疫病凈化中牛結(jié)核病的診斷方法及其應(yīng)用

彭素曉

（山東省臨沂市羅莊區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 276017）

牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的人與動物慢性細(xì)菌性傳染病，我國將該病列為二類動物疾病，研究證實(shí)，發(fā)展中國家超過10%的人結(jié)核病都和牛分枝桿菌相關(guān)。根據(jù)我國獸醫(yī)公報數(shù)據(jù)顯示，2020年我國共發(fā)生115起牛結(jié)核病疫情，病例為761例，共撲殺261頭患病牲畜。牛結(jié)核病具有宿主廣泛和感染基數(shù)大的特點(diǎn)，且發(fā)病數(shù)量相對較少，由此影響了當(dāng)?shù)嘏＝Y(jié)核病防控和凈化工作開展。

1 病原學(xué)特點(diǎn)

牛結(jié)核病引起的病菌類型主要為牛分枝桿菌和山羊分枝桿菌，其中牛分枝桿菌是一種嚴(yán)格需氧菌以及革蘭氏陽性菌，該菌種長度為1.5～4 m、寬0.2～0.5 m，周身無鞭毛，不存在運(yùn)動性，細(xì)胞壁含有大量類脂和臘脂，脂質(zhì)含量約占總體重60%，耐干燥能力強(qiáng)、耐熱性較差，在60℃環(huán)境下可存活30 min，80℃環(huán)境下5 min可以滅活，對一般的消毒劑存在較強(qiáng)抵抗力，且對紫外線酒精較為敏感[1]。

2 傳播途徑

2.1 呼吸道傳播

牛結(jié)核病可在一年四季發(fā)生，并且宿主范圍廣泛，大約有50種哺乳動物以及25種禽類都能感染該病，奶牛是家畜中最容易感染的對象，黃牛、水牛次之，發(fā)病動物是主要的傳染源，比如通過鼻液、唾液、痰液以及生殖道排出體外，然后經(jīng)過呼吸道傳播。牛以及野生動物吸入含有該病原菌的飛沫而受到感染。

2.2 消化道傳播

牛結(jié)核病可以通過消化道傳播，易感動物的飼料、飲水、草料受到感染后通常難以處理。在飼養(yǎng)管理良好并且通風(fēng)條件好的情況下可以對牛結(jié)核病進(jìn)行有效控制。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病人飼養(yǎng)的病畜會導(dǎo)致牛結(jié)核病發(fā)生率較高，放牧飼養(yǎng)模式下牛結(jié)核病患病率僅為1%～5%，而散養(yǎng)模式下患病率升高到25%～50%。

由于致病菌的感染部位存在差異使得病例表現(xiàn)有所不同，主要包括腸結(jié)核、乳房結(jié)核、肺結(jié)核、淋巴結(jié)核以及神經(jīng)結(jié)核。其中肺結(jié)核是牛結(jié)核病常見形式，發(fā)病后表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、逐漸消瘦，而乳房性結(jié)核主要表現(xiàn)為泌乳量逐漸減少直到停止，同時乳汁稀薄，乳牛吸食后會受到感染。腸結(jié)核將造成腸道出現(xiàn)癥狀，多表現(xiàn)為便秘、腹瀉。在毒瘤中最為常見淋巴結(jié)核，主要癥狀在于造成淋巴結(jié)腫大，而神經(jīng)結(jié)核多表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀。

3 診斷方法

3.1 細(xì)菌學(xué)方法

利用細(xì)菌培養(yǎng)法涂片染色法及分枝桿菌生長指示管法可以對細(xì)菌學(xué)加以分析。涂片染色法主要應(yīng)用熒光抗酸染色法以及萋尼染色對抗酸性桿菌進(jìn)行檢查，解剖之后在無菌條件下對病變組織器官進(jìn)行采集，包括肝臟、淋巴結(jié)、肺臟，這種方法可以對抗酸桿菌檢測，但是不能準(zhǔn)確鑒定分枝桿菌和其它非典型分枝桿菌，約有40%～60%的病例難以檢測。

