哺乳動物性腺的性別決定和發(fā)育調(diào)控機制

陳 楊

（臨沂市河?xùn)|區(qū)畜牧發(fā)展促進中心，山東 臨沂 276000）

對小鼠性腺性別決定以及表觀調(diào)控的遺傳學(xué)事件，簡述了性別決定前，雙潛能性腺以及祖細胞是如何決定的，從性別決定過程中基因的表達變化，進一步闡述了性腺發(fā)育過程中性腺性別決定的表觀調(diào)控機制。

1 性別決定前雙潛能性腺的決定

在哺乳動物中，生殖嵴或者雙潛能性腺構(gòu)成了向卵巢或睪丸方向分化的原基。在E9.5d小鼠中，生殖嵴在中腎腹側(cè)面開始發(fā)育，并在背側(cè)系膜處形成成對狹長的增殖細胞帶。生殖嵴的生長是通過表面上皮的增殖實現(xiàn)的，隨后當(dāng)基膜分裂時，增殖的表面上皮進入中腎的內(nèi)層間質(zhì)區(qū)域。上述分裂對啟動表面上皮細胞數(shù)的增加是激活機制還是抑制機制，目前仍不清楚。在E10.3d，生殖嵴發(fā)生增厚并形成前后軸。與此同時，原始生殖細胞遷移至生殖嵴。

性腺定位在中腎表面的準(zhǔn)確分子機制仍有待進一步研究。最近在雞的胚胎研究中發(fā)現(xiàn)，骨生長蛋白介導(dǎo)的音猬因子信號通路通過建立中腎的背腹側(cè)軸以及引導(dǎo)表面上皮細胞的進入啟動了性腺的發(fā)生。中腎囊祖細胞中音猬因子信號通路的激活誘導(dǎo)性腺的異位形成。然而，小鼠和雞的性腺在形態(tài)發(fā)生上存在明顯的差異，因此需要在哺乳動物上研究上述過程是否是保守的。

生殖嵴的完全發(fā)育需要表面上皮細胞的正確進入并增殖，從而在性別決定前富集性腺體壁祖細胞。上述過程需要大量的因子的參與，其中生殖嵴特異性表達的早期因子，GATA4，存在于生殖嵴頭側(cè)的表面上皮以及E10.0～E10.4d中。該因子通過調(diào)控基膜的分裂和表面上皮細胞的增殖從而進一步調(diào)控啟動生殖嵴的形成。GATA4也調(diào)控SF1與LHX9的表達，這兩個基因特異性的在性腺祖細胞中表達，并且有研究發(fā)現(xiàn)敲除GATA4后，無法檢測到SF1與LHX9的表達。性腺體細胞的譜系來源目前還不清楚。

體外實驗細胞譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，在XX性腺與XY性腺中，表面上皮細胞是性腺體細胞的主要來源，并且有助于形成支持細胞和類固醇生成細胞。這表明表面上皮細胞是多能的，并且它的命運通過細胞不均等分裂被調(diào)控。最近的研究發(fā)現(xiàn)，一種Notch信號通路的抑制劑NUMB，參與調(diào)控表面上皮細胞的極性。在細胞分裂過程中，NUMB以不均等的形式分布在子代細胞中。在XY性腺中分布時，會導(dǎo)致性腺中積聚未分化的細胞以及減少支持細胞和間質(zhì)細胞的數(shù)量。盡管已經(jīng)知道支持細胞來源于表面上皮細胞，但是類固醇生成細胞卻是多種來源的。研究證實盡管大量的類固醇生成細胞的祖細胞存在于性腺中，它們可能來源于表面上皮細胞，但是在性別決定后，大約30%的細胞是從中腎遷移過來的。這種現(xiàn)象在兩性中都可以觀察到，表明它們可能來源于共同的中腎類固醇祖細胞。

