高通量測序在2例腎病綜合征并發(fā)感染患者病原診斷中的應(yīng)用

陳樹娟，李虎才，王立新

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510000； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

腎病綜合征(nephrotic syndrome, NS)患者由于免疫功能受損及使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等導(dǎo)致其免疫功能低下，常出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)菌、真菌、病毒等混合性感染。感染起病隱匿，臨床癥狀不典型，病情進(jìn)展迅速，是導(dǎo)致NS患者全因死亡的主要原因[1]。由于檢測技術(shù)的限制、抗菌藥物的使用及免疫功能低下等，傳統(tǒng)檢測技術(shù)對致病菌總體檢出率偏低，且檢測耗時長，給臨床診斷及治療帶來困難。分子診斷和基因診斷是目前感染性疾病病原學(xué)診斷中的一個重要方向和研究熱點(diǎn)，高通量測序即下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)，利用現(xiàn)有微生物群基因信息群，采用生物信息學(xué)方法，與測序結(jié)果比對，進(jìn)而鑒別微生物種類，具有檢測耗時短、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)。近年來NGS廣泛應(yīng)用于血流感染、肺部感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等多種感染性疾病，因其可快速檢測和全面識別病原菌，且病原菌陽性檢出率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)檢測，具有顯著的優(yōu)勢及應(yīng)用價值[2-4]。目前關(guān)于NGS在NS并發(fā)感染中的研究報道較少。本文通過分析某院利用NGS明確診斷NS并發(fā)隱球菌感染及嗜麥芽窄食單胞菌腦膜炎各1例，探討NGS在NS并發(fā)感染中的應(yīng)用。

1 病歷資料

1.1 病例1 患者女性，58歲，2021年10月25日因“發(fā)現(xiàn)雙下肢浮腫6個月余，發(fā)熱咳嗽10 d”收入我科，既往有高血壓病史。6個月余前，患者因NS行腎穿活檢診斷為Ⅲ期膜性腎病，予足量糖皮質(zhì)激素及環(huán)磷酰胺治療。10天前患者出現(xiàn)咳嗽、咯痰伴發(fā)熱，體溫最高達(dá)39.5℃，于外院行實(shí)驗(yàn)室檢查：血白細(xì)胞計數(shù)12.49×109/L，中性粒細(xì)胞百分比88.5%，C反應(yīng)蛋白(CRP)205.56 mg/L，降鈣素原(PCT)0.129 ng/mL，血沉104 mm/h；尿白細(xì)胞計數(shù)158個/μL；痰培養(yǎng)檢出白念珠菌。胸部CT提示左肺下葉見斑片狀高密度影，考慮左肺下葉炎癥。先后予頭孢呋辛、哌拉西林鈉/他唑巴坦鈉抗感染，病情無好轉(zhuǎn)，為進(jìn)一步治療，入我科。

入院時患者精神疲倦，咳嗽，干咳少痰，發(fā)熱，雙顳部及頸部輕度疼痛。查體：體溫38.6℃，聽診雙肺呼吸音粗，雙下肺可聞及散在濕啰音，頸軟，無抵抗，凱爾尼格征及布魯津斯基征陰性，生理反射存在，病理反射未引出。實(shí)驗(yàn)室檢查：血白細(xì)胞計數(shù)6.35×109/L，中性粒細(xì)胞百分比74.5%，淋巴細(xì)胞百分比15.5%，CRP 45.38 mg/L，PCT 0.06 ng/mL，血沉72 mm/h，血肌酐 38 μmol/L；尿白細(xì)胞計數(shù)70.6個/μL；淋巴細(xì)胞亞群：CD4+T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)31.39%，CD4+T淋巴細(xì)胞亞群/CD8+T淋巴細(xì)胞亞群0.97。胸部CT平掃提示雙下肺感染，診斷為NS并發(fā)感染?；颊唛L期使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制治療，外院抗感染無效，考慮存在細(xì)菌、真菌、病毒等混合感染可能，經(jīng)驗(yàn)性予舒普深(3 g，q12h)+氟康唑(0.2 g，qd)+更昔洛韋(0.3 g，q12h)靜脈滴注抗感染治療。留取淺部痰、尿、血標(biāo)本行細(xì)菌、真菌病原學(xué)培養(yǎng)以及肺炎支原體、抗巨細(xì)胞病毒(CMV)-IgM、CMV、呼吸道病毒、曲霉菌GM抗原等檢測均為陰性。遂完善支氣管鏡檢查，留取深部痰及肺泡灌洗液行病原菌培養(yǎng)，肺泡灌洗液行NGS檢測，深部痰及肺泡灌洗液培養(yǎng)均為陰性，NGS結(jié)果提示隱球菌感染?；颊吣X膜刺激征陰性，但存在雙顳部及頸部疼痛，考慮隱球菌與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有高度親和性，行腰椎穿刺檢測回報腦脊液常規(guī)：白細(xì)胞計數(shù)106×106/L，中性粒細(xì)胞13%，淋巴細(xì)胞87%；腦脊液生化：葡萄糖1.87 mmol/L，蛋白550 mg/L；血清、腦脊液隱球菌莢膜多糖抗原陽性；腦脊液墨汁染色、細(xì)菌培養(yǎng)均陰性。患者NS并發(fā)隱球菌性肺炎及腦膜炎可診斷。調(diào)整抗感染方案，氟康唑加量(0.4 g，qd)+舒普深(3 g，q8h)靜脈滴注，患者發(fā)熱趨勢較前下降，病情平穩(wěn)后出院，門診規(guī)律復(fù)診。