細(xì)菌培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。由于牛分枝桿菌對養(yǎng)分需求高且生長緩慢，通常14～15 h分裂1次，整個過程經(jīng)歷4～8周，因此，標(biāo)本采集及樣品前處理過程中要求嚴(yán)格，臨床分離成功率不高，以往主要采取羅氏培養(yǎng)基以及丙酮酸鈉培養(yǎng)基等。傳統(tǒng)固體培養(yǎng)基盡管制作便捷、價格低廉，然而培養(yǎng)時間偏長，羅氏培養(yǎng)基甘油含量如果高于0.75%會抑制剛分離的牛分枝桿菌，難以處理初代培養(yǎng)菌落。相比之下，丙酮酸鈉培養(yǎng)基初代培養(yǎng)之后菌落主要為團(tuán)型，便于操作BACTECMGIT960、7H9、BACTALERT3D等液體培養(yǎng)基含有較為復(fù)雜的營養(yǎng)成分，需要加入細(xì)菌抑制劑。相較于固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)時間污染率、陽性率等方面優(yōu)勢更加明顯，不足在于檢測成本偏高，牛分枝桿菌培養(yǎng)期間也存在著耗時長、陽性率低、污染率高等不足，因此不適宜推廣[2]。

3.2 遲發(fā)型過敏反應(yīng)試驗

結(jié)核菌皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)為國貿(mào)指定的檢測方法，早在1890年外國研究人員研制了結(jié)核菌素，并使用至今，依舊是牛結(jié)核病主要的檢測方法，患病初期主要應(yīng)用結(jié)核菌素點(diǎn)眼的方法加以診斷，根據(jù)牛眼充血程度判斷結(jié)核陰性和陽性。不過該方法容易對牛產(chǎn)生刺激，后期開始應(yīng)用皮試方法，相較于早期的檢測方法優(yōu)勢明顯，這是由于牛在感染初期細(xì)胞免疫水平，相比體液免疫反應(yīng)更被容易檢測。

皮試驗法可以進(jìn)一步分為尾褶結(jié)核菌素皮內(nèi)檢測、頸部單一結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗、比較結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗。研究發(fā)現(xiàn)，尾褶結(jié)核菌素皮內(nèi)檢測陽性率高于比較結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗，而頸部單一結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗陽性率低于比較結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗，在環(huán)境中副結(jié)核分枝桿菌污染嚴(yán)重的地區(qū)通常使用皮試法加以檢測。在基層地區(qū)更加容易推廣，并且成本較低，不足之處在于特異性偏差感染之后的3～6周可能出現(xiàn)假陰性，并且和非結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)交叉反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。在實(shí)際操作中還要求間隔72 h才能進(jìn)行皮厚測量，所以存在主觀判斷強(qiáng)、勞動強(qiáng)度大以及不適宜等問題，如果檢測之后病情嚴(yán)重還可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3.3 γ-干擾素檢測法

γ-干擾素試驗在牛結(jié)核病檢測中通常作為補(bǔ)充試驗，在實(shí)際操作中需要先進(jìn)行抗凝全血的采集，之后通過禽結(jié)核菌素、牛結(jié)核菌素平行刺激外周血淋巴細(xì)胞，然而受到免疫記憶的影響陽性牛將釋放大量IFN-γ，產(chǎn)生的量與檢測樣本結(jié)核病菌素關(guān)系密切，因此可借助對比釋放的IFN-γ含量確定。

當(dāng)前我國已經(jīng)研制γ-干擾素檢測法國家標(biāo)準(zhǔn)，并將其視為牛結(jié)核病早期診斷方法。不過結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗與γ-干擾素試驗結(jié)果存在不一致情況。有研究發(fā)現(xiàn)一些個體IFN-γ方法結(jié)果為陽性，然而提示法結(jié)果顯示陰性，利用提示法對陰性個體持續(xù)跟蹤和監(jiān)測，20個月發(fā)現(xiàn)86%個體逐漸具有陽性特點(diǎn)。IFN-γ檢測方法主要優(yōu)勢在于當(dāng)個體感染極低的情況下只需要外周淋巴細(xì)胞釋放極少的IFN-γ，讀取結(jié)果更加客觀，不足之處在于操作復(fù)雜并且檢測成本偏高，進(jìn)行全血采集需要盡快運(yùn)往實(shí)驗室。然后刺激結(jié)核菌素，通常需要實(shí)驗室人員具有足夠的經(jīng)驗。研究還發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗之后8-28天再次進(jìn)行IFN-γ檢測靈敏度以及特異性差異不顯著，IFN-γ檢測實(shí)驗可以和體內(nèi)變態(tài)實(shí)驗配合使用，由此實(shí)現(xiàn)平行試驗以及系列試驗。

