基于低溫沉積打印技術(shù)構(gòu)建分級(jí)多孔脫細(xì)胞華通膠支架

殷瀚，吳江，嚴(yán)子能，田廣招，張鐵元，馬陽(yáng)，王越，眭翔，劉舒云，郭全義

由于不含血管、神經(jīng)和淋巴，因此關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)能力極其有限，這也成為了臨床科學(xué)研究和再生醫(yī)學(xué)中的主要挑戰(zhàn)[1-2]。目前，臨床上對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨損傷患者的治療方法主要包括自體骨軟骨移植、同種異體骨軟骨移植、自體軟骨細(xì)胞移植、合成或生物支架植入（組織工程技術(shù)）、微骨折、粉碎軟骨修復(fù)、生物制劑輔助治療以及其他治療。其中近些年發(fā)展起來(lái)的組織工程技術(shù)為關(guān)節(jié)軟骨損傷的再生修復(fù)提供了新的可能。支架、種子細(xì)胞和生長(zhǎng)因子是組織工程技術(shù)的三大要素。理想的支架材料是組織工程發(fā)展的重點(diǎn)[3]。

天然生物材料由于具有優(yōu)良的生物相容性，細(xì)胞毒性低，因此一直備受關(guān)注。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)源性的支架，其成分和比例與天然的關(guān)節(jié)軟骨相近。但因其來(lái)源有限、結(jié)構(gòu)致密和脫細(xì)胞處理困難，因此限制了其作為組織工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與臨床應(yīng)用。

人臍帶是連接母體和胎兒的組織，在胎兒分娩后即作為廢棄物被丟棄掉。華通膠是臍帶的主要組成成分，其富含透明質(zhì)酸、硫酸化糖胺多糖及膠原等成分，這些成分和天然軟骨的成分相似，并且華通膠無(wú)血管、神經(jīng)支配和淋巴[4-10]。同時(shí)，華通膠能夠保護(hù)臍帶的血管，防止臍帶血管受外力擠壓，避免臍帶缺血。華通膠的此功能與關(guān)節(jié)軟骨緩沖外力，減少變形、損傷和摩擦的作用相似。同時(shí)其屬于醫(yī)療廢棄物，來(lái)源廣泛，不存在倫理問(wèn)題?；谝陨先A通膠的生物學(xué)特征，其被認(rèn)為是軟骨組織工程支架材料的理想來(lái)源[11-13]。近年來(lái)，3D 生物打印作為新興的技術(shù)，能夠精確地制造出具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的支架[14]。低溫沉積打印技術(shù)作為 3D 生物打印技術(shù)的一種類型，具有能夠打印出分級(jí)多孔支架的功能。

為了更好地控制生物墨水的可打印濃度，制備出理想形狀的支架，本實(shí)驗(yàn)前期將人臍帶華通膠脫細(xì)胞處理，隨后進(jìn)行冷凍干燥，之后利用低溫沉積3D 生物打印技術(shù)，制造出分級(jí)多孔的脫細(xì)胞華通膠細(xì)胞外基質(zhì)支架，系統(tǒng)評(píng)價(jià)該支架的物理化學(xué)特性、生物相容性和對(duì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響，為體內(nèi)軟骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人臍帶 正常足月妊娠新生兒臍帶由解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，已獲得知情同意。SD 大鼠乳鼠 5 只，重 12～18 g，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010；實(shí)驗(yàn)方案由中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、試劑及儀器 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由解放軍總醫(yī)院骨科研究所提供；DMEM/F-12 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；0.25% 胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；Actin 微絲綠色熒光探針購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甲苯胺藍(lán)染色試劑盒、苦味酸-天狼猩紅染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蘇木精-伊紅染色（HE）液購(gòu)自北京瀚海拓新生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abmole 公司；多聚甲醛購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉（NaOH）和冰醋酸購(gòu)自天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；引物購(gòu)自上海生工生物公司；OriCell 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒購(gòu)自賽業(yè)公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix 購(gòu)自德國(guó) Toyobo 公司。

