串晶結(jié)構(gòu)纖維調(diào)控成纖維細胞行為

李曉婧， 焦勇杰， 李超婧， 王富軍， 王 璐

(東華大學(xué) a.紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室，b.產(chǎn)業(yè)用紡織品教育部工程研究中心，c.紡織學(xué)院， 上海 201620)

傷口快速有效愈合是整個醫(yī)學(xué)界關(guān)注的問題。成纖維細胞是負責(zé)生產(chǎn)、重塑和維持細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的細胞[1]。在傷口愈合早期，成纖維細胞通過向肌成纖維細胞分化并分泌ECM獲得收縮力以閉合傷口[2-4]。傷口上皮化完成后，若肌成纖維細胞未及時凋亡，會產(chǎn)生過量的ECM從而形成瘢痕組織[2-6]。因此，探究成纖維細胞-肌成纖維細胞分化對于損傷后結(jié)締組織的生理重建和纖維化病變研究具有重要意義[7-9]。文獻報道[2,10-11]指出，成纖維細胞-肌成纖維細胞的分化受到生化和物理因素的影響。而生物體內(nèi)細胞所在的動態(tài)微環(huán)境中存在很多會影響細胞行為，如基因/蛋白質(zhì)表達的物理和生化因素[12-13]。其中，物理因素如施加的外力或ECM的結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能，特別是ECM納米和微米級表面拓撲結(jié)構(gòu)，對于調(diào)控細胞行為而言最為有效、簡便與穩(wěn)定[14]。

串晶結(jié)構(gòu)是由中間纖維狀晶體與垂直于纖維軸方向的片晶構(gòu)成的結(jié)晶結(jié)構(gòu)[15]，其中由溶液孵育法誘導(dǎo)的串晶結(jié)構(gòu)因操作簡單、可用材料廣泛、片晶尺寸和密度可控，可便捷地調(diào)控材料的表面結(jié)構(gòu)、力學(xué)和熱學(xué)性能，影響細胞的黏附、增殖等行為，被廣泛應(yīng)用于組織工程[16-17]。Guo等[16]發(fā)現(xiàn)，靜電紡聚己內(nèi)酯(PCL)串晶結(jié)構(gòu)纖維支架可為內(nèi)皮細胞提供適宜的生長微環(huán)境，促進內(nèi)皮細胞遷移和增殖，有效改善血管內(nèi)皮化。Liu等[18]制備了負載BMP-2的電紡PCL串晶結(jié)構(gòu)纖維支架，研究表明除化學(xué)因素外，粗糙度較大的串晶結(jié)構(gòu)纖維也會影響干細胞的募集、遷移和分化。針對串晶結(jié)構(gòu)對各類細胞行為影響的文獻研究較多，但鮮有關(guān)于串晶結(jié)構(gòu)片晶密度對成纖維細胞行為的影響及其機制的研究報道。

靜電紡絲是一種簡單而有效的納米纖維成型技術(shù)，調(diào)節(jié)靜電紡絲參數(shù)可以制備具有不同直徑和結(jié)構(gòu)的纖維支架[2,19]。本研究采用靜電紡絲技術(shù)結(jié)合溶液孵育結(jié)晶法制備表面光滑和不同片晶密度的微/納復(fù)合串晶結(jié)構(gòu)纖維支架，根據(jù)纖維支架理化性能表征結(jié)果及體外細胞試驗結(jié)果，分析拓撲結(jié)構(gòu)對成纖維細胞增殖、表型以及成纖維細胞分化和基質(zhì)合成基因表達的影響，以期了解串晶結(jié)構(gòu)纖維支架在成纖維細胞分化中的作用及其作為傷口修復(fù)和基質(zhì)再生支架的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PCL(Mw=8 000 g/mol)，三氯甲烷(CF)、N-N二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸戊酯，Sigma試劑有限公司；六孔板，F(xiàn)lexcell公司；人皮膚成纖維細胞(HFF-1)，中國科學(xué)院上海細胞庫；高糖培養(yǎng)基(不含谷氨酰胺)、胎牛血清(FBS)、Trizol細胞裂解液，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；活/死染料，上海凱基生物技術(shù)股份有限公司；細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8試劑盒)，上海翊圣生物科技有限公司；EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，北京全式金生物公司。