1.2 病例2 患者女性，73歲，2021年10月15日因“反復(fù)腹痛半月余”入我院外科，既往有高血壓、糖尿病病史。患者半月余前無明顯誘因出現(xiàn)上腹部及臍周隱痛，無腹脹、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱及惡寒等，入院查體：肺部聽診呼吸音粗，雙肺未聞及啰音，腹部無壓痛及反跳痛，余查體陰性。實(shí)驗(yàn)室檢查：血白細(xì)胞32.37×109/L，中性粒細(xì)胞百分比87.9%，CRP 89.6 mg/L，血清蛋白20.2 g/L，PCT 0.69 ng/mL，血肌酐118 μmol/L；24 h尿蛋白5.874 g，尿白細(xì)胞280.5個/μL。入院后患者出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高達(dá)38℃，我科會診后診斷為NS并發(fā)感染，轉(zhuǎn)入我科進(jìn)一步治療。10月26日轉(zhuǎn)入后查胸部CT平掃提示雙肺感染，雙側(cè)胸腔積液。NS并發(fā)感染可診斷，取淺部痰、尿、血行病原學(xué)培養(yǎng)以及肺炎支原體、抗CMV-IgM、CMV、呼吸道病毒、曲霉菌GM抗原等檢測均為陰性，予舒普深經(jīng)驗(yàn)性抗感染。31日患者突然出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)，體溫最高達(dá)39.9℃，呼吸氣促，肢體顫動，意識障礙。查體：腦膜刺激征陽性，余病理征未引出。血?dú)夥治鎏崾劲裥秃羲?，提示患者感染加重，抗感染方案調(diào)整為亞胺培南(1 g，qd)+利奈唑胺(600 mg，q12h)靜脈滴注。完善支氣管鏡及腰椎穿刺，留取肺泡灌洗液及腦脊液行NGS檢測。11月2日腦脊液NGS檢測提示嗜麥芽窄食單胞菌。腦脊液常規(guī)：白細(xì)胞計數(shù)22×106/L，中性粒細(xì)胞67%，潘氏蛋白2+；腦脊液生化：氯離子142.9 mmol/L，蛋白1 212 mg/L，墨汁染色陰性。復(fù)查胸部CT提示：雙肺感染較前吸收，雙側(cè)胸腔積液較前減少。影像學(xué)提示肺部感染較前好轉(zhuǎn)，細(xì)菌性腦膜炎可診斷，考慮嗜麥芽窄食單胞菌對亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類抗生素天然耐藥，停用亞胺培南及利奈唑胺，單用舒普深(1.5 g，q12h，靜脈滴注)抗感染治療，后患者體溫漸恢復(fù)正常，肢體顫動消失，查體腦膜刺激征陰性，復(fù)查腦脊液白細(xì)胞正常，維持足療程抗菌藥物治療后，患者病情穩(wěn)定出院，門診隨診。

2 討論

隱球菌是最常見的機(jī)會性侵襲性真菌之一，由于自身免疫疾病、腎功能不全等易感人群增多以及糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等使用，隱球菌感染率呈上升趨勢[5]。尤其免疫抑制患者對隱球菌感染的免疫反應(yīng)更差，臨床癥狀更隱蔽，傳統(tǒng)檢測陽性率偏低[6]。本文中病例1患者感染癥狀及影像學(xué)表現(xiàn)無特異性，取痰、血等標(biāo)本行傳統(tǒng)病原學(xué)檢測均為陰性，行肺泡灌洗液NGS檢測明確診斷為肺部隱球菌感染?；颊呱窠?jīng)系統(tǒng)方面僅存在雙顳部、頸部疼痛癥狀，考慮隱球菌與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有高度親和性，行腦脊液檢測進(jìn)一步診斷為隱球菌性腦膜炎。隱球菌性腦膜炎是一種極為兇險的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，即使積極治療，病死率仍高達(dá)60%[7]。隱球菌抗原檢測的靈敏度和特異度都較高，但是由于臨床表現(xiàn)多樣性及典型癥狀出現(xiàn)延遲性，從而導(dǎo)致隱球菌感染易漏診。有研究[8]表明隱球菌感染漏診率可達(dá)27%，且漏診患者90天病死率顯著升高。因此，臨床工作中應(yīng)加強(qiáng)重視免疫抑制患者隱球菌感染風(fēng)險及多種病原學(xué)檢測診斷技術(shù)的應(yīng)用價值。