2 × 預(yù)混實(shí)時(shí)熒光定量快速 PCR 反應(yīng)體系為加拿大 GenStar 公司產(chǎn)品；Sunp biomaker 生物打印機(jī)為上普博源生物科技有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)為北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱為德國(guó) Hereus 公司產(chǎn)品；脫水機(jī)為德國(guó) Leica公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；掃描電子顯微鏡為日本 Hitachi 公司產(chǎn)品；Take 3酶標(biāo)儀為美國(guó) BioTek 公司產(chǎn)品；激光共聚焦顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人臍帶華通膠的組織學(xué)染色 人臍帶華通膠經(jīng)脫水、石蠟包埋后行石蠟切片（厚度約 7 μm），切片脫蠟后，4% 多聚甲醛固定 30 min，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)行 HE 染色、甲苯胺藍(lán)染色、番紅-O 染色、天狼猩紅染色。

1.2.2 脫細(xì)胞人臍帶華通膠的制備 無(wú)菌條件下，去除臍帶內(nèi)的動(dòng)靜脈，剝除臍帶外面的膜，可獲取膠凍樣組織。把獲得的華通膠置于 1 mol/L NaOH 溶液中，室溫條件下脫細(xì)胞處理 4 h，冰醋酸調(diào)節(jié) pH 值至 7.0 備用。

1.2.3 人臍帶華通膠脫細(xì)胞前后的比較

1.2.3.1 大體觀和微觀結(jié)構(gòu)：觀察人臍帶華通膠脫細(xì)胞前后大體形態(tài)，然后經(jīng)過(guò)真空噴金處理之后，在掃描電鏡下觀察其微觀形態(tài)并采集照片。

1.2.3.2 細(xì)胞核殘留情況：人臍帶華通膠脫細(xì)胞前后經(jīng)脫水、石蠟包埋后行石蠟切片（厚度約7 μm），切片脫蠟后，4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 清洗 1 次后行 DAPI 染色，PBS 清洗 2 次，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞核殘留情況。

1.2.4 脫細(xì)胞人臍帶華通膠生物墨水的制備 將制備的脫細(xì)胞人臍帶華通膠放到培養(yǎng)皿中，-20 ℃預(yù)凍 30 min，放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，48 h 后得到冷凍干燥后的脫細(xì)胞華通膠，用粉碎機(jī)將其打成粉末。取一定質(zhì)量的上述粉末，溶解于 1% 的乙酸中，制備出 5%（m/V）的脫細(xì)胞華通膠溶液。

1.2.5 低溫沉積 3D 生物打印脫細(xì)胞華通膠支架的制備 將脫細(xì)胞華通膠溶液轉(zhuǎn)移到打印機(jī)的噴頭內(nèi)并且保持大約 4 ℃。底部接收盤(pán)的溫度為-25～-30 ℃。打印之后，將冷凍的支架進(jìn)行冷凍干燥，從而形成分級(jí)多孔的脫細(xì)胞華通膠支架。將支架置于 258 nm 波長(zhǎng)紫外線照射下交聯(lián) 8 h，再于含 20 mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺和 50 mmol/L乙基-二甲基胺-丙基碳化二亞胺的 95%（V/V）乙醇溶液中 4 ℃ 下交聯(lián) 24 h。無(wú)菌 PBS 漂洗浸泡2 h，三蒸水漂洗去除殘余交聯(lián)劑，再次凍干，密封袋保存，60Co 照射消毒，4 ℃ 條件下保存?zhèn)溆肹15-16]。

1.2.6 低溫沉積 3D 生物打印脫細(xì)胞華通膠支架的大體觀和微觀結(jié)構(gòu) 取打印的脫細(xì)胞華通膠支架，觀察其大體形態(tài)，然后經(jīng)過(guò)真空噴金處理之后，在掃描電鏡下觀察其微觀形態(tài)并采集照片。

