非變性離子淌度質(zhì)譜在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象疾病研究方面的應(yīng)用

莊小禹，邊新宇，劉 舒，劉志強(qiáng)，宋鳳瑞

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201303；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春質(zhì)譜中心&吉林省中藥化學(xué)與質(zhì)譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130022)

蛋白質(zhì)為動態(tài)實(shí)體，要全面了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，以及蛋白質(zhì)與配體相互作用對其空間構(gòu)象的影響，需要能夠及時(shí)捕捉其構(gòu)象轉(zhuǎn)變，這對許多“經(jīng)典”的高分辨結(jié)構(gòu)生物學(xué)工具(如X射線晶體學(xué)、核磁共振和電子顯微鏡等)提出挑戰(zhàn)。這些方法雖然各具優(yōu)點(diǎn)，但通常只能提供樣品的總體信息，難以對復(fù)雜體系中各類蛋白質(zhì)構(gòu)象或蛋白質(zhì)聚集前體進(jìn)行研究，且無法直接獲取關(guān)于蛋白質(zhì)及其復(fù)合物相對分子質(zhì)量及蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合計(jì)量比方面的信息。離子淌度譜(ion mobility spectrometry, IMS)[1]可以分離質(zhì)量相同而形狀不同的離子，與準(zhǔn)生理?xiàng)l件下分析和研究生物大分子高級結(jié)構(gòu)、相互作用和動力學(xué)的非變性質(zhì)譜(native mass spectrometry, native MS)聯(lián)用，不僅可以表征單體蛋白的動態(tài)構(gòu)象，還能夠?qū)Φ鞍讖?fù)合體功能、結(jié)構(gòu)和組裝形式，以及蛋白-配體相互作用進(jìn)行研究。近年來，由于非變性離子淌度質(zhì)譜(native ion mobility-mass spectrometry, native IM-MS)可以高靈敏、快速地分析蛋白質(zhì)混合物中的構(gòu)象變化，已逐漸成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的有力工具，并被應(yīng)用于蛋白質(zhì)構(gòu)象、蛋白質(zhì)-配體相互作用、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、聚集的動力學(xué)研究等領(lǐng)域[2-6]，為傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供了豐富的互補(bǔ)信息。

1 離子淌度質(zhì)譜的基本原理及特點(diǎn)

離子淌度譜(IMS)又稱離子遷移譜，是根據(jù)氣相離子在電場和氣流形成的漂移區(qū)內(nèi)遷移率不同而分離離子的方法。傳統(tǒng)IMS測定的是離子在漂移管中的漂移時(shí)間(drift time,tD)，不僅取決于離子的質(zhì)量、帶電荷數(shù)，還與其大小和形狀相關(guān)。氣相離子進(jìn)入漂移管后，在電場驅(qū)動過程中與惰性漂移氣體(通常為氦氣、氬氣或氮?dú)?不斷發(fā)生碰撞。通常體積較大的離子比體積較小的離子與漂移管中氣體發(fā)生碰撞的機(jī)會更多，因此遷移得更慢。由于碰撞次數(shù)與離子的表面積成正比，IMS測定的漂移時(shí)間可用于確定離子旋轉(zhuǎn)時(shí)的平均碰撞截面積(collision cross section, CCS)，其反映了離子的形狀和大小。在蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)研究中，離子的碰撞截面積可以直接反映蛋白質(zhì)的三維形狀和復(fù)合物堆疊方式。

目前，已有多種離子淌度技術(shù)被開發(fā)并應(yīng)用[7-9]，較為常見的有漂移時(shí)間離子淌度譜(drift-time ion mobility spectrometry, DTIMS)、行波離子淌度譜(travelling-wave ion mobility spectrometry, TWIMS)、捕集離子淌度譜(trapped ion mobility spectrometry, TIMS)、高場非對稱離子淌度譜(field-asymmetric ion mobility spectrometry, FAIMS)，示于圖1。按照電場強(qiáng)度劃分，上述前3種可稱為低場離子淌度，最后一種為高場離子淌度。使用低場離子淌度的優(yōu)勢是可以確定離子遷移率與CCS之間的關(guān)系，因此可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)中測定的漂移時(shí)間推導(dǎo)離子的碰撞截面積，這對于研究未知結(jié)構(gòu)的蛋白單體和復(fù)合物尤為重要。