2 性別決定及特異性細胞分化轉(zhuǎn)錄事件

性別決定幾乎是一個細胞抵抗遺傳學(xué)事件的自發(fā)過程，因此大量的研究探索了在性別決定過程中基因的表達情況。采用微陣列技術(shù)、RNA-seq以及scRNA-seq等最新技術(shù)研究了在XX與XY性腺的性別決定過程中，性別決定基因的時序轉(zhuǎn)錄組表達情況。盡管這些技術(shù)存在各自的缺點，但是這些技術(shù)的聯(lián)合使用，對理解性別決定過程中的基因表達情況有著重要的促進作用。

支持細胞的決定與分化由于雙潛能性腺是從E10.5d開始形成的，因此在轉(zhuǎn)錄水平上，除了個別定位在性染色體上的基因外，性腺并沒有顯示出雌雄二性的特征。表面上皮細胞來源的支持細胞表達上皮樣干細胞的基因以及細胞增值的基因，但是在轉(zhuǎn)錄水平上并沒有表現(xiàn)出向支持細胞或類固醇細胞分化的命運。支持細胞的命運決定和性別特異性分化是依次發(fā)生的，最初的決定是由XY和XX多能祖細胞采用支持細胞的命運并共享相似的轉(zhuǎn)錄組學(xué)身份，然后通過性別特異性分化形成支持細胞和前顆粒細胞。更準(zhǔn)確地說，在E11.0～E11.5d左右，來自體壁多能祖細胞的支持細胞譜系的決定是由一個共同的遺傳學(xué)過程介導(dǎo)的，該過程包括快速上調(diào)XX和XY中的數(shù)百個基因水平。該過程在支持細胞的命運決定開始時就可以表達前支持細胞和前顆粒細胞的基因。此外，基因的這種上調(diào)也與XY支持細胞中Y染色體基因的性別決定區(qū)域（Sry）及其直接靶標(biāo)Sox9的激活相吻合。細胞分化為支持細胞或前顆粒細胞遵循著不同的生物學(xué)過程。在E11.5～E12.5d的XY中，Sry表達以及Sox9上調(diào)之后，大量的雄性相關(guān)基因被激活如Amh與Dhh。在XX支持細胞的祖細胞中，雌性特異性的基因如Foxl2的表達從E12.5d開始表達，并且與XY相比，較少的基因被抑制。進一步分析表明，在E11.5d的XY和XX性腺支持細胞的祖細胞中，顯示出雌性優(yōu)先，表明這些祖細胞自發(fā)向雌性的命運轉(zhuǎn)變，除非Sry被激活，抑制雌性基因的表達，并促進支持細胞的分化。發(fā)育后期胎兒（E13.5d與E16.5d）與出生后早期胎兒（P6）的顆粒細胞的轉(zhuǎn)錄組分析顯示顆粒細胞的分化持續(xù)了幾天的時間，而支持細胞分化只需24 h以內(nèi)。在E12.5d與E16.5d期間的前顆粒細胞逐漸上調(diào)雌性相關(guān)基因，同時在E11.5d到E12.5d的前支持細胞中逐漸下調(diào)。出生后，隨著胎兒卵泡發(fā)生的開始，顆粒細胞的分化結(jié)束。總之，XY與XX支持細胞的祖細胞中觀察到的差異可能是由于前顆粒細胞與支持細胞的分化時間上存在差異導(dǎo)致的。

3 可變剪切與性別決定

可變剪切是一種普遍存在的調(diào)節(jié)機制，涉及選擇特定的外顯子/內(nèi)含子以從單個基因產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本，從而擴大了蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性。眾所周知，可變剪切在各種器官的發(fā)育中起主要作用，并有助于細胞分化和譜系確定，但在性腺性別決定過程中發(fā)生可變剪切的程度及其功能相關(guān)性尚不清楚。盡管很難準(zhǔn)確預(yù)測這些可變剪切的準(zhǔn)確分子機制，但是可變剪切在性腺發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用。