1.2.7 鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增 新生 48 h SD 乳鼠 5 只，雌雄不限，無(wú)菌條件下分離股骨和脛骨，無(wú)菌 PBS 清洗 2 遍，剪碎后轉(zhuǎn)移至含體積分?jǐn)?shù) 10% 胎牛血清的 DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸后接種至 25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù) 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合至 80%～90% 以1∶2 比例傳代擴(kuò)增。取第 3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8 低溫沉積打印支架的細(xì)胞毒性檢測(cè) 制備支架浸提液：依據(jù)國(guó)家 ISO10993-12（2019）標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算脫細(xì)胞華通膠支架表面積，按 1.25 cm2/ml 計(jì)算出所需培養(yǎng)液（含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基），將無(wú)菌脫細(xì)胞華通膠支架浸泡于上述培養(yǎng)液中，37 ℃ 孵育 24 h 后收集浸提液。

CCK-8 實(shí)驗(yàn)：將 P4 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按3000 個(gè)/孔接種于 96 孔板中，每孔 100 μl，細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基，分別更換為含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養(yǎng)基（陰性對(duì)照組）和脫細(xì)胞華通膠支架浸提液，體積均為 100 μl。培養(yǎng) 1、4、7 d 后棄去舊培養(yǎng)基，然后每孔加入 110 μl 的含有10 μl CCK-8 試劑和單純 DMEM/F12 培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱（37 ℃，體積分?jǐn)?shù) 5% CO2）中孵育 2 h，最后在 450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。每組重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.2.9 細(xì)胞死/活染色 將 P3 代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于低溫沉積 3D 生物打印脫細(xì)胞華通膠支架上，每個(gè)支架大約接種 5 × 105個(gè)細(xì)胞，置于體積分?jǐn)?shù) 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育 3 d，無(wú)菌PBS 清洗 2 次，避光條件下加入細(xì)胞死/活熒光染液（含 2 μmol/L 鈣黃綠素 AM 和 4 μmol/L 同二聚乙胺-1 避光孵育 10 min，PBS 再次清洗 2 次，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞活性。隨機(jī)選取 5 個(gè)感興趣區(qū)域，計(jì)算細(xì)胞平均存活率，細(xì)胞存活率=活細(xì)胞/（死細(xì)胞+活細(xì)胞）× 100%。

1.2.10 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上的骨架染色 將數(shù)量 3 × 105個(gè) P3 代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于支架上，置于 5% CO2、37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 7 d 后，PBS 洗 1 遍，加入 4% 的多聚甲醛固定 15 min，含 0.1% Triton X-100 的 PBS 清洗 3 遍，加入鬼筆環(huán)肽染料，避光孵育 30 min，PBS清洗 3 遍。加入 DAPI 染液負(fù)染細(xì)胞核 10 min，PBS 清洗3 遍，共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架情況。

1.2.11 qRT-PCR 法檢測(cè)成軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平 將 P3 代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別接種于平板和支架上，加入成軟骨誘導(dǎo)液，成軟骨誘導(dǎo) 14 d 后，收齊兩組的細(xì)胞，用 Trizol 法提取總 RNA。使用 Prime-ScriptTMRT Reagent Kit 將RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。使用 SYBR PreMix EX TAQ 進(jìn)行 qRT-PCR。通過(guò) 2-△△CT方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的 SOX9、ACAN、COLII、COLI 的表達(dá)水平，以 GAPDH 作為內(nèi)參基因。相關(guān)的引物序列見(jiàn)表 1。

表1 qRT-PCR 的引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

1.3 主要觀察指標(biāo)

人臍帶華通膠的組織學(xué)染色；人臍帶華通膠脫細(xì)胞前后大體觀、細(xì)胞核殘留情況、微觀結(jié)構(gòu)；低溫沉積 3D 生物打印脫細(xì)胞華通膠支架大體觀、微觀結(jié)構(gòu)，以及支架的細(xì)胞相容性及對(duì)細(xì)胞黏附的影響；支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，定量數(shù)據(jù)用表示，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)兩組數(shù)據(jù)是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，當(dāng)P＜ 0.05 時(shí)表示組間差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 人臍帶華通膠大體觀察及組織學(xué)染色結(jié)果

