上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)工作人員手污染金黃色葡萄球菌的分子生物學(xué)特征及耐藥性

陳泰堯，陳雯杰，常兆玉，田 靚，葛憶琳， 劉 倩 ，畢 菁， 張 幸 ，張 曦 ，張紅芝

(上海市疾病預(yù)防控制中心 1. 病原生物檢定所； 2. 傳染病防治所，上海 200336)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)，是引起醫(yī)院感染的重要病原菌之一，可導(dǎo)致菌血癥、中毒休克綜合征等多種進(jìn)行性壞死疾病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，2011年全世界醫(yī)院感染發(fā)病率為5.7%～19.1%，平均發(fā)病率為10.1%[2]，醫(yī)院感染將成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。

醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生與醫(yī)院感染的發(fā)生密切相關(guān)。醫(yī)院感染通常是直接或間接經(jīng)手傳播，經(jīng)醫(yī)務(wù)人員手傳播細(xì)菌造成的感染約占30%[3]，也可因醫(yī)務(wù)人員手?jǐn)y帶耐藥菌株而導(dǎo)致感染在醫(yī)院內(nèi)廣泛傳播甚至暴發(fā)流行[4]。研究[5]報(bào)道多重耐藥菌醫(yī)院感染的主要傳播途徑是醫(yī)務(wù)人員的手。胡瑛等[6]對(duì)某兒童醫(yī)院內(nèi)新生兒及醫(yī)務(wù)人員分離的MRSA進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)務(wù)人員手是MRSA醫(yī)院感染的主要途徑。

為了解上海市各級(jí)醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員手部金黃色葡萄球菌的攜帶情況，本研究分析2018—2020年16所不同級(jí)別醫(yī)院工作人員手部分離的金黃色葡萄球菌，并利用全基因組測(cè)序技術(shù)(whole genoem sequencing, WGS)和脈沖腸凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)對(duì)分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行同源性分析，耐藥性、耐藥基因、抗消毒劑基因、毒力基因及核心基因組多位點(diǎn)序列分型(cgMLST)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)分析，鑒定MRSA菌株，調(diào)查其傳播途徑，為醫(yī)院感染的預(yù)防與控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣方案 本研究中監(jiān)測(cè)點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)均根據(jù)2016年版《上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)耐藥菌監(jiān)測(cè)方案》，對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)重點(diǎn)科室工作人員的手進(jìn)行采樣，如外科、重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)、呼吸內(nèi)科、心血管內(nèi)科等，每所監(jiān)測(cè)點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)每季度采集工作人員手標(biāo)本4份，針對(duì)醫(yī)務(wù)人員在工作狀態(tài)時(shí)、脫掉手套時(shí)暴露的手部皮膚進(jìn)行采樣，檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

1.2 試劑與儀器 甲酸(formic acid, FA)、乙腈(acetonitrile, ACN)、無(wú)水乙醇(色譜純)均為美國(guó)Sigma公司。VITEK MS-CHCA基質(zhì)液(法國(guó)梅里埃)。Baird-Parker平板(上海申啟)、哥倫比亞血平板(上海申啟)。細(xì)菌全基因組提取試劑盒(Takara，日本)。藥敏板(珠海美華)?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)儀器為法國(guó)生物梅里埃公司。

1.3 采樣及金黃色葡萄球菌檢測(cè) 將浸有無(wú)菌0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水采樣液的棉拭子一支在雙手指曲面從指根到指端來(lái)回涂擦各2次，一只手涂擦面積約30 cm2。將采樣液接種到等體積的雙倍SCDLP液體培養(yǎng)基中，于36℃孵育24 h；劃線接種于金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基，于36℃孵育24 h，挑取可疑菌落(圓形、光滑、凸起、紫色的菌落)，革蘭染色為陽(yáng)性、觸酶試驗(yàn)為陰性、血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，最后利用微生物質(zhì)譜鑒定儀進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜鑒定用參考菌株：ATCC 8739。

1.4 MALDI-TOF MS鑒定[7]挑取適量(約5～10 mg)菌落樣品于1.5 mL離心管中，加入900 μL無(wú)水乙醇，混勻；12 000 r/min離心2 min，棄去上清液；加入40 μL 70%甲酸，混勻，再加入40 μL乙腈，混勻，12 000 r/min離心2 min，吸取1 μL上清液點(diǎn)在靶板上，自然晾干后再點(diǎn)1 μL CHCA基質(zhì)覆蓋，晾干后進(jìn)行質(zhì)譜分析。30 min后觀察結(jié)果。

