免疫誘抗劑對浙貝母生長與抗病的影響

陳敏潔，楊超超，汪曉菲，阮松林，范慧艷*

(1.浙江中醫(yī)藥大學 藥學院，浙江 杭州 310053；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024)

植物在一定的外來物質(zhì)刺激下，能夠?qū)﹄S后的病原菌侵染(包括局部侵染和系統(tǒng)侵染)產(chǎn)生抗性，稱為植物的誘導抗病性，又稱系統(tǒng)獲得抗性或植物免疫[1-2]。該特性充分利用了植物自身對病害發(fā)生的潛在控制能力，通過調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)、代謝系統(tǒng)，誘導產(chǎn)生基礎(chǔ)免疫反應，延遲或減輕病害的發(fā)生和發(fā)展[3]。這種給植物帶來刺激的外源生物或分子稱為植物免疫誘抗劑，是一種新型生物農(nóng)藥，具有量少而效優(yōu)、環(huán)境相容性好的特點，給環(huán)境保護與作物增產(chǎn)帶來良好的影響。

誘抗劑可分為生物來源與非生物來源兩大類，非生物來源的誘抗劑包括無機鹽、有機酸、寡糖類、寡核苷酸、小分子多肽和免疫蛋白等。對于寡糖類植物免疫誘抗劑的開發(fā)，該類激發(fā)子多來源于動物、植物、微生物的外殼或細胞壁，在自然界含量極為豐富。目前鑒定到的寡糖類激發(fā)子主要有胞外多糖、幾丁質(zhì)、殼寡糖、木葡聚糖、海藻糖、海帶多糖等[4-6]。殼寡糖是幾丁質(zhì)脫乙?；螅?jīng)酸解或酶解得到的可溶性堿性寡糖。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖誘導植物抗病時的重要誘抗信號分子，能夠誘導柑橘果實[7]、灰霉孢子[8]活性氧的產(chǎn)生，抵御病原菌的入侵；可以促使棉花[9]、草莓[10]細胞活性氧代謝發(fā)生改變，顯著誘導早期活性氧的迸發(fā)；特定殼寡糖濃度處理煙草細胞，可以啟動茉莉酸合成途徑，使植物開啟抗性防御反應[11]；通過一氧化氮合酶(NOS)催化合成NO，Ca2+參與并調(diào)節(jié)該過程，進而影響煙草細胞相關(guān)抗性基因表達[12]。2013年杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院研制出3%殼寡糖水劑型的高效廣譜免疫誘抗劑?？奠`1號(BKL1)，該制劑對葡萄、草莓、鮮食糯玉米等植物的生長與抗病均有良好效果[13-16]。

浙貝母是浙江省的道地藥材之一，由于浙江省夏季高溫多雨，浙貝母栽培病害較重?；颐共?、黑斑病等是浙貝母的常見病害[17]，生產(chǎn)上常使用化學農(nóng)藥來防控，導致浙貝母鱗莖農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染問題日益嚴重。本研究開展了植物免疫誘抗劑BKL1在浙貝母生產(chǎn)上的田間應用試驗，探討植物免疫誘抗劑對浙貝母農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和抗病性的影響，旨在為浙貝母種植中農(nóng)藥減量增效技術(shù)的探索提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗以狹葉型浙貝母為試驗材料，于2020年11月4日在浙江中醫(yī)藥大學富春校區(qū)中藥材種苗繁育基地進行種植，選用大小均勻的浙貝母鱗莖作為種莖，種植小區(qū)面積約15 m2(一畦寬1 m，長15 m)，種植密度為20 cm×20 cm，每小區(qū)種植300株左右，3次重復。根據(jù)試驗田土壤地力水平較低的情況，施用50～70 t·hm-2有機肥作為基肥，其他種植技術(shù)參考道地藥材浙貝母的一般標準種植技術(shù)[18-19]。

1.2 處理設(shè)計

處理1，CK(清水對照)；處理2，BKL1水劑100倍液；處理3，BKL1水劑200倍液；處理4，BKL1水劑300倍液；處理5，BKL1水劑400倍液；處理6，BKL1水劑500倍液。分別于2021年3月9日、3月23日、4月7日、4月21日共噴施4次不同濃度的BKL1，每個處理重復3次。每次噴施后1周進行采樣以及測定。

每次采樣時隨機挑選各組10株浙貝母，分別取每株浙貝母的上中下葉各3片。選擇浙貝母健康植株中完整無損、長勢優(yōu)良的具代表性植株30株測定測定株高、莖粗、鱗莖體積等。

1.3 指標測定

1.3.1 SPAD測定

在藥劑噴施處理后1周，用SPAD-502-日本柯尼卡美能達手持式葉綠素測定儀測量葉片SPAD。對所有處理組進行隨機抽樣，每個處理組測量10株，每株隨機選取上、中、下層健壯無病蟲害的葉片(均在離葉尖1/3處測定)，每層測定3次，記錄數(shù)據(jù)，并取平均值。

1.3.2 苯丙氨酸解氨酶活性測定

參照苯丙氨酸解氨酶(PAL)測定試劑盒說明書提取粗酶液，在290 nm波長下用Bio Tek多功能酶標儀測定吸光度，計算苯丙氨酸解氨酶活性。

1.3.3 農(nóng)藝性狀以及產(chǎn)量、體積測定

藥劑處理噴施3次后，選擇浙貝母健康植株中完整無損、長勢優(yōu)良的具代表性植株30株，測定株高、莖粗。倒苗后，收獲浙貝母的鱗莖，從每個處理組取具代表性鱗莖50個，洗凈后擦干，測量鮮重；測量鱗莖體積時，取適宜體積燒杯(最小刻度精確至0.1 mL)，倒入適量水至整數(shù)刻度，讀數(shù)并記錄，放入適量需測量的鱗莖，確保液面在燒杯刻度范圍，待液面穩(wěn)定后，讀數(shù)并記錄。兩次體積差即為所測浙貝母鱗莖的體積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，Origin 2022軟件和Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)處理作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀

由表1可知，與CK組相比，不同濃度BKL1處理的浙貝母株高和莖粗差異不明顯，莖粗范圍在3.41～4.14 cm。從效果綜合來看，300倍液BKL1處理組農(nóng)藝性狀表現(xiàn)最好，說明BKL1在適宜濃度能促進浙貝母植株生長(抗倒伏)。

表1 不同濃度BKL1處理對浙貝母農(nóng)藝性狀的影響

2.2 葉片SPAD

由圖1可知，與CK相比，BKL1處理組中100倍液、200倍液和300倍液的浙貝母葉片SPAD在噴施第2次和第3次后整體升高，且隨BKL1濃度下降呈整體階梯狀上升。從效果來看，藥劑處理噴施2次時，浙貝母處在生長旺盛期(3月下旬至4月上旬)，葉片SPAD整體較高；藥劑處理噴施3次及以后，葉片SPAD階梯狀趨勢仍舊存在，由于處于倒伏期，光合作用下降，使栽培浙貝母整體SPAD下降。在浙貝母生長旺盛期，200～300倍液BKL1處理組效果最明顯，與CK相比分別增加55.8%～88.1%，說明BKL1在適宜濃度能促進浙貝母葉片葉色值的增加，加強光合作用。

圖1 BKL1處理對浙貝母葉片SPAD的影響

2.3 發(fā)病率和PAL活性

PAL的活性與植物抗病性呈正相關(guān)[20-21]。通過對浙貝母葉片PAL活性檢測(圖2)可知，與CK相比，BKL1處理中100倍液、200倍液、300倍液、400倍液組的PAL活性均有增長，其中300倍液BKL1處理組PAL活性最高。說明BKL1在適宜濃度能顯著提升PAL活性，增強浙貝母植株抗病性?；颐共?、黑斑病是浙貝母的主要田間病害。從定植開始到收獲期，統(tǒng)計種植區(qū)浙貝母發(fā)病情況，每個處理組按300株計算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同處理后浙貝母的病害發(fā)生率不同，經(jīng)BKL1處理的植株發(fā)病率明顯減少，400倍液BKL1處理組浙貝母植株發(fā)病率最少，為10.7%。

2.4 產(chǎn)量

由表2可知，與CK相比，BKL1處理組中浙貝母鱗莖產(chǎn)量都有明顯提高，300倍液、400倍液和500倍液BKL1處理組中浙貝母鱗莖產(chǎn)量顯著提高，其中300倍液BKL1處理組鱗莖產(chǎn)量相對增長87.3%；與CK相比，浙貝母平均鱗莖體積也有顯著提高，其中300倍液BKL1處理組浙貝母平均鱗莖體積相對增長43.3%，說明適宜濃度BKL1可通過增加浙貝母鱗莖的體積來提高浙貝母產(chǎn)量。

3 小結(jié)與討論

植物免疫誘抗劑是植物免疫工程技術(shù)出現(xiàn)的新領(lǐng)域，是當前環(huán)境保護、生物農(nóng)藥等方向的研究熱點，具有巨大的發(fā)展前景，它的應用使植物病蟲害的綠色防控有了新的突破，是有害生物綠色防控的新技術(shù)和新方法，是保障農(nóng)產(chǎn)品安全、減少環(huán)境污染、實現(xiàn)農(nóng)藥零增長的有效途徑[22]。本研究供試BKL1是利用3%殼寡糖研制而成的一種高效廣譜的植物免疫誘抗劑。研究表明，適宜濃度BKL1處理能促進浙貝母光合作用，提高葉片SPAD、增強PAL活性、優(yōu)化浙貝母農(nóng)學性狀、提高產(chǎn)量。綜合來看，200～400倍液BKL1處理效果較好，能夠一定程度上激活浙貝母的免疫系統(tǒng)，增強浙貝母抗病能力，促進浙貝母增產(chǎn)和品質(zhì)改善。

浙貝母是傳統(tǒng)“浙八味”藥材之一，它的生長期是當年9月份至次年5月份，從種植至采收一直處于氣溫比較低的階段，蟲害相對而言不是特別嚴重，而病害的發(fā)生比較普遍。作為歷史上的傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)，浙貝母在浙江地區(qū)被廣泛栽培，部分中藥材生產(chǎn)基地由于多年連續(xù)種植浙貝母，常見病害加重，最終導致產(chǎn)量嚴重下降，而部分藥農(nóng)盲目使用殺菌劑更是不利于可持續(xù)發(fā)展。在感病季節(jié)，連茬、種植密度、地勢等因素都會造成病害出現(xiàn)甚至群體暴發(fā)，需要科學合理地防控病害，來保證浙貝母入藥部位的產(chǎn)量和質(zhì)量，實現(xiàn)效益化可持續(xù)發(fā)展。目前，政府利用增施有機肥、測土配方施肥等途徑推廣農(nóng)藥技術(shù)，研究從施肥、大棚栽培、種植密度、輪套種、病害防治和繁殖方式等角度來探究提高浙貝母產(chǎn)量的有效途徑[23]。如何應用浙貝母種植過程中農(nóng)藥的減量增效技術(shù)以及達到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)浙貝母鱗莖生產(chǎn)計劃是本研究的目標，而免疫誘抗劑通過提高植物免疫誘抗性，能從根本上減少或避免農(nóng)藥的使用。本試驗供試的BKL1不僅提高植物自身抗病能力，促進植物生長，還能提高藥材安全性和產(chǎn)量，為浙貝母的綠色種植提供保障。