圖1A 顯示的是人臍帶和從臍帶中分離的華通膠組織的大體觀，可見(jiàn)臍帶形狀如繩索，表面光滑透明，由一層羊膜包被，內(nèi)含結(jié)締組織、1 根臍靜脈和 2 根臍動(dòng)脈。從臍帶中分離的華通膠呈膠狀形態(tài)，表面透明。圖 1B1 為華通膠 HE 染色，可見(jiàn)華通膠富含細(xì)胞外基質(zhì)成分；圖 1B2、圖 1B4分別為番紅 O 和甲苯胺藍(lán)染色，結(jié)果顯示華通膠含有糖胺多糖；天狼猩紅染色顯示華通膠富含膠原成分（圖 1B3）。天然軟骨含有豐富的糖胺多糖、膠原成分等，以上結(jié)果表明華通膠在成分上與天然軟骨相似。

圖1 人臍帶和華通膠大體觀和組織學(xué)染色（A：人臍帶及華通膠大體形態(tài)；B：蘇木精-伊紅染色、番紅-O 染色、天狼猩紅染色、甲苯胺藍(lán)染色）Figure 1 Gross morphology and histomorphological evaluation of human umbilical cord and Wharton's jelly (A: Gross morphology of human umbilical cord and Wharton's jelly;B: HE staining,safranin-O staining,sirius red staining,toluidine blue staining)

2.2 華通膠脫細(xì)胞前后大體觀比較

如圖 2A 所示，分離出的華通膠組織呈現(xiàn)出白色膠凍狀。經(jīng)脫細(xì)胞處理后，華通膠組織大體形狀基本保持不變，色澤變?yōu)橥该魃?/p>

2.3 華通膠脫細(xì)胞前后 HE 染色及 DAPI 染色結(jié)果

如圖 2B、圖 2C 所示，華通膠脫細(xì)胞前可見(jiàn)大量的細(xì)胞核（藍(lán)色熒光）。經(jīng)過(guò)一系列脫細(xì)胞處理后，未見(jiàn)明顯的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，說(shuō)明脫細(xì)胞方法行之有效。

圖2 人臍帶華通膠脫細(xì)胞前后的大體觀（A）、蘇木精-伊紅（B）及 DAPI 染色（C）比較Figure 2 Comparison of gross view (A)、HE staining (B) and DAPI staining (C) of Wharton's jelly before and after decellularization

2.4 華通膠脫細(xì)胞前后的微觀結(jié)構(gòu)變化

如圖 3A 所示，通過(guò)掃描電鏡觀察華通膠脫細(xì)胞前的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，華通膠富含大量膠原纖維，膠原纖維縱橫交錯(cuò)排列。脫細(xì)胞后膠原纖維依然能夠保持，見(jiàn)圖 3B，說(shuō)明脫細(xì)胞處理并未破壞華通膠內(nèi)部的結(jié)構(gòu)。

圖3 掃描電鏡觀察華通膠脫細(xì)胞前后的微觀結(jié)構(gòu)（A：脫細(xì)胞前；B：脫細(xì)胞后）Figure 3 Microstructure of the Wharton's jelly before (A) and after (B) decellularization by scanning electron microscopy

2.5 低溫沉積 3D 打印支架的大體觀和微觀結(jié)構(gòu)觀察

大體觀可見(jiàn)支架纖維呈現(xiàn)十字交叉網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，纖維排列整齊均勻，如圖 4A 所示。掃描電鏡觀察支架內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，打印的支架表現(xiàn)出分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)，并且具有均勻的大孔結(jié)構(gòu)，同時(shí)觀察到支架內(nèi)存在大量相互連接的微孔結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖 4B、4C所示。

圖4 低溫沉積 3D 打印脫細(xì)胞華通膠支架的大體觀和掃描電鏡觀察（A：大體觀；B：掃描電鏡低倍鏡下支架結(jié)構(gòu)；C：掃描電鏡高倍鏡下支架結(jié)構(gòu)）Figure 4 Gross view and scanning electron microscopy of the 3D-printed scaffold by low-temperature deposition manufactureing(LDM) (A: Gross view;B: Microstructure of the 3D-printed scaffold at low magnify;C: Microstructure of the 3D-printed scaffold at high magnify)

2.6 打印支架的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從支架中提取的浸提液與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng) 1、4、7 d 后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，比較兩組在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)顯著性差異（P＞ 0.05），見(jiàn)圖 5，提示該支架無(wú)明顯細(xì)胞毒性，具有良好的細(xì)胞相容性，為后期植入動(dòng)物體內(nèi)及將來(lái)的臨床應(yīng)用提供了有利的理論支撐。