1.5 藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用革蘭陽(yáng)性藥敏板檢測(cè)，依據(jù)說(shuō)明書的檢測(cè)原理及操作步驟完成：每種抗菌藥物都設(shè)有一系列倍比稀釋的濃度，通過(guò)加入待檢金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)液稀釋的菌懸液，經(jīng)18～20 h 孵育后，肉眼判讀藥敏板條，獲得其最低抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration, MIC)值，并根據(jù)2020版美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)獲得相應(yīng)敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)結(jié)果。

1.6 全基因組測(cè)序 取適量新鮮菌液，用Genomic DNA purification kit試劑盒提取細(xì)菌全基因組DNA。全基因組測(cè)序由生工生物工程公司完成，采用Illumina Hiseaxten PE150測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行全基因組分析。測(cè)序策略：先將樣本DNA隨機(jī)打斷，構(gòu)建DNA文庫(kù)，然后分別進(jìn)行平行測(cè)序。數(shù)據(jù)處理：測(cè)序獲得原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行質(zhì)控，將合格的數(shù)據(jù)Clean data導(dǎo)入BioNumerics 7.0軟件進(jìn)行序列拼接。

1.7 MLST和cgMLST分析 MLST參考S.aureus分型的管家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpiA和yqiL (http://pubmlst.org/database/)。利用BioNumerics 7.0軟件從上述拼接好的序列中提取相應(yīng)的管家基因，然后利用BN軟件的功能分配ST型。

cgMLST分析，根據(jù)BioNumerics Calculation Engine上的Staphylococcusaureus數(shù)據(jù)庫(kù)，從上述拼接好的序列中選取1 861個(gè)核心基因，利用BioNumerics 7.0 軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析。

1.8 毒力基因和耐藥基因分析 利用BioNumerics軟件拼接后的序列，通過(guò)序列比對(duì)分析獲得毒力基因譜和耐藥基因譜。分別參考官網(wǎng)：Virulence Factor Database (VFDB)、(MOH Key Laboratory of Systems Biology of Pathogen, Institute of Pathogen Biology, Beijing, China)、(http://www.mgc.ac.cn)和CARD (https://card.mcmaster.ca/)。

1.9 耐消毒劑基因檢測(cè) 計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)，以金黃色葡萄球菌、消毒劑、主動(dòng)外排系統(tǒng)、耐消毒劑基因作為檢索詞，在上述數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。檢索到的耐消毒劑基因?yàn)椋簈acA/B、qacC、qacD、qacG、qacH、qacJ、norA。將這些基因在NCBI官網(wǎng)搜索核酸序列，再與本研究中金黃色葡萄球菌拼接序列進(jìn)行比對(duì)，分析耐消毒劑基因。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌檢出情況 2018—2020年16所醫(yī)療機(jī)構(gòu)共采樣768份。經(jīng)生化和MALDI-TOF MS鑒定，工作人員手部共檢測(cè)出22株金黃色葡萄球菌，攜帶率為2.9%(22/768)，來(lái)自9所醫(yī)療機(jī)構(gòu)(醫(yī)院A～I(xiàn))，醫(yī)生檢出8株(36.4%)，護(hù)士檢出9株(40.9%)，護(hù)工檢出5株(22.7%)。來(lái)源于6個(gè)科室：綜合ICU 7株(31.8%)，老年科7株(31.8%)，呼吸內(nèi)科、普通外科、燒傷科、神經(jīng)外科均為2株(9.1%)。調(diào)查中醫(yī)務(wù)人員使用的手消毒劑有3種：醇類消毒劑占68.2%(15名)、含氯消毒劑占9.1%(2名)、復(fù)合型消毒劑占22.7%(5名)。見(jiàn)表1。

續(xù)表1 (Table 1， Continued)

2.2 全基因組測(cè)序結(jié)果 分析22株金黃色葡萄球菌全基因組測(cè)序的原始數(shù)據(jù)，滿足以下條件：平均測(cè)序讀長(zhǎng)為200～300 bp，原始數(shù)據(jù)量≥1.5 G，且Q20高質(zhì)量數(shù)據(jù)量平均1.2 G(Clean data≥1 G)；基因組整體覆蓋深度≥100 X；堿基數(shù)據(jù)質(zhì)量值Q20≥95%，Q30≥85%，SCAFFOLD數(shù)量<100個(gè)，Contig數(shù)量<200個(gè)，單堿基錯(cuò)誤率低于十萬(wàn)分之一。

表2 醫(yī)療機(jī)構(gòu)工作人員手分離金黃色葡萄球菌對(duì)16種抗菌藥物的耐藥情況(%)