1.2 不同拓撲結(jié)構(gòu)纖維膜的制備

將質(zhì)量分數(shù)為12%的PCL溶入CF和DMF的混合溶劑(VCF∶VDMF=9∶1)中，磁力攪拌至少16 h形成均一穩(wěn)定的紡絲液進行靜電紡絲。靜電紡絲參數(shù)：針頭23 G，正電壓20 kV，負電壓1.5 kV，接收距離18 cm，推注速率1 mL/h，溫度23～27 ℃，相對濕度40%～50%。紡絲完成后將纖維膜放在37 ℃的真空烘箱中干燥24 h，記PCL質(zhì)量分數(shù)為12%的光滑纖維膜為P12。在此基礎(chǔ)上采用溶液孵育結(jié)晶方法獲得具有不同片晶密度的串晶結(jié)構(gòu)纖維膜。具體步驟：稱取不同質(zhì)量的PCL溶于乙酸戊酯中，制得質(zhì)量分數(shù)為0.5%和1.0%的PCL結(jié)晶稀溶液，在60 ℃下加熱3 h使PCL完全溶解，冷卻至室溫后將5 cm×5 cm的纖維膜分別浸泡在0.5%和1.0%稀溶液中15 min，分別記成型的串晶結(jié)構(gòu)纖維膜為P12-SK1和P12-SK2。

1.3 理化性能測試與表征

1.3.1 微觀形貌

通過場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM，Hitachi SU8010型，日本)觀察不同拓撲結(jié)構(gòu)纖維膜的微觀形貌，并采用Image J軟件測試纖維直徑，每種纖維膜樣品選取100根纖維。

1.3.2 表面粗糙度

研究[14]表明納米級表面粗糙度會對細胞的黏附產(chǎn)生影響，而黏附是貼壁細胞在基質(zhì)上存活、生長和增殖的前提，因此納米級粗糙度對細胞增殖和分化等活動有著重要影響。采用原子力顯微鏡(Keysight 5500 AFM-SPM型，美國)分析樣品的表面粗糙度，掃描面積為25 μm×25 μm。

1.3.3 水接觸角和結(jié)晶度

采用OCA15EC型接觸角儀(Dataphysics型，德國)測量樣品的水接觸角(WCA)以評估纖維膜的表面親水性。滴加2 μL PBS液滴接觸纖維膜10 s后拍照，每個樣品測量5次，結(jié)果取平均值。采用X射線衍射儀(XRD，D/Max-2550 PC Rigaku型，日本)測試并計算纖維膜的結(jié)晶度。

1.3.4 力學(xué)性能

纖維支架的力學(xué)性能受單絲力學(xué)性能和纖維堆積密度的綜合影響[20]，而支架的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)特性在控制細胞增殖和遷移方面起著重要作用[21]。為探究支架的力學(xué)性能在調(diào)控細胞行為方面的作用，采用動態(tài)機械分析儀(TA Q800型，美國)測定樣品的力學(xué)性能。樣品在37 ℃下平衡3 min后以1 N/min速率拉伸至樣品斷裂。按照式(1)計算斷裂強度，選取應(yīng)力-應(yīng)變曲線的線性部分按照式(2)計算彈性模量。

σ=F/S

(1)

式中：σ為斷裂強度，MPa；F為斷裂強力，N；S為試樣橫截面積，mm2。

E=σ/ε

(2)

式中：E為彈性模量，MPa；ε為試樣應(yīng)變。

1.4 體外細胞行為表征

1.4.1 細胞毒性

HFF-1細胞用于探索不同纖維膜的細胞活力。將HFF-1細胞(4×104mL-1)種植在滅菌后的纖維膜樣品上培養(yǎng)1 d，無樣品組作為空白對照，對活/死細胞進行染色，采用Nikon Ti-s型生物倒置熒光顯微鏡拍照。

1.4.2 細胞增殖

將滅菌后的樣品和細胞(12×104mL-1)在6孔板中預(yù)培養(yǎng)72 h，隨后再培養(yǎng)1和3 d進行細胞增殖測試，每48 h更換培養(yǎng)基，采用CCK-8法進行細胞增殖測定，讀取450 nm處的吸光度。

