包載攜氧微球的天然多糖自愈合水凝膠制備及性能研究

＊姚雪亮 袁偉忠

（同濟(jì)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院高分子材料系 上海 201804）

隨著組織工程領(lǐng)域載細(xì)胞水凝膠的不斷應(yīng)用，研究人員發(fā)現(xiàn)水凝膠載體中缺乏氧氣的環(huán)境，會(huì)導(dǎo)致所包載的種子細(xì)胞因?yàn)榫植垦醴謮旱牟蛔?，無(wú)法支撐其存活，從而影響治療效果。因此，如何解決載細(xì)胞組織工程材料局部缺氧情況成為了目前亟待解決的問(wèn)題[1]。

如圖1所示，本研究中，利用京尼平對(duì)明膠的交聯(lián)作用，通過(guò)反相乳液聚合的方法，制備包裹了全氟己烷（PFH）乳液的明膠攜氧微球。同時(shí)利用OSA與CMCS之間的席夫堿反應(yīng)，制備封裝了攜氧微球的自愈合水凝膠載體。對(duì)其力學(xué)強(qiáng)度、自愈合性能、微觀形貌以及攜氧釋放能力等進(jìn)行探究，探討該水凝膠系統(tǒng)作為攜氧載體的可靠性和應(yīng)用前景。

圖1 載攜氧微球自愈合水凝膠示意圖

1.試驗(yàn)部分

(1)試驗(yàn)試劑

全氟己烷（PFH），明膠、液體石蠟、Span 80、京尼平、石油醚、異丙醇、無(wú)水乙醇、海藻酸鈉、高碘酸鈉、乙二醇、羧甲基殼聚糖，分析純、上海國(guó)藥集團(tuán)；蛋黃卵磷脂，分析純，Adamas公司。氧化海藻酸鈉（OSA）根據(jù)文獻(xiàn)方法[2]制備獲得。并根據(jù)文獻(xiàn)方法[3]用鹽酸羥胺氧化滴定的方法對(duì)OSA的氧化度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得氧化度為24.76%。

(2)試驗(yàn)儀器

分析天平（FA2004），舜宇恒平公司；恒溫磁力油浴鍋（85-2C，帶攪拌），鄭州長(zhǎng)城實(shí)驗(yàn)裝備公司；冷凍干燥機(jī)（FA-2A），細(xì)胞粉碎機(jī)（BILON-950E），比朗儀器公司；流變儀（HAAKE MARS 40），德國(guó)哈克公司；掃描電子顯微鏡（Quanta 200 FEG），美國(guó)FEI公司；紅外光譜儀（Nicolet5700），美國(guó)熱電公司。

(3)具備攜氧能力的明膠微球的制備

在60ml液體石蠟中加入6ml Span 80，攪拌至穩(wěn)定。在60ml 5%的明膠水溶液中加入1ml 10% PFH乳液，混合均勻后投入到液體石蠟中，80℃下攪拌2h，冷卻至室溫后加入2ml 10%的京尼平水溶液，攪拌6h，得到明膠微球懸浮液。懸浮液使用離心機(jī)在1000rpm離心5min，棄上清液后分別用石油醚、異丙醇和乙醇洗滌3次。得到攜氧明膠微球的乙醇分散液。使用前在分散液中持續(xù)鼓吹高純氧氣4h后，用細(xì)胞濾網(wǎng)將微球?yàn)V出，用去離子水洗滌2次。

(4)載攜氧微球自愈合水凝膠的制備

以PBS為溶劑，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的CMCS溶液，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%和10%的OSA溶液，分別按體積比1:1混合，加入一定量處理過(guò)的攜氧微球，室溫下緩慢攪拌，靜置脫泡，得到載攜氧微球的CMCS/OSA水凝膠。

2.結(jié)果與討論

(1)載攜氧微球自愈合水凝膠制備結(jié)果討論

如圖2所示明膠與明膠微球的紅外光譜，可以發(fā)現(xiàn)相較于明膠，明膠微球在3434cm-1附近的寬峰向低波數(shù)方向發(fā)生了位移，屬于明膠酰胺基的O-H或N-H的拉伸振動(dòng)特征吸收峰，這證明由N-H基團(tuán)參與形成了一定數(shù)量的氫鍵，可見(jiàn)京尼平通過(guò)與明膠中的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，形成氫鍵后得到了明膠微球。