3株金黃色葡萄球菌對(duì)苯唑西林和頭孢西丁耐藥，為MRSA，其中1株同時(shí)攜帶mecA和blaZ耐藥基因，19株為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin-susceptibleStaphylococcusaureus，MSSA)。3株MRSA (SAH18、SAH20、SAH21)分別來(lái)自3所醫(yī)院不同科室的護(hù)士、醫(yī)生和護(hù)工，均對(duì)7種及以上抗菌藥物耐藥。

22株金黃色葡萄球菌僅1株攜帶耐消毒劑基因qacB，此菌株被鑒定為MRSA(SAH20)，同時(shí)攜帶6種耐藥基因，攜帶多種毒力基因(lukF-PV,seb,selk)。

2.4 攜帶毒力基因情況 分析22株金黃色葡萄球菌攜帶lukF-PV、tsst-1和腸毒素基因的情況。各毒力基因的攜帶率：lukF-PV為72.7%(16株)；tsst-1為18.2%(4株)；腸毒素基因sea為13.6%(3株)；seb為13.6%(3株)；sec為18.2%(4株)；selk為45.5%(10株)；sell為22.7%(5株)；selq為9.1%(2株)。其中4株菌(SAH19、SAH21、SAH25和SAH26)同時(shí)攜帶lukF-PV、tsst-1和腸毒素基因，見(jiàn)表3。

表3 醫(yī)療機(jī)構(gòu)工作人員手分離金黃色葡萄球菌的耐藥性、耐藥基因、毒力基因、耐消毒劑基因及ST型分析

2.5 金黃色葡萄球菌分子分型特征 MLST結(jié)果顯示，22株金黃色葡萄球菌中18株分為12個(gè)ST型，還有4株為新ST型。12個(gè)ST型中，ST72、ST59各有3株，ST15、ST188各有2株，其他型別各有1株，分別為ST2631、ST398、ST6、ST239、ST965、ST764、ST630、ST8。22株金黃色葡萄球菌除1株ST398外，其余菌株均可進(jìn)行PFGE分型。共分為20個(gè)PFGE帶型(PT1-PT20)，呈現(xiàn)高度多樣性，見(jiàn)圖1。PT3和PT8中金黃色葡萄球菌的PFGE帶型相似度均為96.6%，提示SAH05和SAH10以及SAH25和SAH26菌株可能為克隆株。SAH05和SAH10分別來(lái)自醫(yī)院D的醫(yī)生和醫(yī)院B的護(hù)士，均為ST15。SAH25和SAH26均為ST72，于2020年分離自醫(yī)院I護(hù)士的手。

cgMLST分析結(jié)果顯示，22株金黃色葡萄球菌中除SAH25和SAH26之間有1個(gè)差異基因，其余金黃色葡萄球菌菌株之間的差異基因個(gè)數(shù)均>145，提示這些菌株之間沒(méi)有親緣關(guān)系，見(jiàn)圖2。cgMLST結(jié)果與PFGE結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)SAH25和SAH26為克隆株。

3 討論

研究[8]證實(shí)，醫(yī)務(wù)人員被污染的手在金黃色葡萄球菌傳播過(guò)程中發(fā)揮重要作用。甚至有研究[9]表明醫(yī)務(wù)人員的手作為重要的細(xì)菌傳播載體，所造成的醫(yī)院感染占總醫(yī)院感染的30%左右。本研究中，醫(yī)療機(jī)構(gòu)工作人員的手金黃色葡萄球菌分離率為2.9%。張友平等[10]報(bào)道廣東省某醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員手的MRSA檢出率為37.5%。綜合ICU和老年科往往是金黃色葡萄球菌分離率較高的病區(qū)，醫(yī)務(wù)人員為患者進(jìn)行侵入性操作時(shí)，可導(dǎo)致醫(yī)務(wù)人員手被污染的概率增加[11]，我國(guó)有醫(yī)務(wù)人員手?jǐn)y帶MRSA并導(dǎo)致ICU發(fā)生醫(yī)院感染暴發(fā)的報(bào)道[12]。已有研究[13]顯示，該院綜合ICU和老年科臨床住院患者金黃色葡萄球菌的分離率也較高，因此導(dǎo)致護(hù)理人員被污染的概率增加。國(guó)外研究[14]發(fā)現(xiàn)，提高手衛(wèi)生依從率可降低醫(yī)院感染發(fā)病率，因此重視手衛(wèi)生，做好手清潔、消毒，可以有效阻斷金黃色葡萄球菌傳播，預(yù)防醫(yī)院感染。