1.4.3 細胞形態(tài)

細胞表型作為細胞-材料相互作用的指標之一，基質(zhì)的拓撲結(jié)構(gòu)可以對細胞的鋪展產(chǎn)生顯著影響。將滅菌后的樣品和細胞在6孔板中預(yù)培養(yǎng)72 h，再繼續(xù)培養(yǎng)3 d，固定細胞后，配制12個梯度(10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，75%，80%，90%，95%，100%)的乙醇溶液對細胞進行脫水處理。干燥后鍍金處理，采用場發(fā)射掃描電鏡觀測細胞形態(tài)。

1.4.4 基因表達

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)/Smad信號通路是調(diào)節(jié)成纖維細胞向肌成纖維細胞分化以及膠原形成的經(jīng)典通路，是誘導(dǎo)成纖維細胞分化最有效的細胞因子[22-23]。成纖維細胞具有力學(xué)敏感性和收縮性，在力學(xué)刺激下，成纖維細胞分泌TGF-β1到ECM中誘導(dǎo)膠原合成和成熟并參與α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的合成，α-SMA具有強大收縮力，可以促進傷口收縮和組織再生[24-25]。但在傷口愈合后期，過量的基質(zhì)蛋白會導(dǎo)致組織變硬，產(chǎn)生瘢痕。瘢痕組織分為兩種：增生性瘢痕組織主要是Ⅲ型膠原蛋白(COL Ⅲ)升高，瘢痕疙瘩則是I型膠原蛋白(COL I)和COL Ⅲ過度紊亂[26]。研究[2,27]表明，ECM的拓撲結(jié)構(gòu)在成纖維細胞的表型、分化，以及膠原蛋白和TGF-β1的合成和分泌等方面有著重要作用。因此，為探究串晶結(jié)構(gòu)對成纖維細胞行為的影響，使用qPCR(quantitative polymerase chain reaction)檢測誘導(dǎo)成纖維細胞分化和參與基質(zhì)合成膠原的基因表達。

使用Trizol試劑分離總RNA。采用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成第一鏈cDNA(反轉(zhuǎn)錄)。所測基因及其相應(yīng)合成引物的詳細信息見表1。再采用QuantStudioTM3型Real-Time PCR儀進行擴增，最后對所得qPCR數(shù)據(jù)中的Ct值進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用2-ΔΔCt相對定量分析方法進行處理：將各試驗組基因的Ct值與相應(yīng)β-肌動蛋白(β-actin)的Ct值相減，記所得相對值為ΔCt，再將此ΔCt值與所選對照(P12)的ΔCt相對值相減，所得相對值記為ΔΔCt，最后求得2-ΔΔCt即為相對RNA水平。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative polymerase chain reaction

1.5 統(tǒng)計分析

定量數(shù)據(jù)以平均值±標準差形式表示，組間統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(ANOVA)。統(tǒng)計結(jié)果的顯著性水平：***表示p<0.001；**表示p<0.01；*表示p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌分析

不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架SEM圖如圖1所示。由圖1(a)可知，成功制備了直徑均勻且無串珠的光滑纖維，且隨著稀溶液中PCL質(zhì)量分數(shù)的增加，串晶結(jié)構(gòu)纖維直徑逐漸增大，分別為P12 (1.33±0.15) μm、P12-SK1 (1.82±0.17) μm、P12-SK2 (2.30±0.26) μm。PCL分子從溶液中析出并附著在纖維表面，在原有纖維上外延生成納米結(jié)晶結(jié)構(gòu)，隨著PCL質(zhì)量分數(shù)的增加，稀溶液中的PCL分子與纖維接觸位點增多，導(dǎo)致纖維表面結(jié)構(gòu)結(jié)晶密度增大，但由于幾何尺寸限制，片晶取向隨著纖維直徑的增大而降低[28-31]。

圖1 不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架SEM圖Fig.1 SEM images of fiber scaffolds with different surface topologies

2.2 粗糙度

圖2為不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架的原子力圖。纖維支架表面粗糙度隨稀溶液中PCL質(zhì)量分數(shù)增加從(0.71±0.13) μm增加到(0.85±0.10) μm和(1.04±0.15) μm。這是因為隨著PCL質(zhì)量分數(shù)的增加，溶液中有更多準備結(jié)晶的PCL鏈聚集在纖維周圍，使得PCL鏈接觸到纖維的可能性增加，致使纖維支架表面粗糙度增大[16]。