3.4 ELISA抗體檢測方法

ELISA抗體檢測在牛結(jié)核病診斷中主要為輔助方法，也是目前唯一存在的血清學(xué)檢測法?？梢援?dāng)做TST補(bǔ)充方法，由于牛分枝桿菌生長速度較慢，在感染不同階段分泌一定量的蛋白質(zhì)，主要用于血清學(xué)反應(yīng)的抗原包括有CFP10、ESAT-6、LPSO、MPB70、MPB83、MPB164等，其中CFP-10和ESAT-6蛋白為早期分泌性抗原，單獨(dú)使用之后異構(gòu)性為100%，不過敏感性偏低，將二者蛋白混合使用可以保證高特異性顯著提升敏感性，甚至可以超出PPD敏感性，還可以鑒別診斷自然感染的牛以及卡介苗免疫牛，借助MPB70可以對抗體進(jìn)行檢測，其作為牛結(jié)核病主要的體液免疫、細(xì)胞免疫靶抗原，在單獨(dú)使用MPB70后，可以得到ELISA方法，并且讓特異性達(dá)到98%，將敏感性控制在21%左右。并且將MPB83、MPB70和ESAT-6抗原融合形成的MA-ELISA方法特異性同樣顯著，達(dá)到了96%，且敏感性達(dá)到69.4%，這一結(jié)果明顯高于MPB70、MPB83和ESAT-6單獨(dú)表達(dá)，證實(shí)了多抗體聯(lián)合應(yīng)用可以讓血清學(xué)診斷的敏感性大大提升。

感染晚期牛體內(nèi)帶有高循環(huán)抗體，會受到細(xì)胞免疫受到抑制，出現(xiàn)假陰性TST，所以主要應(yīng)用ELISA抗體檢測方法。在ELISA抗體檢測研究中鹿抗體反應(yīng)被較早的發(fā)現(xiàn)，研究證實(shí)ELISA檢測敏感性較高，可以作為野生動物輔助檢測方法。牛分枝桿菌感染動物的體內(nèi)存在變態(tài)反應(yīng)疊加，在2～8周皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)期間ELISA檢測效果更好。整體來看，ELISA方法可以作為TST皮試的補(bǔ)充方法，也可以作為“無反應(yīng)性個體”替代方法，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)與淘汰陽性牛，使得牛群處于健康的狀態(tài)下。

3.5 分子生物學(xué)檢測方法

在我國分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展的今天，PCR、熒光定量、核酸探針陸續(xù)被用于牛結(jié)核病病原學(xué)診斷，其中IS6110是結(jié)核分枝桿菌的多拷貝的保守片段進(jìn)行了引物擴(kuò)增靶序列，憑借良好的特異性和靈敏性，在人結(jié)核病PCR檢測中得到了廣泛的利用。而插入序列IS1081在人型和牛型分枝桿菌中有5～6個拷貝，并且在其他分枝桿菌尚未發(fā)現(xiàn)該序列，所以可以基于IS6110和IS1081等結(jié)核桿菌插入序列進(jìn)行擴(kuò)增靶點(diǎn)PCR檢測，這在牛結(jié)核病診斷中具有重要意義，有一項檢測牛結(jié)核菌recA-IS6110-IS1081的PCR檢測方法，證實(shí)敏感性較高，可作為牛分枝桿菌以及結(jié)核分枝桿菌快速檢測的工具。

4 檢測方法在牛結(jié)核凈化根除中的應(yīng)用

4.1 常用檢測方法實(shí)際應(yīng)用對比

TST和和IFN-γ檢測法主要用于早期診斷牛結(jié)核病，而ELISA血清檢測法主要用于病情后期以及感染嚴(yán)重的階段，使用效果明顯。通常皮內(nèi)變態(tài)要求牛結(jié)核菌素注射量2000IU單位，不過牛結(jié)核病凈化與根除過程中OLE推薦劑量為5000IU單位，并且要求注射劑量控制在0.2 ml之內(nèi)，盡管當(dāng)前規(guī)定了皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的操作方法，不過對菌合素抗原標(biāo)準(zhǔn)沒有統(tǒng)一。

