石豆蘭雜交種無菌播種技術(shù)研究

田海娟，鄒婉霞，郝靜靜，歐陽勤森，卓書斌，馬洪洋

（東莞植物園，廣東 東莞 523086）

石豆蘭屬（BulbophyllumThouars）是蘭科（Orchidaceae）最大的一個(gè)屬，約有2 200種，主要分布于亞洲、南美洲、非洲等熱帶地區(qū)[1]。我國約有105種，廣泛分布于貴州、廣西、云南和福建等地[2]。該屬植物大部分的假鱗莖呈圓形，頂端長有一枚單葉，形態(tài)特征明顯，其株形優(yōu)美，具有很高的觀賞價(jià)值和市場前景。有些全草或假鱗莖皆可入藥，具有潤肺止咳、養(yǎng)胃生津、清熱化痰、滋陰降火、抗癌、抗腫瘤等功效[3-5]，具有一定的藥用價(jià)值。由于石豆蘭種子胚胎發(fā)育不充分，不含胚乳，在自然條件下很難萌發(fā)[6]，而傳統(tǒng)的繁殖方式如分株繁殖等繁殖系數(shù)低、生長速度緩慢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足市場需求。通過人工組織培養(yǎng)技術(shù)，可以在短期內(nèi)獲得大量的優(yōu)質(zhì)種苗供市場所需，而目前我國針對(duì)石豆蘭屬組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道較少，因此，建立石豆蘭屬植物組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)體系尤為重要。本研究通過人工雜交種的無菌播種，再經(jīng)過增殖培養(yǎng)，可在短期內(nèi)獲得大量的組培苗以供栽培，亦可為石豆蘭快速繁殖提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材以石豆蘭品種‘Bulbophyllumpingtungense’為父本，‘Bulbophyllumfascinator var.corazonae’為母本，在東莞植物園蘭花棚培養(yǎng)開花后，經(jīng)人工授粉150 d后所得的成熟蒴果。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 設(shè)置培養(yǎng)箱的溫度為（24±2）℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx（暗培養(yǎng)階段除外），光照時(shí)間12 h·d-1。

1.2.2 種子消毒及無菌播種 采集未開裂的成熟蒴果，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)先用洗潔精水洗去蒴果表面附著的雜質(zhì)，再置于流水下沖洗約10 min，注意水流不宜太大，以免沖破蒴果表皮。提前打開超凈工作臺(tái)開紫外燈和風(fēng)機(jī)，滅菌20 min，然后將種子移至超凈工作臺(tái)上，先用75%的酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗3次，之后用0.1%的升汞消毒10 min，期間適當(dāng)晃動(dòng)瓶身以保證種子消毒均勻且徹底，再用無菌水反復(fù)沖洗5～7次，將其放至在滅過菌的濾紙上，吸干蒴果表面多余的水分，用滅菌的解剖刀切掉蒴果兩端（注意不要切到種子的部分），最后縱向切開蒴果，用鑷子夾取粉末狀的種子，利用手腕的抖動(dòng)均勻的撒播在培養(yǎng)基上。

種子萌發(fā)所選用的培養(yǎng)基為：①1/2MS；②1/2 MS+活性炭1 g·L-1；③1/2MS+土豆汁100 g·L-1+活性炭1 g·L-1。土豆汁的制備方法：新鮮土豆削皮，稱取100 g用榨汁機(jī)攪碎后加到1 L的培養(yǎng)基溶液中。以上培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂粉7.6 g·L-1，設(shè)置pH值5.8。先置于暗環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，待種子開始膨大后再轉(zhuǎn)入光條件下繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d后觀察種子萌發(fā)情況。

1.2.3 芽的增殖 將已分化出嫩芽的原球莖轉(zhuǎn)接到添加了不同激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA和NAA（表1），每組均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7.6 g·L-1、活性炭1 g·L-1，設(shè)置pH值5.8，每組處理分別接種10瓶，每瓶接種10個(gè)芽，重復(fù)3次。培養(yǎng)50 d后觀察并統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基中芽的增殖情況。

