反復宮腔內(nèi)人工授精失敗患者IVF助孕受精失敗的高危因素及預測模型研究*

吳柱連，周 紅，汪彩珠，林若蕓，陳煥華，孫克儉，趙 鑫，甘賢優(yōu)，舒金輝

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，南寧 530000)

常規(guī)體外受精(in vitro fertilization,IVF)輔助生殖周期中，卵子低受精(<30%)和完全受精失敗發(fā)生率約為5%～10%[1]，而不明原因原發(fā)性不孕患者宮腔內(nèi)人工授精(intrauterine insemination,IUI)失敗后行IVF助孕完全受精失敗發(fā)生率約為20%[2]。受精失敗往往導致患者可利用胚胎數(shù)減少，甚至因無胚胎可移植而取消周期，給患者帶來沉重的經(jīng)濟及精神負擔。因此，預判受精結局，提前做好相關準備是保證患者助孕成功的第一步。短時受精行早受精觀察+補救ICSI是目前避免IVF受精失敗的重要手段。但有研究表明，短時受精導致多精受精率增加，并認為可能是由于短時受精過早地拆除顆粒細胞使卵母細胞過早脫離卵丘顆粒細胞微環(huán)境，以及機械操作損傷卵母細胞透明帶，最終導致多精受精發(fā)生[3]。因此，有些中心并非對所有患者行常規(guī)早受精觀察(拆除顆粒細胞)，而是有針對性地對受精失敗高風險患者進行早受精觀察。目前已有很多研究從臨床參數(shù)[4]、分子生物學[5-9]、免疫[10]等方面分別分析了受精失敗相關的風險因素，但至今尚無確切有效的預測受精失敗的方法，也未見能有效預測反復IUI助孕失敗患者改行IVF助孕受精結局預測模型的報道。本研究通過探討反復IUI失敗患者行IVF受精失敗的危險因素并建立logistic回歸預測模型，篩選出受精失敗高風險人群，為胚胎實驗室預判受精結局、開展相關補救工作提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料收集 回顧分析2020年1月～2021年11月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院生殖醫(yī)學中心因經(jīng)3次IUI助孕未孕改行常規(guī)IVF治療的201對患者夫婦的病例資料(IVF第1周期)。排除標準：未成功獲卵，卵子成熟率小于30%。

1.2 受精診斷與分組 受精后16～18h在倒置顯微鏡下觀察受精情況，出現(xiàn)雙原核判斷為受精。受精率=(受精數(shù)/總獲卵數(shù))×100%。根據(jù)IVF受精情況(補ICSI周期中ICSI部分卵子的受精情況不列入統(tǒng)計分析)分為受精失敗組(包括完全受精失敗和低受精，受精率<30%)及受精正常組(受精率≥30%)。

1.3 研究方法

1.3.1 促排卵治療 采用常規(guī)促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotrophin-releasing hormone agonist，GnRHa)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)促排卵方案。通過陰道B超和激素測定監(jiān)測卵泡生長情況，當1個優(yōu)勢卵泡直徑≥18mm或2個優(yōu)勢卵泡直徑≥17mm時肌注HCG(Serono，瑞士)10000IU，36h后陰道B超引導下穿刺取卵。

1.3.2 精液采集和處理 丈夫禁欲3～7d，手淫法收集當天新鮮精液，按WHO第5版《人類精液檢驗與處理實驗室檢驗手冊》推薦的方法進行精液質量分析。采用密度梯度離心法洗滌、上游，調至精子密度為(1～5)×106/mL并制作受精滴。

1.3.3 受精過程和補救ICSI 取卵后3～4h(HCG肌注后39～40h)把卵子加到預先制作的受精滴中；4～6h后將卵子轉移至不含精子的液滴中。對受精失敗高風險患者于加精4～6h后剝除部分卵母細胞的顆粒細胞行早受精觀察。以排出第二極體判斷為受精，受精率=(受精數(shù)/總獲卵數(shù))×100%。受精率<30%，判斷為受精失敗，立即予補救ICSI。

2 結 果

2.1 受精正常組和受精失敗組患者的一般臨床資料比較 共納入201個IVF周期，其中受精失敗組周期31個，受精正常組周期170個。兩組的女方平均年齡、女方不孕年限、男方不育類型、男方不育年限、處理前精子前向運動精子百分率和處理前精子正常形態(tài)百分率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 受精失敗組和正常受精組參數(shù)比較