除上述幾種離子淌度技術(shù)，目前正在開發(fā)或已投入使用的還有回旋離子淌度、串聯(lián)離子淌度、超長路徑-無損離子淌度。這些新技術(shù)都使離子淌度向著高分辨、高靈敏的方向發(fā)展。

2 離子淌度質(zhì)譜可獲取的數(shù)據(jù)及信息形式

2.1 漂移時(shí)間

離子的漂移時(shí)間是離子淌度譜直接獲取的數(shù)據(jù)形式，反映了離子的碰撞截面積大小?；陔x子的漂移時(shí)間分離離子，為傳統(tǒng)質(zhì)譜增加了一個(gè)分離維度，獲得包含離子質(zhì)荷比 (m/z)、離子豐度和漂移時(shí)間的三維信息譜圖。因此，IM-MS不僅可以提供結(jié)構(gòu)信息，還可通過將數(shù)據(jù)分布到第三維來分離重疊峰，從而分析組成高度相似的異質(zhì)或多分散復(fù)合物。

2.2 漂移時(shí)間分布

漂移時(shí)間分布(arrival time distribution, ATD)峰半高處的漂移時(shí)間寬度可以反映蛋白質(zhì)和復(fù)合物的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，尖而窄的峰表示單一構(gòu)象，而較寬的峰則表明共存多種狀態(tài)的構(gòu)象，溶液中蛋白質(zhì)組裝體的構(gòu)象多樣性。因此，可以通過ATD確定蛋白質(zhì)相互作用和/或底物結(jié)合對所分析蛋白質(zhì)構(gòu)象分布的影響。

圖1 4種離子淌度技術(shù)的基本結(jié)構(gòu)與原理[7]Fig.1 Principle and structure of four main types of ion mobility instruments[7]

2.3 碰撞截面積

通過測定每個(gè)電荷狀態(tài)下的ATD，可以直接或間接計(jì)算CCS。CCS也被稱為旋轉(zhuǎn)平均碰撞截面積，代表離子與漂移氣體碰撞的有效截面積，類似于投影面積。CCS可用于反映離子的結(jié)構(gòu)特征。實(shí)驗(yàn)中測得的CCS是分析離子構(gòu)型的重要評分指標(biāo)，可以與其他由已知或推測結(jié)構(gòu)計(jì)算的CCS進(jìn)行對比[10]。

2.4 碰撞誘導(dǎo)去折疊

通過對氣相離子的碰撞活化作用，可以豐富IM-MS實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)量。當(dāng)需要區(qū)分結(jié)構(gòu)上具有細(xì)微差異的蛋白質(zhì)，以及研究蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性時(shí)，可以通過碰撞誘導(dǎo)去折疊(CIU)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。在CIU實(shí)驗(yàn)中，逐步升高碰撞能量(collision energy, CE)使蛋白離子活化，并由于庫侖斥力的作用誘導(dǎo)蛋白構(gòu)型發(fā)生變化或部分展開，之后經(jīng)過淌度分離和質(zhì)譜檢測，能夠區(qū)分同一質(zhì)荷比下緊湊和伸展的蛋白構(gòu)象，使用CCS即可判別和量化構(gòu)象變化[11]。通過CIU指紋圖譜可以更清晰直觀地觀察蛋白活化時(shí)的構(gòu)象變化，不僅可以識別配體或蛋白伴侶鍵合對蛋白結(jié)構(gòu)的影響，還可以區(qū)分源于蛋白多樣性(如可變剪接、基因復(fù)制、翻譯后修飾)的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。

3 非變性離子淌度質(zhì)譜在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

3.1 鑒定單體蛋白折疊結(jié)構(gòu)

