高遷移率族蛋白B1對人支氣管上皮細胞的炎癥因子和受體表達的影響

梁 悅 薛艷龍 楊超勉 黃天霞 陳一強

1.南寧市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣西南寧 530028；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 廣西醫(yī)科大學呼吸疾病研究所，廣西南寧 530021

高遷移率族蛋白B 1（high-mobility group box 1，HMGB1）是廣泛存在于幾乎所有細胞類型的細胞核和細胞質中的一種高度保守蛋白，它可以調(diào)控多種炎癥反應[1]。已有相關研究證明HMGB1參與了氣道慢性炎癥性疾病的發(fā)病，如在支氣管哮喘（簡稱“哮喘”）患者血清中，HMGB1表達水平較健康人群明顯升高[2]。但HMGB1參與哮喘炎癥反應的機制還有待進一步探討。

哮喘是一種常見的氣道慢性炎癥性疾病，因不同的臨床特征和體內(nèi)不同的分子機制而表現(xiàn)出發(fā)病的異質性[3]。其中支氣管上皮細胞（16-HBE）是近年來機制研究的重點[4]，它參與哮喘氣道炎癥反應機制不明。有研究表明16-HBE可釋放白介素-8（interleukin-8，IL-8）等多種炎癥因子[5]，且16-HBE存在多種HMGB1相關受體[6]。因此本研究通過建立體外細胞模型，研究HMGB1對16-HBE釋放炎癥因子和受體表達的影響，以證實HMGB1是否可能通過干預這一途徑來參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

實驗所用16-HBE購自歐洲標準細胞收藏中心（ECACC）。

1.2 實驗主要儀器和試劑

Mutiskan酶標儀（美國 Thermo），Western blot設備（美國Bio-Rad），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國 Licor），重組型 HMGB1（美國 Sigma，批號：H4653），IL-8、基質金屬蛋白酶 -9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、胸 腺 基 質 淋 巴 生成 素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、血 管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）Human酶聯(lián)免疫吸附實驗法（ELISA）試劑盒（武漢博士德，批號：EK0413、EK0465、EK0958、EK0539），高級糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Toll樣受體 2（toll-like receptor 2，TLR2）、Toll樣受體 4（toll-like receptor 4，TLR4）抗體（美國GeneTex，批號：821904539、821904830、821403584），IRDye800CWIgG熒光羊抗兔二抗（美國Licor，批號：926-32211）。

1.3 實驗方法

1.3.1 HMGB1對16-HBE釋放炎癥因子和受體的影響 將細胞放入含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。細胞按隨機數(shù)表法設置為對照組a（不含HMGB1的培養(yǎng)基）、HMGB1-100 ng/ml組、HMGB1-500 ng/ml組、HMGB1-2000 ng/ml組a[7]，培養(yǎng)上述分組細胞48 h。分別收集以上分組細胞的培養(yǎng)上清和細胞裂解液。采用ELISA檢測16-HBE中IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的釋放水平，用蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞裂解液中RAGE、TLR2、TLR4蛋白水平。

1.3.2 受體活化和炎癥因子表達之間的關系 根據(jù)第一階段實驗可確定HMGB1增加表達的受體。按照上述培養(yǎng)傳代方法處理16-HBE后，將細胞按隨機數(shù)表法設置對照組b（不含HMGB1的培養(yǎng)基）、HMGB1-2000 ng/ml組b、RAGE 拮抗組（anti-RAGE組）、anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml組[8]，培養(yǎng)上述分組細胞48 h。分別收集以上分組細胞的培養(yǎng)上清。用ELISA檢測細胞上清中IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的釋放水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間多重比較方差齊性時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3法檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HMGB1對16-HBE釋放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影響

與 對 照 組a比 較，HMGB1-500 ng/ml組 和HMGB1-2000 ng/ml組a顯著增加16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF釋放，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見表1。

表1 HMGB1對16-HBE釋放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影響（pg/ml，n=4，±s）

表1 HMGB1對16-HBE釋放IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF的影響（pg/ml，n=4，±s）

注 與對照組a比較，*P ＞ 0.05，**P ＜ 0.05；IL-8：白介素-8；MMP-9：基質金屬蛋白酶-9；TSLP：胸腺基質淋巴生成素；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

組別 IL-8 MMP-9 TSLP VEGF對照組a 141.915±10.615 244.542±6.061 24.089±2.861 211.812±6.105 HMGB1-100 ng/ml組 155.284±3.002* 250.366±7.930* 34.113±2.407* 225.453±5.697*HMGB1-500 ng/ml組 233.633±10.453** 405.304±8.443** 82.698±14.150** 356.607±7.081**HMGB1-2000 ng/ml組 a 280.413±6.450** 508.745±8.747** 121.344±10.733** 462.833±8.237**F值 142.792 472.843 453.872 450.603 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 HMGB1對16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4受體蛋白表達的影響

與對照組a比較，HMGB1各濃度干預組不能增加TLR2、TLR4蛋白的表達，HMGB1-500 ng/ml組和HMGB1-2000 ng/ml組a明顯增加16-HBE的RAGE蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖1，表2。

