兩起獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室核酸污染原因排除及消毒成效的調(diào)查及建議

孫劍峰，王占利，康文彪，豆玲，趙雯，高軍軍

（甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730046）

甘肅省大多數(shù)基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)具備分子生物學(xué)檢測(cè)能力，實(shí)驗(yàn)隊(duì)伍人員配置齊全、素質(zhì)高，實(shí)驗(yàn)室建設(shè)合理，市縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室每年省級(jí)比對(duì)結(jié)果正確符合率超過90%?，F(xiàn)階段PCR試驗(yàn)已經(jīng)是病原學(xué)檢測(cè)的成熟手段，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要開展實(shí)時(shí)熒光PCR試驗(yàn)，普通PCR試驗(yàn)由于要進(jìn)行電泳等步驟已經(jīng)很少用。近幾年獸醫(yī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室很容易發(fā)生核酸污染[1]，尤其在春秋兩季集中監(jiān)測(cè)樣品任務(wù)量特別大的情況下，加上試驗(yàn)人員水平層次不平，有的分子學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)造不合理，試驗(yàn)結(jié)束后消毒和廢棄物處理程序不規(guī)范，極易造成污染。實(shí)驗(yàn)室一旦污染及污染后消毒處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致近段時(shí)間無(wú)法進(jìn)行試驗(yàn)，尋找污染步驟及祛除污染需要花費(fèi)大量人力和試劑[2]，因此預(yù)防核酸污染才是關(guān)鍵。現(xiàn)結(jié)合兩起獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室污染原因查找過程及祛除核酸污染過程，總結(jié)出相應(yīng)污染原因及控制和清除核酸污染的措施。

1 調(diào)查對(duì)象及尋找污染原因的方法

調(diào)查對(duì)象是一個(gè)獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室。尋找污染原因的方法是通過查看每次做的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)發(fā)現(xiàn)有多份陽(yáng)性的試驗(yàn)用增設(shè)空白對(duì)照驗(yàn)證是否污染，如果確實(shí)污染就要采集可能污染地方樣品，通過比對(duì)試驗(yàn)查找污染原因，比對(duì)試驗(yàn)主要是不同部位樣品比對(duì)、試劑比對(duì)、人員比對(duì)、實(shí)驗(yàn)室比對(duì)、儀器比對(duì)等，通過相應(yīng)消毒措施后再用試驗(yàn)驗(yàn)證核酸污染是否祛除。

2 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)造、主要使用儀器和試劑情況

2．1 實(shí)驗(yàn)室構(gòu)造

該獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室有4個(gè)單獨(dú)分區(qū)，依次是試劑準(zhǔn)備間、樣品處理及提取間、核酸擴(kuò)增間、電泳間，壓力分別從正壓到負(fù)壓，每個(gè)區(qū)之間有傳遞窗，沒有單獨(dú)的緩沖間，排風(fēng)系統(tǒng)是中央空調(diào)系統(tǒng)，每間有2個(gè)排風(fēng)口，樣品提取間有2個(gè)生物安全柜，1個(gè)臭氧消毒機(jī)。

2．2 主要使用儀器

全自動(dòng)核酸提取儀（西安天隆，型號(hào)：NP968）,3臺(tái)熒光PCR儀（ABI 7500，ABI Q5，Agilent）,4臺(tái)高速離心機(jī)。

2．3 主要使用試劑

天隆核酸提取試劑盒（批號(hào)：E0119090321），哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司的ASFV熒光PCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：ASFV2021004），F(xiàn)MDV通用型實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：FMDV20200601P），青島立見的ASFV熒光PCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：40222104），蘭獸研FMDV熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20210909431），青島立見核酸祛除劑（批號(hào)：140321906），納克生物科技有限公司PCR核酸質(zhì)粒氣溶膠污染清除劑（批號(hào)：2021060500），84消毒液，70%酒精，30%過氧化氫，自配含氯消毒劑。

3 調(diào)查結(jié)果

2021年6月份，該獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室在春季定點(diǎn)檢測(cè)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒核酸污染，試驗(yàn)結(jié)果分析過程中發(fā)現(xiàn)ASF陰性對(duì)照和部分樣品核酸陽(yáng)性，經(jīng)過幾次重復(fù)試驗(yàn)陰性對(duì)照為陽(yáng)性，懷疑實(shí)驗(yàn)室被ASF核酸污染，通過反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)是提取區(qū)移液器和一個(gè)生物安全柜臺(tái)面被污染。

