBPβ 與FAS 水平降低（圖5B）。當細胞被cycloleucine 藥物作用后，ATGL 水平進一步升高（圖5B），c/EBPβ 與FAS 水平顯著性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）（圖5B）。接下來進一步研究，當干擾FTO 表達，細胞受到cycloleucine 作用后，本應該出現(xiàn)ATGL 水平升高、c/EBPβ 水平降低。但是，ATGL 水平卻降低，c/EBPβ 水平差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05）（圖5B）。只有FAS 的實驗結果符合預期（圖5B）。

2.6 甲基化m6A水平變化

FTO 編碼去甲基化酶，影響細胞m6A 的甲基化水平。為了進一步研究FTO 如何調(diào)控以上實驗結果，進一步研究細胞RNA 甲基化水平變化。當細胞FTO 過表達，m6A 甲基化水平降低；當干擾FTO 的表達，m6A 甲基化水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見圖6。

3 討論

FTO 是脂肪與肥胖相關基因，編碼m6A 去甲基化酶，調(diào)控RNA 甲基化水平，參與細胞增殖、存活，與代謝病存在深度關系，如糖尿病、肥胖、腎病等[13]。RNA 的m6A 修飾功能很重要，目前關于m6A 在腫瘤發(fā)生、肥胖、脂肪代謝等疾病中愈發(fā)明確[14]。FTO 通過多種途徑調(diào)節(jié)脂肪代謝，如通過過氧化物酶體、與脂肪相關的促生成因子等，從而調(diào)控肥胖的發(fā)生發(fā)展。新的研究表明，m6A 與2 型糖尿病關系十分密切，F(xiàn)TO 作為m6A 去甲基化酶廣泛參與2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，在2 型糖尿病模型研究中，發(fā)現(xiàn)高糖高脂飲食促進FTO 表達而導致m6A 甲基化水平顯著降低[15]。

另外，還有研究表明，在大鼠高糖高脂飲食實驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO 過表達而導致甘油及三酰甘油表達水平提高，進一步研究發(fā)現(xiàn)，與代謝緊密相關的基因，如ATGL、c/EBPβ 與FAS 表達水平皆有顯著性的變化[16]。本研究利用CCK-8、Western blot、qPCR 等方法，分析FTO 與正常肝細胞HL-7702 增殖、甘油、代謝基因等變化研究，發(fā)現(xiàn)FTO 過表達促進肝細胞增殖、甘油水平提高，ATGL 水平降低、c/EBPβ 與FAS 水平升高，m6A 甲基化水平降低。當干擾FTO 表達時，肝細胞增殖水平減慢，甘油水平降低，F(xiàn)AS 水平升高。

FTO 通過多種信號通路調(diào)節(jié)脂肪代謝，如FTO基因通過改變m6A 水平可調(diào)節(jié)RUNX1T1 基因的表達，其存在2 種不同的異構體。有研究表明RUNX1T1 基因能夠調(diào)節(jié)c/EBPβ 的活性[17]。有研究發(fā)現(xiàn)缺失FTO 基因并不會影響c/EBPβ 的表達水平，推測FTO 基因有可能通過一條獨立于c/EBPβ 之外的路徑來發(fā)揮作用[18]。本研究中，F(xiàn)TO 調(diào)控c/EBPβ的表達，F(xiàn)TO 過表達促進c/EBPβ 的表達，提示FTO可能通過調(diào)節(jié)RUNX1T1 基因的表達調(diào)控脂肪代謝。

除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)一個異常的現(xiàn)象，當干擾FTO 表達時，細胞受到cycloleucine 作用后，ATGL 水平降低、c/EBPβ 沒有顯著性差異。值得進一步關注與研究。