表2 HMGB1對16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表達的影響（n=4，±s）

表2 HMGB1對16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表達的影響（n=4，±s）

注 與對照組 a比較，*P ＞ 0.05，**P ＜ 0.05；RAGE：高級糖基化終產(chǎn)物受體；TLR2：Toll樣受體2；TLR4：Toll樣受體4

組別 RAGE TLR2 TLR4對照組a 0.533±0.046 0.547±0.0600.023±0.003 HMGB1-100 ng/ml組 0.538±0.048*0.562±0.0380.025±0.005 HMGB1-500 ng/ml組 0.925±0.054**0.569±0.0500.023±0.006 HMGB1-2000 ng/ml組 a 2.130±0.138**0.583±0.0110.027±0.004 F值 496.433 1.757 0.857 P值 0.000 0.188 0.479

圖1 不同濃度HMGB1對16-HBE的RAGE、TLR2、TLR4蛋白表達的影響

2.3 拮抗RAGE受體后HMGB1對16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF釋放影響

與 HMGB1-2000 ng/ml組b比較，anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml組能明顯減少16-HBE的IL-8、TSLP、MMP-9、VEGF釋放，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。顯示HMGB1可依賴RAGE增加16-HBE的 IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF 釋放。見表3。

表3 拮抗RAGE受體后HMGB1對16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF釋放的影響（pg/ml，n=4，±s）

表3 拮抗RAGE受體后HMGB1對16-HBE的IL-8、MMP-9、TSLP、VEGF釋放的影響（pg/ml，n=4，±s）

注 與HMGB1-2000 ng/ml組b比較，**P ＜ 0.05；IL-8：白介素-8；MMP-9：基質金屬蛋白酶-9；TSLP：胸腺基質淋巴生成素；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子

組別 IL-8 MMP-9 TSLP VEGF對照組b 145.023±7.135 241.453±7.925 25.270±5.279 215.519±6.914 HMGB1-2000 ng/ml組 b 284.442±6.133 504.075±12.405 120.592±9.349 456.742±10.088 anti-RAGE 組 156.034±6.856 249.120±5.817 30.319±4.067 219.572±4.752 anti-RAGE+HMGB1-2000 ng/ml組 185.374±7.127** 359.612±8.696** 71.981±6.781** 256.832±8.024**F值 608.611 1110.253 393.111 1284.402 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

HMGB1是一種普遍存在的核蛋白，在既往研 究 中，脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等促炎因子需與HMGB1結合才能發(fā)揮完全毒性，如HMGB1+LPS可增強巨噬細胞的炎癥反應而參與調(diào)控急性肺損傷的過程[9]；HMGB1+IL-1β復合物通過活化Toll樣受體信號促進人椎間盤細胞炎性細胞因子的釋放[10]。本研究中，HMGB1的高濃度刺激可以增加16-HBE中 IL-8、TSLP、MMP-9、VEGF的釋放，這也說明了HMGB1在體外細胞實驗中仍可能具有一定的促炎作用。而上述炎癥因子在哮喘的氣道炎癥中可誘導不同的生物學效應。因此，推測HMGB1可能通過對16-HBE的炎癥調(diào)控來參與哮喘的發(fā)病。

以往的研究表明，RAGE和Toll樣受體是HMGB1信號通路中的主要受體HMGB1+LPS、HMGB1+IL-1β復合物皆可通過活化上述受體發(fā)揮強大的促炎能力[11]。本研究提示HMGB1-RAGE信號表達的增加可激活16-HBE的炎癥反應，因RAGE在肺組織中高表達，所以高濃度的HMGB1可能首先影響RAGE信號的表達。通過蛋白質印跡實驗的顯影猜測，16-HBE表達Toll樣受體蛋白濃度較RAGE低，而HMGB1可能因有限的促炎作用而難以直接影響Toll樣受體的表達。HMGB1-RAGE信號的表達在哮喘發(fā)病中有重要意義：HMGB1、RAGE水平被證實與哮喘的嚴重性呈正相關[12]。而已有相關研究證實RAGE基因的單核苷酸多態(tài)性與哮喘發(fā)病率增加有關[13]。實際上，HMGB1的效應細胞多種多樣，不同細胞表達受體種類和數(shù)目也不盡相同，實驗樣本來源的多樣性可能導致HMGB1-RAGE或HMGB1-Toll樣受體信號表達情況的不同。如在哮喘小鼠模型中，HMGB1就可通過激活樹突狀細胞中的TLR2、TLR4、RAGE受體，間接促進輔助2型T細胞、輔助型T細胞17分化，從而加劇該小鼠哮喘模型中氣道的炎癥反應[14]。HMGB1及其信號通路在多種炎癥相關疾病中有重要地位，HMGB1靶向治療在許多實驗室炎癥模型中已取得成功[15]，但尚未進行HMGB1特異性藥物的臨床試驗。本研究表明HMGB1及其相關信號的異常表達可能是哮喘的重要發(fā)病機制之一，阻斷該信號的異常表達將可能減輕哮喘的氣道炎癥反應。而HMGB1參與調(diào)控哮喘的機制還有待進一步研究，以更好地為治療哮喘提供新的理論支持。