嗜麥芽窄食單胞菌是一種機(jī)會性病原體，以侵犯肺部最為常見，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相對少見[9]。目前對嗜麥芽窄食單胞菌腦膜炎的了解來源于世界各地散在病例報道，這些患者在感染之前往往有神經(jīng)外科手術(shù)相關(guān)的病史[10]，目前尚無NS患者顱內(nèi)感染嗜麥芽窄食單胞菌的報道。本文中病例2患者出現(xiàn)意識障礙等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，腦脊液傳統(tǒng)病原學(xué)檢測陰性，感染致病菌不明，雖然積極給予經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療，患者病情仍持續(xù)進(jìn)展，甚至危及生命。后行腦脊液NGS檢測明確診斷為嗜麥芽窄食單胞菌感染，經(jīng)調(diào)整抗感染治療方案后患者病情得到控制，并逐漸好轉(zhuǎn)。

NGS是一種新興的病原體檢測方法，通過對標(biāo)本中的所有微生物進(jìn)行測序，能夠同時識別細(xì)菌、真菌、病毒等多種致病病原體，避免傳統(tǒng)病原檢測效率低、時間長的缺點(diǎn)，對于混合性感染、疑難重癥感染的檢測具有重要作用[11]。Duan等[12]比較NGS和傳統(tǒng)培養(yǎng)的診斷價值，發(fā)現(xiàn)NGS的靈敏度高于傳統(tǒng)檢測方法(67.4% VS 23.6%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病是神經(jīng)系統(tǒng)重癥疾病，具有高病死率和致殘率等特點(diǎn)。因病原微生物檢測手段有限，極易延誤診斷及治療[13]。NGS不需要假設(shè)潛在感染病原體類型，克服了PCR、培養(yǎng)、免疫標(biāo)志物等靶向診斷方法的局限性，在檢測新發(fā)、少見和診斷困難的病原體上呈現(xiàn)了巨大優(yōu)勢[14]。

NGS越來越多地應(yīng)用于臨床實(shí)踐，但目前NGS檢測的成本仍顯著高于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測方法，因此，對于NS并發(fā)輕癥感染性疾病或傳統(tǒng)微生物檢測能夠明確病原體的感染，尚不能作為一線檢測手段[15]。二代測序的優(yōu)勢在于其能檢測到其他傳統(tǒng)手段無法檢測到的病原體，對于傳統(tǒng)病原學(xué)檢測不能明確病原體、規(guī)范性經(jīng)驗(yàn)抗感染無效的患者，推薦在完善常規(guī)病原學(xué)檢測同時開展NGS。嚴(yán)重感染常存在病原體不明的情況，若感染危及生命，表現(xiàn)為膿毒性休克、血流感染、腦膜炎、嚴(yán)重肺炎等，除了傳統(tǒng)檢測方法，建議開展NGS盡快明確病原體[16-17]。研究[18]表明經(jīng)驗(yàn)性抗感染不能完全覆蓋病原體，使用NGS之后超過一半的患者需要進(jìn)行抗菌藥物調(diào)整或降級。因此，若傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的結(jié)果不能完全解釋臨床表現(xiàn)的全貌或抗感染治療的反應(yīng)，懷疑同時存在其他病原體感染，在完善更多檢測技術(shù)的同時，專家共識推薦進(jìn)一步完善NGS檢測[16]。

雖然檢測準(zhǔn)確性及時效性較傳統(tǒng)病原微生物檢測技術(shù)存在很大優(yōu)勢，但NGS技術(shù)作為新型的病原微生物檢測技術(shù)，也面臨許多挑戰(zhàn)，包括價格昂貴，提供檢驗(yàn)的機(jī)構(gòu)多元而檢測質(zhì)量良莠不齊，無法對于檢出的致病性病原微生物予以藥敏結(jié)果指導(dǎo)等[19]。但是，隨著測序成本的降低及技術(shù)的改進(jìn)，相信NGS在感染性疾病的應(yīng)用會有更光明的前景。

在NS的診治過程中處理感染相關(guān)問題，是臨床醫(yī)生面臨的一個挑戰(zhàn)。本文報告NGS技術(shù)在2例NS并發(fā)感染患者中的成功應(yīng)用，提示臨床醫(yī)生應(yīng)關(guān)注新型病原檢測技術(shù)在免疫低下人群中的應(yīng)用，特別是對傳統(tǒng)培養(yǎng)陰性的患者標(biāo)本進(jìn)行NGS檢測，有助于早期診斷及治療，對原發(fā)病的治療及長期預(yù)后的改善，具有重要意義。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。