圖2 不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架的AFM 3D視圖Fig.2 AFM 3D views of fiber scaffolds with different surface topologies

2.3 結(jié)晶度和接觸角

通過XRD測試了不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架的結(jié)晶度，試驗結(jié)果顯示，隨著稀溶液中PCL質(zhì)量分數(shù)的增加，結(jié)晶度從(30.82±16.10)%增加到(38.43±3.73)%和(45.97±2.90)%。這是由于稀溶液中PCL鏈含量增加導(dǎo)致纖維支架的結(jié)晶度隨聚合物中己內(nèi)酯含量的增加而增加[28]。

聚合物支架的表面特性是控制細胞反應(yīng)的關(guān)鍵因素，接觸角決定支架的表面潤濕性，進而影響?zhàn)B分擴散、蛋白質(zhì)滲透以及細胞和基質(zhì)之間的黏附[21,28,32]，因此采用接觸角探究支架的表面潤濕性。隨著稀溶液中PCL質(zhì)量分數(shù)的增加，P12-SK1和P12-SK2接觸角分別從P12(132.18±1.68)°降低為(128.25±2.49)°和(126.54±0.93)°，這可能是因為串晶結(jié)構(gòu)使纖維間距增加導(dǎo)致水滴更容易滲透，從而顯示出較小的水接觸角[30]。但由于所有支架都是疏水的，且變化較小，因此更有意義的是探究表面拓撲結(jié)構(gòu)對細胞行為的影響。

2.4 力學(xué)性能

不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架的力學(xué)性能如圖3所示。由圖3可知，與光滑纖維相比，串晶結(jié)構(gòu)纖維可以提高材料的彈性模量和斷裂強度，彈性模量從(2.66±0.13) MPa增加到(4.38±0.53)和(9.24±1.20) MPa，斷裂強度從(1.23±0.12) MPa增加到(1.43±0.09)和(2.17±0.22) MPa。P12-SK2彈性模量和斷裂強度增加顯著,這是因為片晶尺寸過大，造成纖維之間機械互鎖，導(dǎo)致強力過度增加。研究[33]證明串晶結(jié)構(gòu)可提高纖維膜整體的力學(xué)性能。與P12相比，P12-SK1和P12-SK2斷裂伸長率雖然有所下降，但不存在顯著性差異。

圖3 不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架的力學(xué)性能Fig.3 Mechanical properties of fiber scaffolds with different surface topologies

2.5 細胞毒性

對支架進行活/死細胞染色，結(jié)果如圖4所示，其中活細胞顯示綠色熒光。培養(yǎng)1 d后，3個試驗組支架上的細胞與圖4(d)空白對照組無差異，細胞生長狀態(tài)良好，表明PCL光滑纖維以及串晶結(jié)構(gòu)纖維支架的生物相容性好，為細胞提供了良好的生存環(huán)境。

圖4 在不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架上培養(yǎng)的HFF-1 細胞活/死染色熒光圖Fig.4 Fluorescence images of HFF-1 live/dead cells cultured on fiber scaffolds with different surface topologies

2.6 細胞增殖

在不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維膜上預(yù)培養(yǎng)72 h后再培養(yǎng)1、3 d的HFF-1細胞增殖情況如圖5所示。由圖5可知：所有支架的吸光度均隨時間增加而增加，表明光滑和串晶結(jié)構(gòu)纖維具有良好的生物相容性，均支持HFF-1細胞生長。但P12上的成纖維細胞呈現(xiàn)過度增殖趨勢，其1、3 d的吸光度分別是空白對照組的1.63和1.54倍。研究[25]表明成纖維細胞的持續(xù)激活會增強細胞增殖，促使ECM過度沉積，導(dǎo)致組織纖維化和瘢痕形成。因此，串晶結(jié)構(gòu)對成纖維細胞的過度增殖有抑制作用，在抑制纖維化領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用。

圖5 不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架上的HFF-1細胞增殖情況Fig.5 Proliferation of HFF-1 cells on fiber scaffolds with different surface topologies