2021年11月份，該獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室在秋季集中監(jiān)測(cè)試驗(yàn)中發(fā)生口蹄疫病毒核酸染，96孔反應(yīng)板中陰性對(duì)照和空白對(duì)照都是FMDV核酸檢測(cè)陽(yáng)性，檢測(cè)樣品零散陽(yáng)性和多份可疑，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果都有弱陽(yáng)性出現(xiàn)，且結(jié)果對(duì)不上，做了人員比對(duì)和試劑比對(duì)，結(jié)果還是一樣，懷疑實(shí)驗(yàn)室被FMDV核酸污染，通過實(shí)驗(yàn)室比對(duì)、試劑比對(duì)、儀器比對(duì)等發(fā)現(xiàn)提取間環(huán)境被FMDV氣溶膠污染。

4 核酸污染原因排除、祛除核酸污染過程分析及消毒成效驗(yàn)證

4．1 ASFV核酸污染原因排除、污染祛除與消毒驗(yàn)證過程

4．1．1 ASFV核酸污染原因排除

在當(dāng)天非洲豬瘟病原學(xué)試驗(yàn)中，試驗(yàn)陰性對(duì)照有1份陽(yáng)性和1份可疑，換了試劑進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)室可能污染了。換了間PCR實(shí)驗(yàn)室和用兩種試劑同時(shí)開展試驗(yàn)，開始設(shè)立4份空白對(duì)照和20份環(huán)境樣品（盛有3 ml PBS的5 ml離心管中開蓋靜置12 h在提取間和擴(kuò)增間），再進(jìn)行ASFV熒光PCR試驗(yàn)，24份樣品全為陰性（試驗(yàn)成立），說明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和試劑沒有污染。接著通過反復(fù)擦拭采集移液槍頭部及內(nèi)部、離心機(jī)孔里、96孔離心板孔里、生物安全柜臺(tái)面、地面等18份樣品，用2種試劑繼續(xù)在新PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行ASFV熒光PCR試驗(yàn)，結(jié)果顯示1份移液器樣品和2份生物安全柜臺(tái)面樣品ASFV核酸檢測(cè)陽(yáng)性，其余樣品均為陰性；換了提取間另一個(gè)生物安全柜（有自己獨(dú)立的移液器），重新用全自動(dòng)核酸提取儀和手動(dòng)柱式濾膜提取這18份樣品，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，18份樣品檢測(cè)結(jié)果全為陰性且試驗(yàn)成立，說明之前HFsafe 1200的生物安全柜臺(tái)面及里面的移液器被污染了。

4．1．2 ASFV核酸污染祛除過程

將污染的生物安全柜臺(tái)面放置在地上，先用酒精擦拭臺(tái)面內(nèi)外，用除銹劑對(duì)安全柜生銹地方進(jìn)行擦拭（生銹地方容易吸附核酸），用核酸消除劑對(duì)臺(tái)面和安全柜各個(gè)部位進(jìn)行噴霧消毒[2]，安裝好臺(tái)面，配好3%過氧化氫放置在臺(tái)面進(jìn)行熏蒸消毒6h（安全柜密封狀態(tài)），用酒精、核酸消除劑該安全柜移液器進(jìn)行拆卸擦洗、噴霧及安裝后高壓滅菌。

4．1．3 消毒驗(yàn)證過程

用之前非洲豬瘟已知盲樣6份和重新擦拭采集該生物安全柜臺(tái)面和所有移液器樣品及提取間環(huán)境樣品共20份，在污染的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行ASFV熒光PCR試驗(yàn)，已知盲樣結(jié)果完全正確，19份樣品陰性，1份安全柜臺(tái)面樣品可疑，重復(fù)消毒，1周之后重新采樣進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果全陰性，ASFV核酸污染消除，實(shí)驗(yàn)室恢復(fù)正常工作。

