皮膚黑色素瘤的腫瘤免疫微環(huán)境研究

齊云峰，王雨琦，李銘新，徐振東，董成成，蘇 建，張金玲，王 鵬

(1.吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000；2.吉林師范大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

0 引言

皮膚黑色素瘤(SKCM)具有高度的侵襲性、耐藥性和異質(zhì)性[1].目前，手術(shù)切除仍是治療原發(fā)性黑色素瘤的首選方法[2].此外新型的免疫治療策略也取得了成功并提高了患者的生存率，如使用細(xì)胞抗毒性T細(xì)胞抗原4(CTLA-4)[3]、抗程序性死亡受體1(PD-1)[4]、惡性黑色素瘤相關(guān)性抗原A3(MAGE-A3)[5]的免疫治療.接受免疫治療的大部分患者有良好預(yù)后，但由于腫瘤微環(huán)境(TME)與腫瘤細(xì)胞之間相互作用的復(fù)雜性，仍有一些病人會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，如自身免疫反應(yīng)[6].利用表達(dá)譜數(shù)據(jù)估計(jì)惡性腫瘤組織中基質(zhì)和免疫細(xì)胞(Estimation of Stromal and Immune cells in Malignant Tumor tissues using Expression data，ESTIMATE)算法可以預(yù)測(cè)腫瘤純度以及腫瘤組織中浸潤的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的占比[7].通過評(píng)估黑色素瘤中免疫打分和基質(zhì)打分來描述免疫和基質(zhì)細(xì)胞的比例.腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境情況影響免疫細(xì)胞的含量，而微環(huán)境驗(yàn)證過程中腫瘤和免疫過程密不可分[8].當(dāng)腫瘤有較低的免疫細(xì)胞浸潤時(shí)，低CD8+CTLs會(huì)使腫瘤對(duì)治療產(chǎn)生耐藥性[9].相比之下，隨著免疫細(xì)胞浸潤的增加，腫瘤對(duì)免疫療法的敏感性增加[10].腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都會(huì)爭奪其中的物質(zhì)資源，以確保自身發(fā)展.由于高代謝，腫瘤細(xì)胞將產(chǎn)生高酸性、缺氧和富含免疫抑制代謝物的腫瘤微環(huán)境，挑戰(zhàn)免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用[11].因此，有利于免疫細(xì)胞浸潤并延長抗腫瘤T細(xì)胞壽命的綜合免疫療法，可能會(huì)明顯提高治療療效[12].目前的研究表明，主要的抗腫瘤效應(yīng)免疫細(xì)胞如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫活動(dòng)中起主要的作用[13].在皮膚黑色素瘤中，腫瘤微環(huán)境會(huì)利用腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞維持免疫抑制作用，其中主要是淋巴細(xì)胞[14].分析免疫細(xì)胞及差異蛋白的互作關(guān)系可以為黑色素瘤的新治療靶點(diǎn)和治療方法提供創(chuàng)新見解[15].

本研究使用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(TCGA)和基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(GTEx)中皮膚黑色素瘤(SKCM)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和患者的臨床數(shù)據(jù)，并對(duì)樣本分別進(jìn)行免疫、基質(zhì)和綜合打分，探究腫瘤免疫微環(huán)境和皮膚黑色素瘤的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

RNA-Seq，臨床數(shù)據(jù)來源于癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov)，正常皮膚數(shù)據(jù)來源于基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(The Genotype-Tissue Expression，GTEx，http：//genome.ucsc.edu/)，探針數(shù)據(jù)來源于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).共從TCGA下載472個(gè)樣品，從GTEx下載812個(gè)樣品，共計(jì)腫瘤樣品471個(gè)，正常樣品813個(gè).樣品預(yù)處理均使用R語言(4.1.3版本)，并剔除臨床信息不全樣品.

1.2 腫瘤微環(huán)境打分

使用到ESTIMATE程序分析皮膚黑色素瘤中免疫細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞浸潤水平，分析的數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫.計(jì)算皮膚黑色素瘤中的基質(zhì)細(xì)胞打分、免疫細(xì)胞打分和綜合打分.