蛋白表面的不穩(wěn)定修飾可以通過動態(tài)調(diào)控蛋白表面的化學(xué)微環(huán)境而影響蛋白的局域結(jié)構(gòu)，從而可能介導(dǎo)目標(biāo)蛋白的特定功能，但一直缺乏合適的結(jié)構(gòu)化學(xué)分析手段。Li等[12]利用非變性離子淌度方法，使用非靶向全離子去折疊(AIU)和碎裂(AIF)的方式，高通量無損操控蛋白的氣相結(jié)構(gòu)，快速有效剖析糖基化中唾液酸化修飾對轉(zhuǎn)鐵蛋白化學(xué)、構(gòu)象、拓?fù)浞€(wěn)定性的影響。將開發(fā)的AIU技術(shù)用于對差異唾液酸化修飾的轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行構(gòu)象穩(wěn)定性分析，雖然在所有的唾液酸化糖蛋白中都存在多次構(gòu)象轉(zhuǎn)變，但在相同的活化能范圍內(nèi)，這些轉(zhuǎn)鐵蛋白會經(jīng)歷不同的去折疊軌跡。因此，根據(jù)不同的3D展開軌跡圖可以很好地分辨3種轉(zhuǎn)鐵蛋白。

在生物制藥領(lǐng)域，離子淌度質(zhì)譜可在單克隆抗體(mAb)和抗體偶聯(lián)藥物(ADC)等藥用蛋白的生產(chǎn)過程中提供完整蛋白的修飾信息和其他特征[13]。如人免疫球蛋白G2(IgG2)具有多種二硫鍵差異導(dǎo)致的異構(gòu)體形式，這些異構(gòu)體具有不同的功能、活性。Bagal 等[14]利用離子淌度質(zhì)譜解析了這些異構(gòu)體，并通過分析去糖基化以及二硫鍵相關(guān)位點(diǎn)突變的各種變體，證實(shí)了二硫鍵是引起這些異構(gòu)體結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵因素。ADC藥物通常存在因小分子藥物與抗體偶聯(lián)位置不同而產(chǎn)生的位置異構(gòu)體。變性實(shí)驗(yàn)條件會破壞ADC子域之間的非共價(jià)相互作用，因此半胱氨酰連接的ADC難以通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析抗體比率(DAR)值。Marcoux等[15]將非變性離子淌度譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜應(yīng)用于ADC分析，并給出了指導(dǎo)性建議，包括從去糖基化ADC的非變性離子淌度譜獲得藥物的平均偶聯(lián)量和通過計(jì)算CCS得到的微小結(jié)構(gòu)變化來區(qū)分載藥量的差異。對于一些結(jié)構(gòu)差異太細(xì)微，不能通過直接比較碰撞截面積(或漂移時(shí)間)區(qū)分的蛋白質(zhì)，通過對氣相離子的碰撞活化作用，可以豐富離子淌度質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，示于圖2。Tian等[16]在對ADC的離子淌度譜分析中引入了CIU方法，成功區(qū)分了CCS十分相近的IgGk亞型1～4的mAb。

3.2 應(yīng)用于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、聚集及與配體相互作用的研究

蛋白質(zhì)或多肽特定的空間構(gòu)象對于其發(fā)揮正常的生物功能至關(guān)重要，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的改變會引發(fā)蛋白質(zhì)或多肽的錯(cuò)誤折疊及聚集，形成淀粉樣原纖維，并最終導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[17]，如肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)及朊蛋白病等神經(jīng)退行性疾病和糖尿病(DM)等，這些疾病又稱蛋白構(gòu)象病[18]。而銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)、β淀粉樣蛋白(Aβ)、突觸核蛋白、朊病毒蛋白、人胰淀素(hIAPP)的錯(cuò)誤折疊及聚集，分別與ALS、AD、PD、瘋牛病及糖尿病等疾病相關(guān)。但由于淀粉樣原纖維形成過程的中間體具有分散性、多態(tài)性和瞬時(shí)態(tài)的特性，分析和識別這些短暫存在的低聚態(tài)中間體一直是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

蛋白質(zhì)通常在原纖維形成之前發(fā)生去折疊和錯(cuò)誤折疊，因此表征蛋白質(zhì)的構(gòu)象特點(diǎn)是研究淀粉樣纖維形成的關(guān)鍵問題[19]。IM-MS能夠?qū)⒛骋环N蛋白單體共存的多種構(gòu)型(質(zhì)荷比相同，物理尺寸或形狀略有差異)分離開。Zhuang等[20]利用IM-MS及其串聯(lián)質(zhì)譜的方法研究了不同溶液體系對SOD1構(gòu)象的影響，以及SOD1二聚體在氣相中的構(gòu)型變化和分解過程，發(fā)現(xiàn)在非變性離子淌度質(zhì)譜條件下，SOD1二聚體可以保持完整和緊湊構(gòu)型，在氣相中經(jīng)碰撞活化后構(gòu)型會逐漸由緊湊變得伸展，同時(shí)伴隨二聚體解離成單體。該實(shí)驗(yàn)共檢測到3種構(gòu)型的二聚體(緊湊、部分伸展、伸展)及2種構(gòu)型的單體(緊湊和伸展)，根據(jù)CCS及離子淌度串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，確定了SOD1二聚體離子在氣相中的3種分解和去折疊途徑，示于圖3。