4．2 FMDV核酸污染原因排除、污染祛除與消毒驗(yàn)證過程

4．2．1 FMDV核酸污染原因排除

在2021年秋季集中監(jiān)測(cè)中開展FMDV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增后96孔反應(yīng)板中陰性對(duì)照和空白對(duì)照都是FMDV核酸檢測(cè)可疑或陽(yáng)性，檢測(cè)樣品零散陽(yáng)性和多份可疑，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果都有弱陽(yáng)性及可疑出現(xiàn)，且結(jié)果對(duì)不上，換了人員和試劑進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)室可能污染了，馬上停止試驗(yàn)查找污染原因。首先換了間新的PCR實(shí)驗(yàn)室，用之前的試劑和樣品開展試驗(yàn)，并設(shè)立2份空白對(duì)照，結(jié)果原先樣品全為FMDV核酸陰性且試驗(yàn)成立；配制PBS后高壓30 min，分裝2ml在離心管（規(guī)格5 ml）中，用無(wú)菌棉簽蘸取滅菌蒸餾水在可能污染地方（移液槍尖里外兩面、離心機(jī)孔里、96孔離心板孔里、安全柜臺(tái)面、地面）涂抹采樣18份和環(huán)境采樣10份（裝有PBS的離心管靜置12h），在新的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行FMDV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)（全自動(dòng)核酸提取儀提取和用兩種擴(kuò)增體系），試驗(yàn)成立（陰陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照滿足說明書要求），兩種試劑結(jié)果一致（試劑沒有污染），離心機(jī)孔里、安全柜臺(tái)面、地面出現(xiàn)4份陽(yáng)性和1份可疑樣品，環(huán)境樣品出現(xiàn)1份陽(yáng)性和2份可疑樣品，證明實(shí)驗(yàn)室被口蹄疫病毒氣溶膠污染。這次污染比6月份那次嚴(yán)重多了，查找可能污染步驟，懷疑是陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物沒有處置得當(dāng)，因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)室的擴(kuò)增產(chǎn)物在體表噴灑84消毒液后放入提取間生物安全垃圾桶中，八連管管蓋如果沒有完全密封，擴(kuò)增產(chǎn)物就會(huì)污染實(shí)驗(yàn)室。

4．2．2 FMDV核酸污染祛除過程

整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室都要徹底清掃消毒，將污染的生物安全柜臺(tái)面及角落、離心機(jī)各個(gè)孔里、實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面先用酒精擦拭2遍，再用核酸消除劑噴霧消毒2遍，地面用5%的含氯消毒劑擦拭消毒[3]，提取間生物安全柜用配好3%過氧化氫放置在臺(tái)面進(jìn)行熏蒸消毒不少于6 h，并對(duì)槍尖盒、槍架、96孔離心管架用5%的含氯消毒劑浸泡消毒，消毒處理提取間所有敞開或用過的耗材，擴(kuò)增產(chǎn)物用10%的含氯消毒劑浸泡12 h并轉(zhuǎn)移到廢棄物臨時(shí)貯存室 ；打開整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室的紫外燈及移動(dòng)紫外燈照射消毒6 h，紫外消毒結(jié)束后打開臭氧機(jī)8 h（保持閉光狀態(tài)即關(guān)燈拉窗簾，等臭氧消毒結(jié)束后2d每天打開空調(diào)系統(tǒng)12 h），1周后重復(fù)上次的消毒。

4．2．3 消毒驗(yàn)證過程

消毒半個(gè)月后重新采樣驗(yàn)證消毒效果，用口蹄疫已知盲樣5份和重新采集原先CT值比較小的部位樣品及提取間環(huán)境樣品共17份，在消毒過的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行FMDV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（陰性對(duì)照翹尾），11份樣品陰性，2份離心機(jī)和1份地面樣品陽(yáng)性，3份環(huán)境樣品可疑；每半個(gè)月重復(fù)之前步驟一次，1個(gè)月后重新采樣15份，用5份盲樣和2份無(wú)RNA酶水驗(yàn)證試驗(yàn)，15份樣品和2份無(wú)RNA酶水全陰性，盲樣和陰陽(yáng)性對(duì)照都正確，PCR實(shí)驗(yàn)室不消毒空置半個(gè)月后重新采樣15份進(jìn)行FMDV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試驗(yàn)，結(jié)果全為陰性，實(shí)驗(yàn)室核酸污染消除，該實(shí)驗(yàn)室恢復(fù)正常檢測(cè)工作。

5 預(yù)防、清除獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室核酸污染的建議

5．1 獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室核酸污染預(yù)防措施的建議

（1）制定科學(xué)嚴(yán)禁的PCR實(shí)驗(yàn)室管理制度。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人加強(qiáng)操作人員監(jiān)督，劃分職責(zé)，責(zé)任到人，落實(shí)制定制度[3]。

（2）改造不合理的PCR實(shí)驗(yàn)室布局。最少3個(gè)區(qū)，一般4個(gè)區(qū)，依次為配液間、樣品處理及提取間、核酸擴(kuò)增間、電泳分析間[4]，4個(gè)分區(qū)必須相互獨(dú)立（包括儀器設(shè)備、抹布、拖把等），如提取間移液器不能從擴(kuò)增間直接到配夜間，配液間（屬于潔凈區(qū)）要有單獨(dú)的衣服和消毒設(shè)施，堅(jiān)決不能讓陽(yáng)性樣品進(jìn)入配液區(qū)。