圖5 低溫沉積 3D 打印支架的細(xì)胞毒性檢測(cè)Figure 5 Cytotoxicity experiment of the 3D-printed scaffold by LDM

2.7 細(xì)胞活/死染色

如圖 6 所示，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上培養(yǎng) 7 d 后，活/死染色結(jié)果顯示，支架上存在大量的活細(xì)胞（圖 6A 綠色熒光），而死細(xì)胞（圖 6B 紅色熒光）的數(shù)量很少，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在支架上很好地存活，活性可達(dá)（96.0 ± 3.3）%，該支架具有良好的生物相容性。

圖6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-低溫沉積技術(shù)打印的脫細(xì)胞華通膠支架復(fù)合物的細(xì)胞活/死染色（A：活細(xì)胞；B：死細(xì)胞；C：合并圖像）Figure 6 Dead/live staining of bone marrow mesenchymal stem cell-scaffold printed by LDM complex (A: Live cells;B: Dead cells;C: Merged image)

2.8 細(xì)胞在支架上的黏附和形態(tài)觀察

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在低溫沉積 3D 打印支架上培養(yǎng) 7 d 后，鬼筆環(huán)肽/DAPI 染色顯示如圖 7，細(xì)胞核被染成藍(lán)色熒光亮點(diǎn)（圖 7A），綠色熒光微絲（圖 7B）顯示的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上的黏附形態(tài)，可見(jiàn)細(xì)胞在支架上很好地鋪展開(kāi)，表明低溫沉積 3D 打印支架有利于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)。

圖7 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-低溫沉積打印脫細(xì)胞華通膠支架復(fù)合物的肌動(dòng)蛋白/DAPI 染色（A：細(xì)胞核 DAPI 染色；B：細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白染色；C：兩種染色的合并圖像）Figure 7 F-actin/DAPI staining of bone marrow mesenchymal stem cell-scaffold complex (A: DAPI staining of nucleus;B: F-actin;C: Merged image)

2.9 支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響

促進(jìn)干細(xì)胞成軟骨分化是軟骨再生中十分重要的因素，因此本實(shí)驗(yàn)探究了支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的影響，并進(jìn)行了成軟骨相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)。如圖 8 所示，與單純?cè)谄桨迳吓囵B(yǎng)相比，細(xì)胞在支架上培養(yǎng) 14 d 后，SOX9、ACAN、COLII 的表達(dá)明顯高于在平板上培養(yǎng)的，而 COLI的表達(dá)無(wú)明顯差異，上述結(jié)果表明，支架能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化及膠原合成分泌。

圖8 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架中體外培養(yǎng) 14 d 的 SOX9（A）、ACAN（B）、COLII（C）、COLI（D）的 mRNA 表達(dá)水平（*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，ns 代表沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）Figure 8 SOX9 (A)、ACAN (B)、COLII (C)、COLI (D) mRNA expression levels of BMSCs seeded on the 3D-printed scaffolds for 14 d (*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01,ns means no significant difference)

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷的再生修復(fù)目前仍是困擾臨床醫(yī)生的難題之一，再生醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展為軟骨損傷再生修復(fù)治療提供了新的可能[17]。近年來(lái)，軟骨組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為軟骨損傷的再生治療提供了新的治療方案。支架材料作為組織工程技術(shù)的三要素之一，其在組織損傷再生修復(fù)治療過(guò)程中扮演著十分重要的角色[18-19]。制備組織工程支架的材料主要分為人工合成材料、天然生物材料。人工合成材料主要有聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乳酸復(fù)合物、聚乳酸、聚羥基丁酸酯及其共聚物等，它們雖然具有良好的物理機(jī)械性能、可控性強(qiáng)、可調(diào)節(jié)的微結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，但其親水性差、對(duì)細(xì)胞吸附力弱以及生物相容性不理想。天然生物材料主要有 I 型膠原、透明質(zhì)酸、纖維蛋白、殼聚糖及海藻酸鹽等，它們具有良好的生物相容性、易于細(xì)胞附著，但其成分與天然的關(guān)節(jié)軟骨有較大差別。近年來(lái)，同種異體軟骨脫細(xì)胞外基質(zhì)支架被認(rèn)為是理想的組織工程支架材料[20]，但其來(lái)源有限，限制了其臨床的推廣應(yīng)用。