2.7 細胞形態(tài)

改變ECM表面拓撲結(jié)構(gòu)是一種成熟的控制細胞表型的方法。圖6為HFF-1細胞在不同表面拓撲結(jié)構(gòu)上的表面形態(tài)。由圖6可知，細胞在纖維基質(zhì)上鋪展面積大且分泌較多的ECM，尤其是微/納復(fù)合的P12-SK1，細胞鋪展良好。而P12-SK2上的細胞收縮，鋪展面積小，可能是因為纖維膜片晶密度過大，類似2 D致密的表面結(jié)構(gòu)抑制了整合素的表達，從而抑制了細胞的鋪展[25]。

圖6 不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架的HFF-1細胞形態(tài)Fig.6 Morphology of HFF-1 cells on fiber scaffolds with different surface topologies

2.8 基因表達

圖7為HFF-1細胞在不同表面拓撲結(jié)構(gòu)上的纖維化基因和基質(zhì)重塑基因表達。由圖7可知，隨著培養(yǎng)時間的增加，基質(zhì)中的基因表達均有所增加，表明拓撲結(jié)構(gòu)可以觸發(fā)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)化，將物理信號轉(zhuǎn)化為影響細胞基因/蛋白表達的生化信號。細胞可以通過整合素傳導(dǎo)ECM物理信號，進而調(diào)節(jié)細胞行為。研究[34-35]表明，ECM拓撲結(jié)構(gòu)和剛度變化可以改變ECM與整合素的結(jié)合，進而影響潛在TGF-β1的激活。相比P12-SK1和P12-SK2，P12具有較高的TGF-β1、α-SMA和COL Ⅲ表達，其α-SMA的表達量是P12-SK1和P12-SK2的2倍、COL Ⅲ分別是P12-SK1和P12-SK2的3.76和6.14倍，增加了成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化和增生性瘢痕組織形成的可能。雖然微/納復(fù)合的P12-SK1和P12-SK2較P12具有較低的TGF-β1、α-SMA表達，可以減少成纖維細胞的分化和瘢痕組織形成，但P12-SK2因細胞鋪展面積小且所有基因的表達量均低，具有延遲的傷口愈合效果，尤其是作為ECM主要成分的COL I表達較少，約為P12-SK1的20%，無法滿足結(jié)締組織的承重要求[25]。而具有適當納米片晶密度的P12-SK1可以產(chǎn)生類似于新生兒傷口的愈合過程，在早期產(chǎn)生較多的COL Ⅲ，在后期具有適當?shù)腃OL I/COL Ⅲ比例(3∶1)，可有效促進傷口愈合，加強結(jié)締組織承重能力，減少瘢痕組織[36-37]。以上結(jié)果均表明纖維拓撲結(jié)構(gòu)可以影響成纖維細胞的基因表達和表型變化。

圖7 不同表面拓撲結(jié)構(gòu)纖維支架上的HFF-1基因表達Fig.7 HFF-1 gene expression on fiber scaffolds with different surface topologies

3 結(jié) 語

采用靜電紡絲和溶液孵育結(jié)晶法制備具有不同納米纖維密度的串晶結(jié)構(gòu)纖維膜。通過對纖維膜進行理化性能和體外細胞試驗表征發(fā)現(xiàn)，與P12相比，微/納復(fù)合的P12-SK1和P12-SK2纖維，可以增加纖維膜的力學(xué)性能和粗糙度，影響細胞外基質(zhì)與細胞的接觸位點，可調(diào)節(jié)細胞形態(tài)、基質(zhì)合成(COL I、COL Ⅲ)和肌成纖維細胞激活標志基因(TGF-β1、α-SMA)的表達，對傷口愈合和減少瘢痕具有較好的效果。但P12-SK2較P12-SK1具有更大的片晶密度、更小的細胞鋪展面積和更少的COL I、COL Ⅲ表達，最終會導(dǎo)致修復(fù)效果不良。綜上，低密度微/納復(fù)合纖維膜P12-SK1不僅具有優(yōu)異的理化和生物相容性，還可以加快組織修復(fù)，減少瘢痕，在組織愈合中具有一定的應(yīng)用潛力。