羅氏沼蝦Dmc1基因的克隆及表達分析

楊彥豪， 黎 銘， 王 瑞， 黃 姻， 楊慧贊， 黃光華， 邱高峰， 曾 蘭

(1.上海海洋大學/農業(yè)農村部淡水水產種質資源重點實驗室/水產科學國家級實驗教學示范中心/上海水產養(yǎng)殖工程技術研究中心，上海 201306；2.廣西壯族自治區(qū)水產科學研究院/廣西水產遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西南寧 530021)

Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是DNA重組酶RecA/Rad51家族成員之一，在同源染色體配對、聯(lián)會、重組和分離過程中具有重要作用[1]。Dmc1基因最早在酵母中發(fā)現，被鑒定為減數分裂過程中的特異性基因[2]，具有催化DNA雙鏈交換的能力[3]，還可以通過抑制解旋酶Srs2的活性來協(xié)助減數分裂過程中交叉的形成，從而保證減數分裂的完整性[4]。已有的研究表明，在減數分裂過程中，Dmc1基因可在睪丸和卵巢特異表達，其突變可能導致減數分裂停滯[5-7]。迄今為止，已在多個物種中發(fā)現Dmc1基因，一些水生動物的Dmc1基因也得到了克隆和鑒定[11-16]。

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)是淡水養(yǎng)殖蝦類主要品種之一。近年來，由于引種混亂、育苗技術不規(guī)范、近親繁殖等，造成羅氏沼蝦種質資源退化問題日趨嚴重，影響了羅氏沼蝦產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，探索研究羅氏沼蝦生長發(fā)育相關的分子調控機制成為解決這些問題的可行途徑。目前，有關羅氏沼蝦的研究主要集中在生物形態(tài)學[17-18]、種群生態(tài)學[19-20]、遺傳學[21-24]方面，有關羅氏沼蝦Dmc1基因的研究尚未見報道。本研究利用RACE技術對羅氏沼蝦Dmc1(MrDmc1)基因進行全長cDNA克隆，利用生物信息學方法分析MrDmc1基因編碼區(qū)特征、理化性質及系統(tǒng)進化關系，并利用熒光定量PCR對其在不同組織、卵巢發(fā)育不同時期的表達情況進行分析，以期為進一步研究MrDmc1基因在卵巢發(fā)育過程中的作用，探究羅氏沼蝦卵巢發(fā)育分子調控機制，建立羅氏沼蝦卵巢發(fā)育人工調控新技術，推進羅氏沼蝦遺傳改良及分子輔助育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自廣西南寧國家級羅氏沼蝦良種場，選擇健康的4月齡羅氏沼蝦，采集卵巢置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于Dmc1基因克隆。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank中斑節(jié)對蝦Dmc1基因序列(EU440762)，利用Primer 5.0軟件設計接頭引物、5′RACE特異性引物、3′RACE特異性引物和實時熒光定量PCR引物，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 羅氏沼蝦總RNA提取及cDNA合成

凍存的卵巢組織按Trizol提取試劑盒說明書的步驟提取總RNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA。去除基因組DNA后，進行cDNA第1鏈合成，合成cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MrDmc1基因克隆

1.4.1 5′-RACE 以特異性引物RC779-RT1/RC779-RT2反轉錄，得到cDNA，經RNase H 和末端轉移酶TdT處理后，進行巢氏PCR(操作步驟見英杰公司5′-RACE系統(tǒng)手冊)。PCR反應條件見表2。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收純化后連接pMD18-T載體，轉化感受態(tài)細胞(SK2301)，以pMD18-T載體的通用引物做菌落PCR，將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.2 3′-RACE 以3′接頭引物做反轉錄，獲得的cDNA為模版進行巢式PCR，PCR反應條件見表3。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經過膠回收、純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。根據5′RACE和3′RACE測序得到的序列，利用DNAMAN軟件拼接獲得MrDmc1基因的全長序列。

表2 5′-RACE反應條件

表3 3′-RACE反應條件

1.5 生物信息學分析

通過NCBI ORF finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)網站在線分析基因的開放閱讀框(ORF)和其編碼的氨基酸序列；MrDMC1蛋白的保守結構域由NCBI conserved domain(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam(http：//pfam.xfam.org/)在線預測獲得；利用 Expasy ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析MrDMC1蛋白質氨基酸組成、分子量、理論等電點等；利用RARE CODON CALTOR在線軟件(http：//https：//people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html)計算基因序列的稀有密碼子；利用ProtScale、SignalP 6.0 Sever和TMHMM Sever v.2.0在線分析蛋白質的親疏水性、信號肽。利用NetNGlyc 1.0 server和NetPhos 3.1 server預測蛋白糖基化和磷酸化位點；利用PSORTⅡ Prediction 在線軟件(http：//psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位；通過SOPMA和SWISS-MODEL在線預測工具分析MrDMC1蛋白的二級和三級結構；用DNAStar軟件中的MegAlign程序對MrDmc1基因序列與其他物種的Dmc1基因序列進行比對，并利用MEGA 5.1軟件中鄰接法(Neighbor Joining)構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 實時熒光定量PCR分析MrDmc1基因的表達