人臍帶華通膠在成分上與軟骨十分相似，都富含糖胺多糖、膠原等，同時(shí)華通膠還含有許多生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β、胰島素生長(zhǎng)因子等，并且其來(lái)源廣泛，不用考慮倫理問(wèn)題。本研究通過(guò)組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，華通膠富含糖胺多糖、膠原及透明質(zhì)酸，這與軟骨組織成分相似。用化學(xué)試劑、凍干等方法制備脫細(xì)胞的華通膠支架，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法去除了大多數(shù)的細(xì)胞核 DNA，掃描電鏡證實(shí)了脫細(xì)胞的華通膠依然保留了大量的膠原成分。

理想的組織工程支架應(yīng)該具有能夠影響細(xì)胞生物學(xué)行為的合適孔徑大小和高的孔隙率[21]。3D生物打印技術(shù)能夠精確地制造出具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的支架[14]。然而，目前具有良好生物相容性的 3D 打印合成材料相對(duì)有限。常見(jiàn)的打印材料，如聚乳酸、聚乳酸-共乙醇酸和聚己內(nèi)酯，通常需要高打印溫度或有機(jī)溶劑。高溫加工會(huì)破壞材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致機(jī)械性能下降。此外，由于擔(dān)心最終產(chǎn)品中的溶劑殘留，有毒有機(jī)溶劑的引入可能阻礙進(jìn)一步的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，分級(jí)多孔的支架能夠有利于營(yíng)養(yǎng)交換、細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)和進(jìn)一步促進(jìn)骨的快速生長(zhǎng)和修復(fù)[22]。傳統(tǒng)的 3D 打印技術(shù)（如熔融沉積）很難打印出具有分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)的支架[23-24]。然而，低溫沉積技術(shù)能夠克服傳統(tǒng) 3D 打印技術(shù)的劣勢(shì)，其能夠制造出上述結(jié)構(gòu)的支架。同時(shí)，對(duì)于天然生物材料而言，低溫能夠很好地保存其內(nèi)部的成分。本研究通過(guò)將凍干的華通膠支架打成粉末，之后溶于乙酸中，成功制備出具有可打印性的生物墨水，結(jié)合低溫沉積打印技術(shù)打印脫細(xì)胞華通膠支架，通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞華通膠支架內(nèi)部呈現(xiàn)分級(jí)多孔的結(jié)構(gòu)，孔與孔之間相互緊密結(jié)合，孔的大小有利于細(xì)胞的遷移和黏附，這與文獻(xiàn)[16]結(jié)論是一致的。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估了通過(guò)低溫沉積技術(shù)打印的脫細(xì)胞華通膠支架的生物相容性，體外 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該支架是無(wú)毒的，細(xì)胞活/死染色發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)胞存活，表明打印的支架具有良好的生物相容性，能夠維持細(xì)胞的活性以及利于細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞骨架染色顯示細(xì)胞能夠很好地在支架上伸展開(kāi)，分布在支架的孔與孔之間，表明支架有利于細(xì)胞的黏附。同時(shí)，支架能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化及膠原的合成分泌。

綜上所述，通過(guò)低溫沉積打印技術(shù)制造出的分級(jí)多孔脫細(xì)胞華通膠支架無(wú)細(xì)胞毒性，有利于細(xì)胞的黏附，并且能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化及膠原合成分泌。同時(shí)，相比于其他類型的材料，臍帶來(lái)源廣泛，獲取簡(jiǎn)單，表明臍帶華通膠是制備軟骨組織工程支架的理想材料，是一種有廣泛應(yīng)用前景的天然生物材料。但仍需進(jìn)一步探討比較其和同類型打印支架的優(yōu)勢(shì)以及體內(nèi)原位軟骨缺損修復(fù)的效果，完善軟骨再生修復(fù)的理論。