對比SICT和SICCT兩種檢測方式發(fā)現(xiàn)，SICT有著更強(qiáng)的敏感性，適合在結(jié)核病流行地區(qū)加以檢測，SICCT控制穩(wěn)定地區(qū)的凈化工作更加有效，通過ELISA和TST對比試驗，跟蹤檢測TST檢測呈陰性的牛，之后通過組織病理學(xué)以及PCR方法加以驗證發(fā)現(xiàn)陰性當(dāng)中83.7%都被牛分枝桿菌感染，可以作為TST的補(bǔ)充試驗。將TST試驗作為標(biāo)準(zhǔn)對比IFN-γ、ELISA、SICTT在污染場所中的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ方法的陽性檢出率要比SICTT更好，并且ELISA敏感性比TST實(shí)驗顯著下降，結(jié)核病陰性病率偏高的牧場可以聯(lián)合使用SICT、IFN-γ提升陽性檢測率。當(dāng)前沒有商品試劑盒，可以通過牛潛伏感染以及活動性結(jié)核病加以鑒別診斷。

4.2 發(fā)達(dá)國家牛結(jié)核病主要防控和監(jiān)測方法

成功控制及根除牛結(jié)核病的發(fā)達(dá)國家普遍嚴(yán)格執(zhí)行檢疫撲殺相結(jié)核病的防控措施，并完善的監(jiān)測體系，從立法層面來保證凈化工作的開展，在凈化成功試驗過程中提示法作用明顯，其中愛爾蘭研究人員單一使用皮試法對全體牛群進(jìn)行監(jiān)測，再如美國、澳大利亞、加拿大以及諸多歐洲國家通過皮試法與IFN-γ聯(lián)合使用，澳大利亞同樣在早期根除牛結(jié)核病監(jiān)測過程中使用了皮試法，后期引入哈哈方法進(jìn)行聯(lián)合試驗。不僅能夠提升陽性檢測效果，同時也保證了陰性牛健康程度應(yīng)用TST進(jìn)行檢測，并在高風(fēng)險地區(qū)應(yīng)用平行試驗，由此檢測出高敏感性，增加陽性油的檢測效果，而低風(fēng)險地區(qū)利用系列試驗由此提高特異性，避免出現(xiàn)錯殺情況，也有部分地區(qū)將和TST結(jié)核病應(yīng)用，如韓國后期開始用IFN-γ和ELISA抗體結(jié)核病的方法根除結(jié)核病，英國、美國、新西蘭部分野生動物體內(nèi)存在宿主，導(dǎo)致牛結(jié)核病根除存在很大難度。新時期，澳大利亞、德國，荷蘭等國家已得到歐盟吳杰和認(rèn)可，再如美國、日本、法國普遍實(shí)現(xiàn)了牛結(jié)核病的控制，不過當(dāng)前還沒有相關(guān)國家通過OLE無結(jié)核病并認(rèn)可。

4.3 防控措施

預(yù)防控制牛結(jié)核的主要原則為監(jiān)測、檢疫、撲殺、消毒相結(jié)合，堅持因地制宜、逐步凈化、分類指導(dǎo)的工作流程，開展養(yǎng)殖區(qū)域凈化工作。當(dāng)前在牛結(jié)核病防控方面尚未研制出有效的疫苗，無法進(jìn)行藥物治療，在牛結(jié)核病凈化群當(dāng)中檢測出陽性牛主要是及時撲殺和基層的檢測手段，主要利用SICT和SICCT，部分有條件的實(shí)驗室利用IFN-γ方法加以檢測。新時期，我國開始創(chuàng)建布魯氏桿菌以及結(jié)核病凈化廠與示范縣，以養(yǎng)殖場為單位極大地推動了牛結(jié)核病的凈化進(jìn)程。

5 結(jié)束語

牛結(jié)核成為困擾我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的不利因素，發(fā)病后一般為及時撲殺與消毒，在相關(guān)的研究和實(shí)踐中主要是借助SICT、SICCT、IFN-γ，需要分析牛結(jié)核陽性牛治療與凈化處理后的效果，進(jìn)而節(jié)約養(yǎng)殖成本。