表1 石豆蘭芽的增殖培養(yǎng)基

1.2.4 生根壯苗培養(yǎng) 待原球莖分化出的小苗具有1～2片健壯葉片、高約2 cm時(shí)轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行成苗培養(yǎng)，培養(yǎng)基以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA和IBA（表2），每組均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂粉7.6 g·L-1、活性炭1 g·L-1，設(shè)置pH值5.8。培養(yǎng)一段時(shí)間后，確定最優(yōu)培養(yǎng)基，然后在最優(yōu)培養(yǎng)基中添加土豆汁100 g·L-1（表2）。培養(yǎng)60 d后，每組處理隨機(jī)選擇30瓶，觀察不同培養(yǎng)基中幼苗的生根壯苗情況，統(tǒng)計(jì)生根率、平均根數(shù)及平均株高等生長指標(biāo)。

表2 石豆蘭成苗培養(yǎng)基

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistic 28.0和WPS軟件進(jìn)行處理分析。平均出芽數(shù)＝總芽數(shù)/接種數(shù)；生根率＝產(chǎn)生根的植株數(shù)/接種數(shù)×100%；平均生根數(shù)＝總根數(shù)/接種數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加物對(duì)石豆蘭種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，本試驗(yàn)所選用的3種培養(yǎng)基對(duì)石豆蘭種子的萌發(fā)效果差異明顯。在培養(yǎng)基③中，播種30 d后，種子開始膨大變白形成球狀胚，培養(yǎng)60 d后，胚體繼續(xù)膨大并變綠形成原球莖，同時(shí)自頂部開始長出葉片；在培養(yǎng)基②中，石豆蘭雜交種子也可正常萌發(fā)，但其萌發(fā)時(shí)間晚、萌發(fā)數(shù)量少，形成的原球莖不如培養(yǎng)基③中的原球莖濃綠、膨大，有部分種子失活甚至死亡的現(xiàn)象發(fā)生；在培養(yǎng)基①中，種子培養(yǎng)60 d后只有極少數(shù)種子萌發(fā)，其形成白色球狀胚后生長速度開始變緩，甚至死亡，萌發(fā)率低。由本試驗(yàn)可知，一定量的活性炭和土豆汁對(duì)石豆蘭種子的萌發(fā)均有影響，當(dāng)同時(shí)添加土豆汁100 g·L-1、活性炭1 g·L-1時(shí)的萌發(fā)效果最好，能夠有效的加快石豆蘭種子生長發(fā)育和原球莖的形成，且形成的原球莖健壯、濃綠。因此，本試驗(yàn)中適于石豆蘭雜交種子萌發(fā)的培養(yǎng)基為：1/2MS+土豆汁100 g·L-1+活性炭1 g·L-1。

圖1 不同培養(yǎng)基中石豆蘭種子萌發(fā)情況

2.2 不同激素配比對(duì)石豆蘭芽增殖的影響

將已分化出芽的原球莖轉(zhuǎn)接到添加了不同激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，由表3可知，不同濃度的6-BA和NAA對(duì)石豆蘭雜交種芽的增殖效果差異顯著，當(dāng)NAA濃度不變，6-BA濃度在0.5～1.0 mg·L-1范圍內(nèi)時(shí)，平均出芽數(shù)隨著6-BA濃度的增大呈上升趨勢(shì)；當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，平均出芽數(shù)為9.2個(gè)，達(dá)到最大；6-BA濃度和NAA濃度繼續(xù)升高時(shí)，平均出芽數(shù)開始降低。處理4中原球莖分化出的小苗長勢(shì)好、顏色濃綠、苗體健壯，少量小苗已有根系產(chǎn)生（圖2）。綜合可知，本試驗(yàn)中石豆蘭雜交種芽的增殖最適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+活性炭1 g·L-1。