圖2 離子淌度質(zhì)譜法測定去糖基化曲妥珠單抗emtansine的藥物-抗體比[15]Fig.2 Determination of the drug-to-antibody ratio (DAR) of deglycosylated trastuzumab emtansined by IM-MS[15]

圖3 SOD1二聚體離子[Di]11+(m/z 2 858)的解離及去折疊途徑[20]Fig.3 Dissociation and unfolding pathways of SOD1 dimer ion [Di]11+ (m/z 2 858)[20]

此外，由于淀粉樣蛋白形成的早期階段具有高度異質(zhì)性，多種且快速相互轉(zhuǎn)化的物種共存于溶液中，除研究有聚集傾向的蛋白質(zhì)單體，識別和表征短暫存在的低聚態(tài)中間體是分析淀粉樣原纖維形成途徑時(shí)的難點(diǎn)。非變性離子淌度質(zhì)譜既可以保留非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物，又可以高靈敏度監(jiān)測復(fù)雜混合樣品中低濃度的物種，分離不同的寡聚物而不影響整體平衡，并且能夠提供淀粉樣蛋白組裝方式的信息以及確認(rèn)有毒低聚體的種類[21]。Illes-Toth等[22]利用IM-MS發(fā)現(xiàn)了能夠誘導(dǎo)體內(nèi)聚集的α-突觸核蛋白寡聚體的不同構(gòu)象，雖然低階低聚物相對非結(jié)構(gòu)化，且主要以線性排列方式結(jié)合，但高階低聚物(如五聚體和六聚體)會形成環(huán)狀組裝體。作者推測這種緊湊的寡聚體可能會促進(jìn)其他非結(jié)構(gòu)化蛋白質(zhì)的朊病毒樣細(xì)胞傳播。Leney等[23]比較了β-微球蛋白與它的1個(gè)D鏈單點(diǎn)突變體H51A在體外形成纖維過程的差異，發(fā)現(xiàn)H51A會更快地形成高聚體，然而二者所形成低聚體的CCS沒有明顯差異。近年來，Bowers課題組一直致力于利用離子淌度質(zhì)譜研究疾病相關(guān)的淀粉樣蛋白/多肽的聚集過程，如β淀粉樣蛋白(Aβ)、突觸核蛋白、朊病毒蛋白、人胰淀素樣多肽(hIAPP)[24-30]。他們利用IM-MS研究了tau蛋白的PHF核心結(jié)構(gòu)域，證明溶液條件決定了tau蛋白單體和寡聚體的蛋白內(nèi)和蛋白間相互作用，因此該結(jié)構(gòu)域在tau蛋白的聚集中起決定性作用。通過IM-MS表征tau蛋白的可溶性低聚物，在聚集過程中發(fā)現(xiàn)了多達(dá)八聚體的可溶性低聚物，這些低聚物會逐漸向不溶性原纖維轉(zhuǎn)移。此外，他們探索了Aβ40和Aβ42的寡聚狀態(tài)和組裝動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Aβ40主要形成單體和二聚體，同源四聚體豐度較低。因此，推測原纖維是由二聚體形成的四聚體產(chǎn)生的，而缺乏高階結(jié)構(gòu)限制了Aβ40原纖維的生長。相反，Aβ42形成展開的四聚體，并進(jìn)一步結(jié)合二聚體形成六聚體，2個(gè)六聚體相互作用形成有毒的十二聚體[29]。雖然人胰淀素樣多肽(hIAPP)與鼠胰淀素樣多肽(rIAPP)只有6個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異，但rIAPP卻不具有聚集傾向。通過離子淌度質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，帶有相同電荷數(shù)的hIAPP單體具有緊實(shí)構(gòu)象(漂移時(shí)間較短)和伸展構(gòu)象(漂移時(shí)間較長)，比rIAPP單體多了1個(gè)更伸展的構(gòu)象[30]。分子動力學(xué)模擬顯示，hIAPP單體的伸展構(gòu)象由β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成，而rIAPP更緊湊的構(gòu)象為α-螺旋結(jié)構(gòu)，這與hIAPP纖維形成起始于β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)中間體的結(jié)論接近。

對蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病的治療策略研究是在明確蛋白錯(cuò)誤折疊、聚集機(jī)制的基礎(chǔ)之上，通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，減少、阻止其寡聚體的形成或促進(jìn)其纖維化，以形成毒性很小或無毒的無定形聚集體等方法來抑制或消除淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性。Nshanian等[31]利用IM-MS探索了一種鑷子分子CLR01抑制tau蛋白聚集的機(jī)制，研究顯示，tau蛋白與抑制劑結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比為1∶1。在CLR01存在的情況下，tau蛋白明顯向緊湊構(gòu)象轉(zhuǎn)變，并且當(dāng)tau蛋白被磷酸化時(shí)效果更加突出，tau蛋白的這種結(jié)構(gòu)重塑抑制了具有聚集能的蛋白質(zhì)構(gòu)象異構(gòu)體的形成。

大量研究發(fā)現(xiàn)，各種天然產(chǎn)物可以對淀粉樣蛋白的聚集產(chǎn)生顯著影響，從而降低聚集誘導(dǎo)的毒性。Zhao等[32]基于離子淌度質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)去折疊指紋圖譜，證明表沒食子IU茶素沒食子酸酯(EGCG)能夠穩(wěn)定SOD1二聚體的結(jié)構(gòu)，減緩其去折疊；結(jié)合光譜及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明EGCG能夠抑制脫金屬輔基SOD1(apo-SOD1)的體外聚集，減少聚集過程中疏水區(qū)暴露及β層含量的增加，并減少細(xì)胞損傷。離子淌度質(zhì)譜也被用于區(qū)分天然小分子配體異構(gòu)體，以及SOD1與黃酮異構(gòu)體相互作用的研究[33-34]。Zhuang等[33]利用電噴霧-離子淌度質(zhì)譜結(jié)合光譜方法研究SOD1與黃酮化合物及其異構(gòu)體之間的非共價(jià)相互作用，發(fā)現(xiàn)SOD1與黃酮配體結(jié)合后其二聚體構(gòu)型的穩(wěn)定性得以提升，并根據(jù)分子對接方法推測二聚體界面處是黃酮配體主要的結(jié)合位點(diǎn)，證實(shí)橙皮苷、柚皮苷等黃酮苷類成分具有較好的抑制apo-SOD1體外聚集的能力。此外，該課題組[34]還利用離子淌度質(zhì)譜研究了白藜蘆醇及其衍生物提升SOD1二聚體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用，示于圖4。

SOD1的錯(cuò)誤折疊和神經(jīng)毒性聚集可由突變、金屬缺陷和翻譯后修飾引起[35]。Bian等[36]

圖4 利用native IM-MS研究虎杖苷與SOD1的相互作用[34]Fig.4 Research of interactions between SOD1 and polydatin by native IM-MS[34]

利用非變性離子淌度質(zhì)譜揭示了鋅缺乏SOD1的氧化損傷風(fēng)險(xiǎn)。銅離子在氧化前期被釋放，這可能是其結(jié)合位點(diǎn)被氧化的結(jié)果。另一方面，缺鋅SOD1比脫輔基SOD1具有更快的解離傾向。碰撞誘導(dǎo)去折疊表明，缺鋅SOD1氧化后更易轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆煺箻?gòu)象。黃豆黃苷能抑制鋅缺乏SOD1的氧化，并抑制氧化鋅缺乏SOD1構(gòu)象的轉(zhuǎn)變及聚集，示于圖5。