4 性腺發(fā)育過程中基因表達調(diào)控的機制

轉(zhuǎn)錄組可以直接顯示細胞命運決定和分化過程中的遺傳學(xué)事件，但它也是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄上游DNA水平上促進或阻止轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動子或增強子結(jié)合調(diào)控基因的表達。結(jié)合在增強子區(qū)域是一種重要的基因表達調(diào)控機制，它涉及3D DNA構(gòu)象、染色質(zhì)調(diào)控以及DNA的去甲基化。越來越多的證據(jù)表明表觀遺傳學(xué)與DNA調(diào)控元件在性別決定以及激活睪丸決定因子Sry方面具有重要的作用。

4.1 Sry表達的調(diào)控Sry的時空表達調(diào)控機制目前還不完全清楚，亞硫酸氫鹽測序突出顯示了Sry上游的兩個基因座，它們在Sry表達的時間段內(nèi)顯示出動態(tài)甲基化狀態(tài)。第一個區(qū)域與未翻譯的環(huán)狀Sry RNA的轉(zhuǎn)錄起始位點重疊（區(qū)域1），而第二個區(qū)域與在性腺性別決定過程中表達的Sry翻譯轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄起始位點重疊（區(qū)域2）。當(dāng)未表達Sry時，這兩個區(qū)域在E8.5d顯示出CpG二核苷酸超甲基化。在E11.5d左右，性腺中的這兩個區(qū)域都處于低甲基化狀態(tài)，而在其他組織中則保持了高甲基化狀態(tài)。在E15.5d，區(qū)域I保持低甲基化，而區(qū)域II再次高度甲基化。這些結(jié)果表明，DNA甲基化可能通過保護順式調(diào)控區(qū)來負責(zé)Sry的組織特異性和時間調(diào)控。與H3K9去甲基化結(jié)合，Sry啟動子顯示出富集組蛋白標(biāo)記，它包括H3K4me3和H3ac?？傊?，DNA甲基化和組蛋白修飾通過使增強子和啟動子與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而積極參與Sry的時空表達調(diào)控。

4.2 Sox9的順式調(diào)控區(qū)在XY小鼠中敲除TES和TESCO可使Sox9表達降低50%，而不會引起性逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果證實了TES/TESCO在控制睪丸中Sox9表達水平方面的重要作用，并表明還存在有待確定的其他增強子。最近的一項研究利用ATAC-seq和CHIP-seq的方法研究了E10.5d與E13.5d的XX性腺和XY性腺，進而篩選出了新推定的SOX9增強子。使用在LacZ報告基因上游攜帶增強子區(qū)域的轉(zhuǎn)基因小鼠篩選了16個備選的增強子區(qū)域。16個備選區(qū)域中有2個區(qū)域表現(xiàn)出睪丸的特異性活性（Enh13和Enh14）。Enh14的敲除不會導(dǎo)致Sox9表達的改變。但是，Enh13（位于Sox9 TSS上游565 kb處的一個557 bp的元件）的純合缺失導(dǎo)致XY雄向雌的性別逆轉(zhuǎn)。該研究還表明，SRY優(yōu)先與Enh13結(jié)合而不是與TESCO結(jié)合，這表明Enh13對Sox9的上調(diào)至關(guān)重要，而TESCO則負責(zé)Sox9上調(diào)的穩(wěn)定。

5 總結(jié)與展望

盡管綜述的范圍僅限于胚胎的性別決定，但已經(jīng)很明顯的是，生殖腺分化為睪丸或卵巢的最初決定不是永久性的。維持成年性腺中的細胞身份，需要遺傳事件之間的微妙平衡，這種平衡的破壞導(dǎo)致體細胞與性腺細胞命運的改變，支持細胞轉(zhuǎn)分化為顆粒細胞，反之亦然。目前，關(guān)于驅(qū)動成年轉(zhuǎn)分化的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄變化知之甚少。隨著scRNA seq以及其他以單細胞分辨率描述染色質(zhì)構(gòu)象的全基因組技術(shù)（例如單細胞ATAC-seq）的出現(xiàn)，現(xiàn)在有可能重建驅(qū)動成年睪丸和卵巢細胞的轉(zhuǎn)分化的轉(zhuǎn)錄組過程和染色質(zhì)調(diào)控的動力學(xué)事件。