根據(jù)耐藥性和耐藥基因攜帶情況，3株菌被鑒定為MRSA，分別來(lái)自不同醫(yī)院、不同科室的護(hù)士、護(hù)工和醫(yī)生，同時(shí)攜帶多種耐藥基因和多種毒力基因，與醫(yī)療機(jī)構(gòu)中MRSA的耐藥性一致[11]。值得注意的是，其中1株MRSA攜帶qacB，qacB是季銨鹽類、雙胍類消毒劑的耐藥機(jī)制，也是細(xì)菌對(duì)碘伏、戊二醛消毒劑的耐藥基因，主要因質(zhì)子動(dòng)力的多藥外排導(dǎo)致耐藥[15]。由于qacA和qacB只有7～9個(gè)堿基序列不同，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)很難將其區(qū)分，因此很多研究報(bào)道中均是將qacA、qacB作為耐消毒劑基因。qacA、qacB尤其在MRSA菌株間廣泛流行[16-17]，吳建國(guó)等[18]研究表明，某醫(yī)院中qacA、qacB在MRSA中的檢出率為17.1%；國(guó)內(nèi)其他地區(qū)qacA、qacB在MRSA中的檢出率為38%～92%[19]；2011年歐洲報(bào)道的qacA、qacB在MRSA中的檢出率為44%～63%[20]；qacA、qacB檢出率的差異可能與地域不同、使用消毒劑的頻次、習(xí)慣不同有關(guān)。qacA、qacB位于質(zhì)粒pSK23上，其介導(dǎo)對(duì)抗菌藥物的耐藥性能在細(xì)菌間傳遞，使敏感株獲得耐藥性[21]，因此qac基因的出現(xiàn)需引起人們重視。對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐消毒劑基因監(jiān)測(cè)，可以為消毒劑的使用選擇提供重要依據(jù)。

MLST顯示22株金黃色葡萄球菌型別高度多樣化，沒(méi)有優(yōu)勢(shì)ST型。PFGE分型顯示PT3(SAH05和SAH10)和PT8(SAH25和SAH26)中金黃色葡萄球菌的帶型相似度很高(>95%)，流行病學(xué)資料顯示SAH05和SAH10來(lái)自不同醫(yī)院的不同人員，其相關(guān)性較低。而SAH25和SAH26均為ST72，于2020年6月13日分離自同一所醫(yī)院護(hù)士的手，而且cgMLST結(jié)果顯示該2株菌株的差異基因僅10個(gè)，進(jìn)一步證實(shí)其為克隆株，可能是護(hù)士之間相互傳播，也可能是均感染自相同的環(huán)節(jié)或患者。因此，及時(shí)找出病原菌、切斷傳播途徑，是預(yù)防控制金黃色葡萄球菌醫(yī)院感染的重要手段。

22株金黃色葡萄球菌中MSSA比率較高，占86.4%，盡管3株MRSA的耐藥率遠(yuǎn)高于MSSA，但是MSSA對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、左氧氟沙星也表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。研究[22]報(bào)道MSSA對(duì)常用抗菌藥物也有不同程度的耐藥，因此臨床應(yīng)合理選用抗菌藥物。本研究顯示金黃色葡萄球菌的耐藥性和其攜帶耐藥基因并不完全一致，與筆者對(duì)MRSA菌株的監(jiān)測(cè)結(jié)果一致，可能是由于耐藥基因的表達(dá)受到各種因素的影響，不一定表現(xiàn)出耐藥性。因此在金黃色葡萄球菌的監(jiān)測(cè)中，耐藥性和耐藥基因的監(jiān)測(cè)同樣重要。

本研究中，MRSA與MSSA攜帶毒力基因無(wú)明顯差異，均攜帶較高的lukF-PV(72.7%)和較低比率的tsst-1(18.2%)和腸毒素基因(18.2%)。研究[23]表明MSSA攜帶較高比例的tsst-1基因，其編碼中毒休克綜合征毒素TSST-1[24]。這可能與金黃色葡萄球菌的來(lái)源不同有關(guān)，研究[25]發(fā)現(xiàn)不同疾病類型患者TSST-1陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)工作人員手部金黃色葡萄球菌分離率為2.9%。共檢出3株MRSA，且有1株攜帶qacB基因。PFGE和cgMLST提示在某醫(yī)院中可能存在以手作為傳播載體的金黃色葡萄球菌克隆傳播。因此，重視手衛(wèi)生，合理選用消毒劑，持續(xù)加強(qiáng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)工作人員手部金黃色葡萄球菌的監(jiān)測(cè)，預(yù)防與控制醫(yī)療機(jī)構(gòu)中由金黃色葡萄球菌引起的醫(yī)院感染。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。