根據克隆獲得的MrDmc1基因序列設計引物，以β-action基因作為內參，進行實時熒光定量PCR反應。反應體系如下：Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 4μL；擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。利用2-ΔΔCT法計算MrDmc1基因的相對表達量。利用IBM SPSS Statistics軟件對MrDmc1基因表達差異性進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 羅氏沼蝦總RNA提取及檢測

使用Trizol法提取羅氏沼蝦卵巢的總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，NanoDrop 2000分光光度計檢測其純度和濃度，選取D260 nm/D280 nm的值在1.90～2.0范圍的樣品用于后面的試驗研究(圖1-A)。

2.2 MrDmc1基因全長序列克隆及序列分析

利用特異性引物RC779-RT1/RC779-RT2反轉錄，得到cDNA，經RNase H 和TdT處理后，進行5′-RACE巢氏PCR(圖1-B)；利用3′接頭為反轉引物的cDNA為模版進行3′-RACE巢式PCR(圖1-C)；通過DNAMAN拼接獲得MrDmc1基因全長序列，對基因序列分析表明MrDmc1基因序列全長為 1 627 bp，ORF為1 026 bp，包含542個密碼子，編碼蛋白包含341個氨基酸(圖2)。

2.3 生物信息學分析

對MrDmc1基因進行生物信息學分析，結果表明，MrDMC1蛋白分子式為C1648H2644N460O514S10，理論分子量為37.4 ku，為親水性穩(wěn)定蛋白(圖3)；該蛋白具有Rad51結構域和helix-hairpin-helix(HhH)結構域(圖4)，沒有跨膜區(qū)域和信號肽切割位點(圖5)，含有1個N-糖基化位點和25個磷酸化位點(圖6)；該蛋白主要存在于細胞質(60.9%)、細胞核(17.4%)和細胞骨架中(17.4%)；該蛋白二級結構中α-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規(guī)卷曲分別占48.39%、13.78%、7.04%、30.79%，三級結構與人減數分裂重組蛋白DMC1(SWTL ID：7c99.1)的相似度為78.11%(圖7)。

2.4 系統(tǒng)進化樹

在NCBI數據庫中下載凡納濱對蝦(Penaeus vannamei，ADM45305.1)等31個物種DMC1蛋白的氨基酸序列，利用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)進化樹(圖8)，結果表明羅氏沼蝦與甲殼綱動物的進化關系最為接近，與魚類的親緣關系較遠。

2.5 MrDmc1基因的mRNA表達分析

MrDmc1基因的組織表達譜表明，在雌蝦7個不同組織中MrDmc1基因均有表達，其中，在心臟中的表達量最高，其次是肝胰腺、鰓，在眼中的表達量最低。單因素方差分析發(fā)現，除在卵巢與肌肉、肝胰腺與鰓中的表達量差異為不顯著外，其他各組織之間的表達量差異均為極顯著(P<0.01)(圖9)。

以4個不同發(fā)育時期的羅氏沼蝦卵巢組織為試驗材料，進一步研究MrDmc1基因在卵巢中的表達規(guī)律，結果表明，在卵巢發(fā)育過程中，MrDmc1基因呈先上升再下降的趨勢，在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達量達到最高，從卵巢發(fā)育Ⅱ期開始表達量逐步降低。單因素方差分析表明，MrDmc1基因在不同發(fā)育時期卵巢中的表達差異為極顯著(P<0.01)(圖10、圖11)。

3 討論

利用現代分子生物學技術，探究羅氏沼蝦生長發(fā)育相關的分子調控機制，是推動羅氏沼蝦產業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑。因此，深入開展羅氏沼蝦生殖發(fā)育相關的分子研究，揭示羅氏沼蝦卵巢發(fā)育的分子調控機制尤為關鍵。Dmc1基因已被證明是具有DNA重組酶活性的RecA/Rad51超家族的成員之一[25]。對同源染色體之間DNA鏈的交換和減數分裂過程中斷鏈雙鍵的修復是必不可少的[26]。本研究利用RACE技術對羅氏沼蝦Dmc1基因進行克隆，獲得了MrDmc1基因的全長cDNA序列，為MrDmc1基因功能等方面研究奠定基礎。