圖2 制備所得微球及凝膠的紅外譜圖

如圖2所示SA與OSA的紅外光譜，可以發(fā)現(xiàn)相較于SA，OSA在1732cm-1處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，這里屬于醛羰基的對(duì)稱振動(dòng)吸收峰，證明SA發(fā)生了氧化反應(yīng)，生成了醛基。

如圖2所示，CMCS、OSA、及CMCS/OSA凝膠的紅外譜圖，相較于CMCS和OSA，CMCS/OSA水凝膠在1640cm-1處產(chǎn)生了一個(gè)新的吸收峰，這是CMCS中的氨基與OSA中的醛基之間發(fā)生了席夫堿反應(yīng)，產(chǎn)生-N=C-伸縮振動(dòng)峰，證明了交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。

(2)載攜氧微球自愈合水凝膠的流變性能的研究

對(duì)不同配比的CMCS/OSA水凝膠進(jìn)行動(dòng)態(tài)應(yīng)變掃描，探究OSA濃度對(duì)其強(qiáng)度的影響。如圖3所示，CMCS/OSA水凝膠在低應(yīng)變時(shí)始終保持了一定強(qiáng)度，當(dāng)應(yīng)變達(dá)到100%左右后，水凝膠結(jié)構(gòu)被破壞，力學(xué)強(qiáng)度迅速下降。而相較于使用5% OSA的水凝膠，使用10% OSA的水凝膠的G’更高，具備了更好的力學(xué)強(qiáng)度。

圖3 不同配比CMCS/OSA水凝膠動(dòng)態(tài)應(yīng)變掃描（a）、動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描（b）

對(duì)不同配比的CMCS/OSA水凝膠進(jìn)行動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描，以探究OSA濃度對(duì)其凝膠速度的影響。如圖3所示，CMCS/OSA水凝膠溶液在一定時(shí)間內(nèi)強(qiáng)度逐漸上升，并在一定時(shí)間后G’超過(guò)G”，完成從溶膠向凝膠的相轉(zhuǎn)變。而隨著OSA的濃度增加，其凝膠速度也有所提高。通過(guò)圖3可知，使用5% OSA的水凝膠需要約7400s完成相轉(zhuǎn)變，而使用10% OSA的水凝膠僅需要約1400s即完成相轉(zhuǎn)變過(guò)程，且具備更高的力學(xué)強(qiáng)度。

(3)載攜氧微球自愈合水凝膠的自愈合性能研究

如圖4所示，通過(guò)將試樣切分后交換拼接，靜置一段時(shí)間后兩組樣品之間的邊界逐漸模糊，藍(lán)色水凝膠逐漸滲入透明水凝膠，用手提起后兩部分未發(fā)生分離，基本融為一體。

圖4 CMCS/OSA水凝膠自愈合性能宏觀實(shí)驗(yàn)(a)及流變實(shí)驗(yàn)(b)

利用流變儀對(duì)不同配比的CMCS/OSA水凝膠進(jìn)行變換應(yīng)變強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)時(shí)間掃描，以探究OSA濃度對(duì)其自愈合性能的影響。如圖4所示不同配比的CMCS/OSA水凝膠均能在1%低應(yīng)變時(shí)保持較好的力學(xué)強(qiáng)度，當(dāng)應(yīng)變?cè)龃笾?00%時(shí)，水凝膠被破壞，強(qiáng)度迅速下降，而當(dāng)應(yīng)變恢復(fù)至1%后，凝膠能迅速完成自愈合，恢復(fù)到一定的力學(xué)強(qiáng)度。OSA的濃度對(duì)凝膠的自愈合性能沒(méi)有明顯的影響，但凝膠本身的強(qiáng)度會(huì)隨著OSA濃度的增加而提高。

(4)載攜氧微球自愈合水凝膠的可注射性能研究

用安裝有22G針頭的注射器吸取CMCS/OSA水凝膠，并連續(xù)注射擠出，如圖5所示，該水凝膠具備良好的可注射性。注射過(guò)程中可以保持凝膠態(tài)，對(duì)內(nèi)部包載的細(xì)胞起到良好的保護(hù)作用。

圖5 CMCS/OSA水凝膠可注射性宏觀實(shí)驗(yàn)(a)及流變測(cè)試(b)