表3 不同激素組合對(duì)石豆蘭雜交種芽增殖的影響

圖2 處理4中石豆蘭雜交種芽的增殖情況

2.3 激素和有機(jī)物對(duì)石豆蘭生根壯苗的影響

將分化形成的具有完整葉片的小苗轉(zhuǎn)移到壯苗生根培養(yǎng)基中進(jìn)行成苗培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)60 d后的生根情況。由表4可知，NAA和IBA的濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，石豆蘭雜交種幼苗的生根率較低，只有35.33%，此時(shí)植株弱小，葉色黃綠；當(dāng)NAA濃度不變、IBA濃度在0.5～1.0 mg·L-1時(shí)，隨著濃度的升高，石豆蘭雜交種幼苗的生根率、平均根數(shù)和平均株高均表現(xiàn)出顯著性差異；就NAA而言，對(duì)石豆蘭雜交種的生根率和平均根數(shù)的影響呈先促進(jìn)后抑制，而當(dāng)NAA和IBA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，平均株高為4.38 cm，此時(shí)石豆蘭雜交種出現(xiàn)了少量增殖情況，植株細(xì)長；當(dāng)NAA濃度為0.5 mg·L-1、IBA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，石豆蘭雜交種幼苗的生根率為91.67%，在此基礎(chǔ)上添加100 g·L-1的土豆汁，石豆蘭雜交種的生根率達(dá)到100%、平均根數(shù)為3.88條、平均株高為4.18 cm，此時(shí)幼苗生根壯苗情況最好，其葉片寬大質(zhì)厚，顏色濃綠、植株健壯、根系多而粗壯（圖3）。綜合可知，本試驗(yàn)中石豆蘭雜交種壯苗生根最適宜的培養(yǎng)基為：1/2MS+NAA0.5 mg·L+IBA1.0 mg·L-1+活性炭1 g·L-1+土豆汁100 g·L-1。

圖3 不同培養(yǎng)基中石豆蘭雜交種組培苗的生根壯苗情況

表4 不同激素和有機(jī)物對(duì)石豆蘭雜交種組培苗生根的影響

3 結(jié)論與討論

目前關(guān)于石豆蘭組織培養(yǎng)的相關(guān)研究和文獻(xiàn)報(bào)道非常少，本研究開始前查閱了蘭科其他屬植物無菌播種技術(shù)的相關(guān)研究成果，并在試驗(yàn)初期種子的消毒方式、不同階段培養(yǎng)基的選擇以及播種初期的培養(yǎng)條件等方面進(jìn)行了參考。陳和明等[7]、張?jiān)聥蒣8]、林榕燕等[9]在對(duì)蘭花種子進(jìn)行消毒時(shí)都用了70%～75%的酒精（30～60 s）和0.1%的升汞（10～20 min）的處理方式。經(jīng)綜合考慮，本研究對(duì)石豆蘭種子的消毒方式為：先用75%的酒精消毒30 s，再用0.1%的升汞消毒10 min，最后用無菌水沖洗5～7次，試驗(yàn)結(jié)果顯示種子未發(fā)生污染現(xiàn)象，由此可知，運(yùn)用此方式對(duì)石豆蘭雜交種子進(jìn)行消毒是可行的。

蘭科不同屬植物在無菌播種階段適宜培養(yǎng)基大不相同，本研究以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以土豆汁和活性炭作為對(duì)照，結(jié)果表明，3種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)種子萌發(fā)，以添加活性炭1 g·L-1和土豆汁100 g·L-1的培養(yǎng)基萌發(fā)效果最佳。這與林榕燕等[9]、劉揚(yáng)等[10]、賴金莉等[11]對(duì)雜交蘭（Cymbidium hybrid）、兜唇石斛（Dendrobium aphyllum）和建蘭（Cymbidium ensifolium）的研究結(jié)果相似，而與張?jiān)骆痆8]、張小娟等[12]對(duì)墨蘭（Cymbidium sinense）的研究結(jié)果存在差異。原因可能是不同屬的種子在萌發(fā)時(shí)對(duì)無機(jī)鹽、糖類、有機(jī)物質(zhì)以及植物生長調(diào)節(jié)劑的要求有所不同。