體外研究表明[37-39]，EGCG可以改變多種淀粉樣蛋白的聚集途徑，并將已形成的聚集體解聚，形成無毒性的無定形聚集體。Bleiholder等[39]基于IM-MS方法研究了Aβ淀粉樣纖維的形成及其與抑制劑EGCG的相互作用，發(fā)現(xiàn)EGCG可有效抑制β構(gòu)象的寡聚體形成，并將淀粉樣纖維轉(zhuǎn)變?yōu)榫o湊的顆粒狀沉淀。Young等[40]證明了IM-MS在篩選和表征Aβ抑制劑方面的能力，確定了小分子與淀粉樣蛋白前體(hIAPP)和Aβ-40結(jié)合的抑制劑，表征了相互作用的蛋白質(zhì)種類(單體或寡聚體)并闡明聚集抑制機(jī)制，包括抑制劑結(jié)合的性質(zhì)(特異性、非特異性或膠體)、抑制模式-單體結(jié)合、單體構(gòu)象平衡的轉(zhuǎn)變、低聚物的分解等。作者提出IM-MS是一種有前途的高通量篩選工具，并通過IM-MS發(fā)現(xiàn)了一種新的hIAPP自組裝抑制劑。Pang等[41]利用電噴霧離子淌度質(zhì)譜結(jié)合多種分析方法，分別從hIAPP的構(gòu)象變化、聚集動力學(xué)的影響、聚集中疏水區(qū)域的暴露等多方面考察了紫草酸對hIAPP聚集的抑制作用。發(fā)現(xiàn)紫草酸與hIAPP結(jié)合形成的復(fù)合物可以改變hIAPP單體緊實(shí)構(gòu)象和伸展構(gòu)象的相對豐度，從而維持hIAPP構(gòu)象的穩(wěn)定性，并證明紫草酸能夠有效抑制hIAPP聚集，減少纖維生成。

圖5 利用DTT/H2O2氧化(a,b)和還原(c,d)ApoSOD1(P1)和ApoSOD1(P1)的IM熱圖，以及P1(e)、P2(f)單體的離子淌度譜圖[36]Fig.5 IM heat maps of oxidized (a, b) and reducted (c, d) ApoSOD1 (P1) and ApoSOD1 (P1),IM spectra of +8 charged P1(e) and P2(f) monomer induced by DTT or H2O2[36]

越來越多的研究表明[42-45]，某些疾病相關(guān)蛋白質(zhì)聚集過程中形成的可溶性寡聚體具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可能是致病的重要原因，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的降低與寡聚體的形成密切相關(guān)。因此，針對疾病相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、錯(cuò)誤折疊及寡聚體形成與干預(yù)措施進(jìn)行深入研究顯得尤為重要。利用靈敏、快捷、特異性強(qiáng)的非變性離子淌度質(zhì)譜方法，結(jié)合多重串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(如碰撞誘導(dǎo)解離(CID)以及電子轉(zhuǎn)移解離(ETD))，以及光譜、計(jì)算機(jī)模擬及細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，針對上述疾病相關(guān)蛋白及多肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、錯(cuò)誤折疊及聚集抑制劑的篩選進(jìn)行深入研究，既有助于闡明蛋白構(gòu)象病的發(fā)病機(jī)制，也有利于臨床的靶向治療及相關(guān)創(chuàng)新藥物的研發(fā)。雖然篩選得到的具有穩(wěn)定蛋白構(gòu)象、抑制蛋白聚集的天然小分子配體最終應(yīng)用于臨床有待考察，但仍為尋找治療蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊疾病的臨床藥物提供了新途徑[46]。

4 結(jié)語

非變性離子淌度質(zhì)譜已逐漸成為一種為傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)提供互補(bǔ)信息的重要研究手段。雖然非變性離子淌度質(zhì)譜缺少揭示原子水平的分辨率，但分析蛋白質(zhì)異質(zhì)復(fù)合物及蛋白質(zhì)-配體相互作用的能力比其他方法更具獨(dú)特優(yōu)勢。此外，使用離子淌度質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測具有快速、靈敏的特點(diǎn)，尤其是近年來將其與native top-down方法進(jìn)行整合，以及與多種解離方式結(jié)合，使非變性離子淌度質(zhì)譜可以提供更豐富的結(jié)構(gòu)信息。隨著高分辨、靈敏便捷的新一代離子淌度質(zhì)譜技術(shù)的不斷開發(fā)和完善，以及與多樣化質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)一步整合，非變性離子淌度質(zhì)譜技術(shù)在疾病相關(guān)的生物大分子結(jié)構(gòu)及相互作用分析方面將擁有更加廣闊的應(yīng)用前景。