（3）定期開展試驗(yàn)人員培訓(xùn)。進(jìn)行崗前培訓(xùn)，開展加強(qiáng)PCR試驗(yàn)人員生物安全意識(shí)和試驗(yàn)規(guī)范操作的培訓(xùn)，嚴(yán)格落實(shí)廢棄物處理制度。

（4）PCR試驗(yàn)規(guī)范操作。一旦污染需要很長(zhǎng)時(shí)間清除，只有規(guī)范操作，才能更好防止PCR實(shí)驗(yàn)室污染。開展PCR試驗(yàn)前，先做好試驗(yàn)準(zhǔn)備，打開通風(fēng)設(shè)備和空調(diào)系統(tǒng)，穿干凈消過毒的試驗(yàn)服和鞋，戴好一次性口罩、手套、帽子，將試劑盒放置室溫半小時(shí)后進(jìn)行試驗(yàn)。進(jìn)行PCR試驗(yàn)時(shí)，先分體系放置到配夜間-20℃冰箱中，然后進(jìn)行樣品提取擴(kuò)增，盡可能使用可高壓處理的移液器和一次性帶濾芯的無(wú)RNA酶槍尖；組織和全血樣品處理最好在安全柜臺(tái)面鋪設(shè)一次性防水臺(tái)布，每次離心管開蓋前要離心防止蓋上殘留液體濺出，如果濺在手套和安全柜臺(tái)面后立即更換手套和消毒臺(tái)面（先用酒精擦拭再用5%含氯消毒劑噴灑消毒）；每次試驗(yàn)須設(shè)立2份陰性對(duì)照，移液器嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，每年對(duì)移液器進(jìn)行校準(zhǔn)維修保養(yǎng)和定期更換生物安全柜的過濾網(wǎng)及空調(diào)過濾器，加模板時(shí)最后加陽(yáng)性對(duì)照（先離心再小心開蓋，模板加完后八聯(lián)管蓋一定要蓋緊）。每次試驗(yàn)結(jié)束后，形成消毒程序，先將生物安全廢液缸里面廢棄試劑耗材倒入生物安全垃圾袋里及時(shí)進(jìn)行高壓滅菌處理再轉(zhuǎn)移至臨時(shí)貯存室，PCR產(chǎn)物用10%含氯消毒劑浸泡消毒（不高壓處理），將剩余的試劑耗材密封保存，酒精擦拭安全柜臺(tái)面后噴核酸消除劑進(jìn)行消毒，擦拭消毒移液器后并定期進(jìn)行高壓滅菌，消毒臺(tái)面和試驗(yàn)地面用5%的含氯消毒劑擦拭兩遍，各個(gè)房間的抹布、拖把不能混用，清掃消毒完后打開安全柜和各區(qū)紫外燈照射1 h。

5．2 清除獸醫(yī)PCR實(shí)驗(yàn)室核酸污染的建議

（1）實(shí)驗(yàn)室一旦發(fā)現(xiàn)污染，立即停止試驗(yàn)，用實(shí)驗(yàn)室比對(duì)、試劑比對(duì)、樣品比對(duì)查找污染原因，找到可能污染重點(diǎn)部位，進(jìn)行重點(diǎn)消毒，如果是核酸氣溶膠污染要關(guān)閉整個(gè)實(shí)驗(yàn)室，并進(jìn)行徹底清掃消毒。

（2）嚴(yán)格按消毒程序進(jìn)行操作。整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行徹底清掃消毒（消毒液現(xiàn)配現(xiàn)用，消毒液嚴(yán)格按比例進(jìn)行配制），將污染部位先用酒精擦拭2遍，再用核酸消除劑噴霧消毒2遍，試驗(yàn)地面及死角用5%的含氯消毒劑擦拭兩遍[5]，生物安全柜用配好3%過氧化氫熏蒸消毒不少于6h，打開整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室的紫外燈及移動(dòng)紫外燈照射消毒不少于6h，紫外消毒結(jié)束后打開臭氧機(jī)8h，臭氧消毒結(jié)束后每天打開通風(fēng)系統(tǒng)12h，如此反復(fù)消毒直至核酸污染祛除。

（3）初次消毒驗(yàn)證污染祛除后，實(shí)驗(yàn)室打開通風(fēng)系統(tǒng)（每天6h）空置半個(gè)月后，重新用試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證合格后再恢復(fù)實(shí)驗(yàn)室正常工作。