1.3 網(wǎng)絡(luò)互作和富集分析

使用STRING網(wǎng)站(11.5版本，https：//cn.string-db.org/)計(jì)算交集基因的節(jié)點(diǎn)大小，最低要求互作分?jǐn)?shù)大于0.700(High confidence).使用Cytoscape(3.9.1版本)繪出蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖.使用GSEA軟件(4.2.3版本)分別對(duì)高低兩組的前10個(gè)通路做富集合圖.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用線性回歸模型(GLMM)比較正常樣品與腫瘤樣品之間基因表達(dá)差異，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)得到了預(yù)后相關(guān)的核心基因，并用箱線圖來展示核心基因在正常和腫瘤樣品的差異表達(dá)情況.基因表達(dá)與患者生存率之間的關(guān)系使用單因素Cox分析、多因素Cox分析與Log-rank檢驗(yàn)方法.腫瘤微環(huán)境相關(guān)性、免疫細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞打分使用Spearman或Pearson相關(guān)性分析.文章中所有的分析使用R語言(4.1.3版本)完成，并且使用到了Ggplot2、Limma、Survival、Pheatmap、VennDiagram、Enrichplot等R包繪制文章圖片.

2 結(jié)果與討論

2.1 生存曲線

通過將腫瘤微環(huán)境的打分分?jǐn)?shù)和對(duì)應(yīng)樣品的生存時(shí)間、生存狀態(tài)進(jìn)行合并，繪制三種不同打分的生存曲線圖.圖1(A)的生存曲線展示了隨著時(shí)間的推移病人的生存率逐漸下降.并且根據(jù)免疫細(xì)胞的打分將病人樣品分成高低打分兩組之后，通過計(jì)算生存率得出高低兩組的生存率具有顯著差異(P<0.001)的結(jié)論.這說明皮膚黑色素瘤中免疫細(xì)胞的含量和生存率相關(guān).其次在圖1(B)的生存曲線展示了高低分兩組的生存率是有差異的(P<0.05).這說明皮膚黑色素瘤中基質(zhì)細(xì)胞打分和生存率相關(guān).圖1(C)的生存曲線說明免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的綜合打分和病人的生存率相關(guān)(P<0.05).

圖1 基于ESTIMATE算法的免疫細(xì)胞打分(A)、基質(zhì)細(xì)胞打分(B)、免疫和基質(zhì)細(xì)胞綜合打分(C)的生存曲線

為方便分析這些差異基因之間的蛋白互作關(guān)系，得到蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖.圖2(A)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表基因或蛋白質(zhì).圖2(B)展示了這些基因連接的基因節(jié)點(diǎn)數(shù)，基因節(jié)點(diǎn)數(shù)越大，代表此基因連接的基因就越多，同時(shí)說明這個(gè)基因越重要.圖中顯示出來的基因則是網(wǎng)絡(luò)核心基因的備選基因.最后發(fā)現(xiàn)IL2RA與CD247、CD28、CD3G、CD69、CD8B、IFNG、IL7R、LCK和PTPN22之間互相關(guān)聯(lián).

圖2 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖(A)和網(wǎng)絡(luò)核心基因(B)

經(jīng)過Cox回歸分析，得到預(yù)后相關(guān)的基因(P<0.05)，及其相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)比(Hazard Ratio，HR)值.通過蛋白網(wǎng)絡(luò)互作得到的核心基因和Cox回歸分析得到的預(yù)后基因之間的交集，最終結(jié)果是IL2RA基因.接下來對(duì)IL2RA基因進(jìn)行單基因分析，通過圖3(A)和(B)看出IL2RA基因在腫瘤樣品和正常樣品是具有顯著差異的(P<0.001)，同時(shí)也能看出IL2RA基因在腫瘤組顯著上調(diào).說明IL2RA基因在腫瘤樣品中高表達(dá).然后對(duì)IL2RA基因進(jìn)行生存分析，根據(jù)目標(biāo)基因的表達(dá)量，將病人樣品分成高表達(dá)組和低表達(dá)組，觀察IL2RA基因圖3(C)的生存曲線，說明IL2RA基因和預(yù)后相關(guān)(P<0.05).

IL2RA基因在腫瘤發(fā)生過程中的免疫相關(guān)信號(hào)(Immunologic signatures)根據(jù)表達(dá)情況分成高低表達(dá)兩組.分別取富集最顯著的前10個(gè)(|log2FC|>0.5、P<0.05)做多信號(hào)富集分析圖.圖4(A)中表示基因的表達(dá)越高，這些免疫信號(hào)越活躍，即兩者之間是正相關(guān)的.圖4(B)中表示基因的表達(dá)越高，這些免疫信號(hào)越不活躍，即兩者之間是負(fù)相關(guān).