利用流變儀對(duì)CMCS/OSA水凝膠進(jìn)行穩(wěn)態(tài)剪切掃描，以探究其可注射性。如圖5所示，該水凝膠隨著剪切速率的增加，粘度迅速下降，具有良好的可注射性。

(5)明膠微球的微觀形貌研究

利用SEM觀察明膠微球的微觀結(jié)構(gòu)。如圖6所示，所制備的明膠微球呈較為規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，粒徑1～10μm不等。較廣的粒徑分布有助于攜氧微球?qū)崿F(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的氧氣釋放。

圖6 凍干明膠微球掃描電鏡圖

(6)載攜氧微球自愈合水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)研究

如圖7所示，CMCS/OSA水凝膠凍干后通過(guò)SEM觀察，有明顯的孔洞結(jié)構(gòu)，且其孔徑分布在200μm左右，有足夠的空間用于封裝細(xì)胞以及攜氧微球。

圖7 凍干CMCS/OSA水凝膠掃描電鏡圖

如圖8所示，載攜氧微球自愈合水凝膠凍干后通過(guò)SEM觀察，其孔洞內(nèi)壁分布有部分規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)明膠攜氧微球較好的分布在該凝膠內(nèi)部。

(7)載攜氧微球自愈合水凝膠的氧氣釋放性能研究

對(duì)PFH、攜氧微球及載攜氧微球自愈合水凝膠在一定時(shí)間內(nèi)氧氣的釋放速率進(jìn)行探究，如圖9所示，PFH乳液在投入無(wú)氧水中后，釋放速率極快，不足100s時(shí)即基本完成了釋放；攜氧明膠微球則保持了一定的釋放速率，約400s后完成釋放；載攜氧微球自愈合水凝膠則保持了最緩慢的釋放速率，約1200s后完成釋放。由此可見(jiàn)，明膠微球和載攜氧微球自愈合水凝膠均有利于實(shí)際應(yīng)用中氧氣的緩釋。

(8)載攜氧微球自愈合水凝膠的細(xì)胞相容性研究

用不同含量、不同浸提時(shí)長(zhǎng)的水凝膠及其組分的浸提液作為細(xì)胞培養(yǎng)基，與NIH 3T3細(xì)胞共同培養(yǎng)后，如圖10，圖11所示，隨著浸提液濃度的提高以及共孵育時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)一定程度的提高，同時(shí)對(duì)比圖10和圖11可知，浸提時(shí)長(zhǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響并不明顯。由此可知攜氧明膠微球、CMCS/OSA水凝膠以及載攜氧微球自愈合水凝膠均無(wú)細(xì)胞毒性。

圖10 不同濃度的24h浸提液與NIH 3T3細(xì)胞共培養(yǎng)（a）24h、（b）48h、（c）72h后細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)速率；（d）100%濃度24h浸提液與NIH 3T3共培養(yǎng)不同時(shí)間的相對(duì)生長(zhǎng)速率

圖11 不同濃度的48h浸提液與NIH 3T3細(xì)胞共培養(yǎng)（a）24h、（b）48h、（c）72h后細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)速率；（d）100%濃度48h浸提液與NIH 3T3共培養(yǎng)不同時(shí)間的相對(duì)生長(zhǎng)速率

3.結(jié)論

（1）通過(guò)反相乳液聚合的方法，利用京尼平對(duì)明膠的交聯(lián)效應(yīng)制備了包裹PHF乳液的明膠攜氧微球。同時(shí)利用OSA與CMCS之間的席夫堿反應(yīng)，得到具有自愈合性的攜氧微球水凝膠載體。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，所得明膠攜氧微球粒徑分布合理，適宜作為攜氧材料緩釋封裝的載體使用。所得水凝膠具備良好的力學(xué)強(qiáng)度、自愈合性以及可注射性，內(nèi)部孔徑分布合理，適宜用于攜氧微球的載體。對(duì)載攜氧微球自愈合水凝膠的氧氣緩釋性能進(jìn)行了測(cè)試，相較于PFH的直接使用，攜氧微球和載攜氧微球自愈合水凝膠都做到了不同程度的緩釋功效。

（2）載攜氧微球自愈合水凝膠，具備良好的可注射性能，可以實(shí)現(xiàn)氧氣的緩釋功效，實(shí)現(xiàn)了攜氧材料的合理封裝、遞送和緩釋功能。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有潛在的研究和應(yīng)用前景。