2.2 IVF受精失敗預測模型的建立 將單因素分析中P﹤0.25[11]的變量(女方平均年齡、女方不孕年限、女方不孕類型、男方年齡、男方不育類型、男方不育年限、處理前精子前向運動精子百分率和處理前精子正常形態(tài)百分率)納入候選預測變量進行l(wèi)ogistic逐步回歸分析，建立受精失敗預測模型。得出最佳模型中包含了女方不孕類型、女方不孕年限、男方不育類型、前向運動精子百分數(shù)和正常精子形態(tài)率五個變量?；貧w分析結果表明，女方不孕年限、男方不育類型和處理前精子形態(tài)正常率是受精失敗的獨立影響因素(P<0.05)，模型方程：(1)p=ex/(1+ex);(2)X=-1.969+(-0.380×女方不孕類型)+(0.253×女方不孕年限)+(1.511×男方不育類型)+(-0.025×前向運動精子百分數(shù))+(-0.210×正常精子形態(tài)率)。方程中p為logistic模型預測概率，e為自然對數(shù)(e=2.718)。見表2。

表2 logistic回歸分析結果

2.3 IVF受精失敗預測模型的評價 通過分類交互表計算Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗統(tǒng)計量(χ2=3.823,df=8,P=0.873),差異無統(tǒng)計學意義,模型擬合觀察數(shù)據(jù)良好。通過預測-觀察交互分類表對模型預測的準確性進行評價。將樣本觀察數(shù)據(jù)回代到該預測模型,得到對樣本進行受精失敗預測的概率值,根據(jù)約登指數(shù)計算最優(yōu)預測概率分界值(P=0.186)，靈敏度為74.2%,特異度為75.3%。根據(jù)IVF受精失敗預測概率，繪制ROC曲線，曲線下面積為0.780(95%CI為0.691～0.868)(圖1)。

圖1 預測概率ROC曲線

3 討 論

3.1 受精失敗的影響因素 受精包括獲能、頂體反應、穿過顆粒細胞、與透明帶結合穿過透明帶、卵胞質融合及精子核解聚等步驟，在此過程中任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都可能導致受精失敗。卵子因素、精子因素、受精過程以及培養(yǎng)微環(huán)境也可導致受精失敗。目前關于精子形態(tài)在體外受精失敗中的預測價值作用存在爭議[12]。研究表明,體外受精失敗組的精子正常形態(tài)率顯著低于受精正常組，建議采用常規(guī)IVF受精時，應關注精子的畸形率[13]。一項包含了3922例常規(guī)IVF和843例ICSI周期的回顧性研究表明，在常規(guī)IVF中，正常精子形態(tài)百分率下降，受精率隨之下降；而在ICSI周期中受精率則不受影響[14]。但有文獻表明，精子形態(tài)對IVF受精結局沒有顯著影響。Keegan等[15]研究表明，精子正常形態(tài)百分率分別為0%、1%、2%、3%、4%、5%～7%和>7%的受精率、囊胚形成率、種植率和臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義。研究表明，精子形態(tài)對IVF受精率和優(yōu)胚率沒有影響，但是精子畸形率高，卵裂率降低[16]。本研究結果表明，在反復IUI失敗后行IVF助孕患者中，精子形態(tài)正常率是受精失敗的獨立危險因素(P=0.007，OR=0.81)；受精失敗組的平均精子形態(tài)正常率為4.24%，而受精正常組為6.84%。有研究認為，精子形態(tài)對IVF結局影響的數(shù)據(jù)異質性，可能與精子形態(tài)學的評估具有高度主觀性，易出現(xiàn)實驗室間和實驗室內(nèi)差異有關[17]。