圖3 單基因差異分析(A)，配對(duì)差異基因(B)和生存分析(C)

續(xù)圖3

圖4 正相關(guān)免疫信號(hào)的多GSEA富集圖(A)和負(fù)相關(guān)免疫信號(hào)的多GSEA富集圖(B)

計(jì)算每個(gè)樣品中免疫細(xì)胞的相對(duì)含量之后，在免疫細(xì)胞柱狀體里體現(xiàn)出含量比.圖5(A)中橫坐標(biāo)是樣品名字，縱坐標(biāo)是免疫細(xì)胞的相對(duì)含量，可以直觀地觀察到每種免疫細(xì)胞含量在各個(gè)樣本中的比例.根據(jù)目標(biāo)基因的表達(dá)量，將病人樣品分成高低表達(dá)兩組，比較免疫細(xì)胞在高低兩組的差異情況.圖5(B)的小提琴圖展示了各個(gè)免疫細(xì)胞在高低兩組的表達(dá)量以及在兩組之間的差異情況.其中，γδT細(xì)胞(T cells gamma delta)、靜止NK細(xì)胞(NK cells resting)、活躍NK細(xì)胞(NK cells activated)和靜止肥大細(xì)胞(Mast cells resting)在高低表達(dá)兩組有差異(P<0.05).漿細(xì)胞(Plasma cells)、CD8 T細(xì)胞(T cells CD8)、活躍CD4 T記憶細(xì)胞(T cells CD4 memory activated)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、單核細(xì)胞(Monocytes)、M0期巨噬細(xì)胞(Macrophages M0)和M2期巨噬細(xì)胞(Macrophages M2)在高低表達(dá)兩組有顯著差異(P<0.001).

圖5 免疫細(xì)胞柱狀圖(A)和免疫細(xì)胞差異分析的小提琴圖(B)

將基因的表達(dá)量和免疫細(xì)胞的含量進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，圖6展示了IL2RA基因的表達(dá)量和免疫細(xì)胞的相關(guān)性情況.同時(shí)可以看出所有的免疫細(xì)胞和IL2RA基因的表達(dá)量都呈顯著相關(guān)(P<0.05)，其中天然B細(xì)胞(B cells native)、靜息狀樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells resting)、M1期巨噬細(xì)胞(Macrophages M1)、單核細(xì)胞(Monocytes)、活躍NK細(xì)胞(NK cells activated)、漿細(xì)胞(Plasma cells)、活躍CD4 T記憶細(xì)胞(T cells CD4 memory activated)、CD8 T細(xì)胞(T cells CD8)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)與IL2RA基因相關(guān)系數(shù)大于0，即二者之間呈正相關(guān).其余免疫細(xì)胞的含量與IL2RA基因呈負(fù)相關(guān)，即IL2RA基因的表達(dá)量越高，免疫細(xì)胞的表達(dá)量越低.

圖6 免疫細(xì)胞相關(guān)性

3 結(jié)論

本文對(duì)皮膚黑色素瘤的腫瘤微環(huán)境情況和打分進(jìn)行了系統(tǒng)、全面的表征分析，并對(duì)免疫浸潤細(xì)胞的占比等也進(jìn)行了展示.免疫細(xì)胞在不同腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)情況是不相同的.其中漿細(xì)胞，CD8 T細(xì)胞，活躍CD4 T記憶細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，單核細(xì)胞，M0期巨噬細(xì)胞和M2期巨噬細(xì)胞在高低評(píng)分兩組之間差異顯著.通過尋找預(yù)后相關(guān)基因和免疫基質(zhì)細(xì)胞評(píng)分獲得差異表達(dá)基因的交集，找到IL2RA基因，這說明IL2RA基因可能在皮膚黑色素瘤中起著重要的靶點(diǎn)作用.根據(jù)IL2RA基因的表達(dá)情況，分析病人的預(yù)后生存情況和其中免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞的含量比.綜上所述，本研究表明IL2RA基因?qū)ζつw黑色素瘤的預(yù)后有異質(zhì)性，并且發(fā)現(xiàn)所有免疫細(xì)胞的含量和IL2RA基因顯著相關(guān).此研究對(duì)皮膚黑色素瘤在腫瘤微環(huán)境和免疫細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行了闡釋，為日后臨床上的免疫治療提供了新的治療和研究靶點(diǎn).