很多蘭科植物在播種初期需要先進(jìn)行一段時(shí)間的暗培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，本研究依照此方法對(duì)石豆蘭雜交種子進(jìn)行培養(yǎng)，其作用可能是部分蘭花種子萌發(fā)時(shí)要求較低水平的遠(yuǎn)紅光吸收型光敏色素（Pfr）[13]，以及暗培養(yǎng)可以減少組培外植體的褐化情況[14]，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)。

植物激素對(duì)芽的增殖具有重要的調(diào)控作用，黃崇成等[15]對(duì)石豆蘭鱗芽進(jìn)行增殖時(shí)發(fā)現(xiàn)，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加6-BA 0.4 mg·L-1、NAA0.2 mg·L-1增殖效果最好；李洪林等[16]在對(duì)廣東石豆蘭（Bublophyllumkwangtungense）進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)，所用激素配比以6-BA 2.5 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1為最佳，增值系數(shù)可達(dá)4～5倍。本研究在石豆蘭芽的增殖階段以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以添加不同濃度的6-BA和NAA作為試驗(yàn)對(duì)照。結(jié)果表明，不同處理均可誘導(dǎo)出芽，在添加6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1和活性炭1 g·L-1的培養(yǎng)基中增殖效果最好，平均出芽數(shù)達(dá)到9.2個(gè)，這與黃崇成等[15]和李洪林等[16]的研究結(jié)果相似，也與部分近緣屬石斛蘭（Dendrobium）的增殖類似[17-18]。

本研究中，通過在種子萌發(fā)階段添加活性炭對(duì)比發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的活性炭能夠促進(jìn)種子萌發(fā)，其作用可能是活性炭能夠吸附培養(yǎng)基中的一些營養(yǎng)物質(zhì)以及代謝過程中產(chǎn)生的廢棄物，從而促進(jìn)種子的形態(tài)發(fā)生和器官形成[19]，因此在增殖培養(yǎng)階段也添加了活性炭；而在生根培養(yǎng)階段添加活性炭，其作用可能是在培養(yǎng)基底部形成一個(gè)比較暗的局部環(huán)境，促進(jìn)根系的生長和發(fā)育，從而達(dá)到生根壯苗的目的[10]。

相關(guān)研究表明，適宜濃度的有機(jī)添加物可促進(jìn)蘭花種子萌發(fā)，在成苗階段可以促進(jìn)幼苗葉片增大增厚和根系的發(fā)生，通?？蛇x擇椰汁、土豆汁和香蕉汁等有機(jī)物。王汪中等[20]的研究結(jié)果表明，添加7.5%的土豆泥可有效地提高杜鵑蘭（Cremastra appendiculata）種子的萌發(fā)率；席剛俊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在白芨（Bletilla striata）種子萌發(fā)培養(yǎng)基中添加200 g·L-1的土豆泥，萌發(fā)率可達(dá)（83.47±3.11）%；許丁帆等[17]的研究結(jié)果表明，添加50 g·L-1的土豆泥對(duì)玫瑰石斛（Dendrobium crepidatum）的生根壯苗影響顯著。由于土豆汁價(jià)格便宜且易獲得，因此，本研究以添加土豆汁為對(duì)照對(duì)石豆蘭雜交種不同階段的培養(yǎng)進(jìn)行探討。結(jié)果表明，在添加1 g·L-1活性炭和100 g·L-1的土豆汁的共同作用下，石豆蘭雜交種子的萌發(fā)效果最好；在生根壯苗階段添加100 g·L-1的土豆汁能夠有效地促進(jìn)根系的分化和幼苗生長，這是由于土豆汁中的各種維生素、糖類、有機(jī)物質(zhì)和礦物質(zhì)等微量元素提供給組培苗生長發(fā)育所需要的各種養(yǎng)分，同時(shí)能夠提高組培苗在弱光環(huán)境下的碳代謝的能力，從而促進(jìn)幼苗的壯苗和生根[22]。