女性年齡對IVF結局有明顯影響。女方年齡增加可引發(fā)線粒體功能障礙、非整倍體增加和表觀遺傳變化等問題[18]。Milan等[19]認為，在非男方因素不孕的常規(guī)IVF受精失敗病例中，女方年齡大、獲卵數(shù)少的特點尤為突出。本研究中，12例患者獲卵數(shù)≤5個，女方年齡(33.92±2.84)歲，平均獲卵數(shù)(3.25±1.06)個，均正常受精(可能與本研究女方平均年齡小有關)。因此，本研究并未將獲卵數(shù)少的病例排除。卵母細胞的數(shù)量和質量影響受精結局。本研究中，受精失敗組的女方平均年齡顯著小于受精正常組，獲卵數(shù)稍多于正常受精組。相對于高齡女性，年輕女性沒有明顯的線粒體功能、非整倍體和表觀遺傳變化等問題，受精結局理論上應優(yōu)于高齡女性。但是，年輕女性獲卵數(shù)較多，卵子成熟率降低、成熟度不夠的情況下，受精率反而可能下降。卵母細胞成熟度不夠是導致IVF受精失敗的重要因素，卵母細胞胞質不成熟可導致卵子激活失敗，不能完成第二次減數(shù)分裂，進而影響受精率[20]。男性年齡增加，伴隨精液體積減少、精子DFI升高以及精子損傷修復能力下降等問題[21-22]。本研究結果表明，受精失敗組和受精正常組的女方年齡存在顯著差異(P<0.05)，而男方年齡差異不顯著(P>0.05)。

本研究結果顯示，原發(fā)不孕是受精失敗的危險因素，原發(fā)不孕患者的受精失敗率為17.83%，與文獻報道受精失敗發(fā)生率約20%大致相符[2]。此外，較長不孕年限、存在男方不育因素行常規(guī)IVF時也可能更易發(fā)生受精障礙[23]。多項研究表明，女方IVF-ET完全受精失敗及低受精率與不孕年限和不孕類型等相關[24-25]。

3.2 預測受精失敗的方法 目前，雖然有些精子功能檢測方法，如透明帶結合試驗有一定預測價值，但這些方法操作步驟復雜且材料來源困難，尚不能在臨床常規(guī)檢驗中應用。文獻報道，優(yōu)選后精子的頂體異常率、精子畸形指數(shù)和DNA碎片指數(shù)(DFI)對IVF受精失敗均有預測價值[4]。值得注意的是，取卵當天優(yōu)選精子后不便開展以上相關試驗，而非取卵日的常規(guī)精液檢查先行精液優(yōu)選再做精液檢測相關試驗需消耗大量人力物力，目前不易推廣。此外，精子DFI對受精結局的預測能力備受爭議，ASRM(American Society for Reproductive Medicine)也不推薦對體外受精助孕患者常規(guī)行DFI檢測。也有報道使用運動精子總數(shù)預測體外受精中的受精結局，認為洗滌后前向運動精子總數(shù)是體外受精失敗的可靠預測指標[26]。本中心行IUI助孕患者要求洗滌后前向運動精子總數(shù)>10×106，遠大于文獻中提到的受精失敗高風險值，因此本文未將前向運動精子總數(shù)納入受精失敗分析指標。

反復IUI失敗后的患者一般首選IVF-ET方式繼續(xù)治療，這些患者中約20%發(fā)生低受精或完全受精失敗[2,27]。本研究中，3次IUI失敗后行IVF助孕的患者中受精失敗者占15.42%，與報道大致相符。有學者提出對反復IUI治療失敗(不明原因不孕)的患者直接行ICSI助孕，以避免IVF受精失敗[28]。但是，也有學者認為，ICSI技術的安全性不容被忽視。通過ICSI技術把自然情況下很難受精的精子直接注入卵子內(nèi)，不可避免地對卵子造成一定程度的損害，而且逃避自然選擇的精子也有可能將基因缺陷傳給下一代，因此其應用應僅限于有適應證者，避免ICSI應用的擴大化[29]。對反復IUI治療失敗患者用預測模型進行受精結局預測，針對受精失敗高危和非高危患者后續(xù)助孕方式制定個性化方案，更有利于在保證受精率的同時避免ICSI的應用擴大化。

綜上所述，本研究建立的預測模型納入指標都是臨床工作中常規(guī)記錄和檢測指標，方法簡單，所建立的受精失敗預測模型對反復IUI失敗后患者行IVF受精失敗有良好的預測價值。當預測概率P>0.186時，受精失敗風險較大，胚胎實驗室技術員應對這部分患者進行早受精觀察并及時行補救ICSI，既能減輕因IVF受精失敗給患者帶來的經(jīng)濟負擔和精神壓力，又能控制ICSI的應用范圍，避免其擴大化。