一些水生動物Dmc1基因已有報道，且不同動物的Dmc1基因長度不同[11-17]。本研究首次克隆了羅氏沼蝦MrDmc1基因的核苷酸序列，并對其進行了生物信息學分析，發(fā)現該基因全長為1 627 bp，ORF為1 026 bp，編碼341個氨基酸，與斑節(jié)對蝦、中華絨螯蟹、 克氏原螯蝦的基因編碼區(qū)一致。基因相似性分析表明，羅氏沼蝦MrDmc1與中華絨螯蟹、克氏原螯蝦、凡納濱對蝦和美洲龍蝦的基因相似性較高；氨基酸序列同源性比較表明，羅氏沼蝦MrDMC1與克氏原螯蝦同源性最高，為92.96%，其次是美洲龍蝦(90.91%)和凡納濱對蝦(90.32%)，與文昌魚同源性最低，為77.35%；系統(tǒng)進化樹表明，羅氏沼蝦MrDmc1基因與克氏原螯蝦、凡納濱對蝦等甲殼類動物進化關系較近，與魚類的親緣關系較遠，說明該基因在不同物種間的保守型存在差異。生物信息學分析表明，羅氏沼蝦MrDMC1蛋白的分子量為37.4 ku，為穩(wěn)定親水性蛋白，該蛋白中無信號肽和跨膜區(qū)域，不是跨膜蛋白或分泌蛋白，MrDMC1蛋白存在1個N-糖基化位點和25個磷酸化位點，主要定位于細胞質中。預測結果可為后期體外構建羅氏沼蝦MrDmc1基因原核表達載體及蛋白的表達優(yōu)化提供重要的科學數據。

組織表達分析顯示，MrDmc1基因在羅氏沼蝦卵巢等7個組織中均有表達，且在不同組織中存在差異，在心臟中的表達量最高，其次是肝胰腺、鰓，在眼中的表達量最低。已有的研究表明，Dmc1基因在多個物種的性腺中高表達，在不同倍性鯉魚[12]、紅腹蠑螈[27]、達氏鱘[28]和南方鲇[29]的研究中，Dmc1基因只在性腺中表達。在斑節(jié)對蝦的研究中，Dmc1基因在性腺、心臟和血細胞中均有表達[14]；在日本鰻鱺的研究表明Dmc1基因主要在性腺中表達，在大腦中也有表達[11]。在本研究中，MrDmc1基因在卵巢中的表達水平不高，與所用卵巢樣品處于的卵巢發(fā)育Ⅲ期有關；MrDmc1基因在卵巢等7個不同組織中均有表達，表明Dmc1基因在脊椎動物和無脊椎動物中的生物功能可能存在差別。

MrDmc1基因在不同發(fā)育時期卵巢中的表達結果顯示，MrDmc1基因在卵巢發(fā)育Ⅰ期到Ⅱ期表達量逐步增高，在卵巢發(fā)育Ⅱ期達到最高，從卵巢發(fā)育Ⅱ期開始MrDmc1基因表達量逐步降低。達氏鱘Dmc1基因在0～Ⅰ期精巢中不表達，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期精巢中表達量逐步升高，并在Ⅳ期精巢中達到最高，在Ⅴ期精巢中，表達量顯著下降[29]；小鼠dmc1基因僅在減數分裂Ⅰ細線期到偶線期的精母細胞中特異表達[10]；蠑螈dmc1基因在減數分裂Ⅰ細線期開始表達，一直持續(xù)到精子生成階段[27]。日本鰻鱺dmc1基因只在減數分裂Ⅰ的早期表達，并且持續(xù)到粗線期，但是表達量卻逐漸降低[11]。本研究發(fā)現MrDmc1基因在卵巢發(fā)育早期表達量較高，隨著卵巢的逐漸成熟，MrDmc1隨之降低，在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達量最高，隨后逐漸降低，說明MrDmc1基因參與了羅氏沼蝦卵巢發(fā)育，推測其在卵巢發(fā)育早期發(fā)揮關鍵的調控作用。

4 結論

本試驗通過RACE技術獲得羅氏沼蝦MrDmc1基因，基因全長為1 627 bp，ORF為1 026 bp，存在542個密碼子，編碼341個氨基酸；系統(tǒng)進化樹發(fā)現羅氏沼蝦MrDmc1基因與克氏原螯蝦、凡納濱對蝦等甲殼類動物進化關系較近。生物信息學分析表明，MrDMC1蛋白分子量為37.4 ku，沒有跨膜區(qū)域和信號肽切割位點，含有1個N-糖基化位點和25個磷酸化位點，是親水性蛋白，主要存在細胞質中。熒光定量PCR檢測結果顯示，MrDmc1基因在卵巢等7個組織中均有表達，且在不同組織中存在差異；MrDmc1基因在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達量達到最高，推測其在卵巢發(fā)育早期發(fā)揮關鍵的調控作用。試驗結果可為進一步研究羅氏沼蝦Dmc1基因的生物學功能，探究羅氏沼蝦卵巢發(fā)育分子調控機制提供重要依據。