人臍帶間充質干細胞來源的外泌體對盆底脫垂患者陰道壁成纖維細胞的調(diào)節(jié)作用*

范琳媛，王靜璇，魏 薇，段愛紅，盧 丹

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院婦科,北京 100026)

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)是常發(fā)于中老年婦女的一類盆底功能障礙性疾病，其發(fā)病機制之一是成纖維細胞功能失調(diào)致盆底結締組織異常改變[1]。已有研究表明，POP患者細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成減少，陰道壁結締組織彈性和韌性明顯下降[2]。多項研究證實，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)可有效修復受損的盆底組織，促進盆底修復術后傷口恢復[3-5]。作為MSC旁分泌的主要物質，外泌體(exosome)不僅具有類似MSC功能，還具有組織修復、促進血管新生和免疫調(diào)節(jié)等作用，還因無致瘤風險、無免疫排斥、可批量化生產(chǎn)等優(yōu)點備受關注，表現(xiàn)出廣闊的臨床應用前景[6-7]。本研究探索了人臍帶間充質干細胞來源的外泌體(MSC-exosomes)對POP患者陰道壁成纖維細胞增殖、細胞外基質代謝的調(diào)節(jié)作用，旨在探究MSC-exosomes應用于POP患者陰道壁修復的可能，并為此提供理論數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 人源間充質干細胞 人臍帶間充質干細胞來自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，由趙春華教授實驗室贈送。

1.1.2 陰道壁成纖維細胞 選取因子宮脫垂行陰道前后壁修補手術的患者，患者55歲，已絕經(jīng)，子宮脫垂Ⅱ度。留取患者術后陰道壁組織，無菌保存于DMEM培養(yǎng)基，進行原代陰道壁成纖維細胞的分離。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.1.3 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12、胎牛血清(FBS)(Gibco)，青霉素和鏈霉素(華北制藥)，CellTiter 96?AQueous(MTS)單溶液細胞增殖檢測試劑盒(Promega)，PKH-67外泌體綠色熒光標記染料(Umibio)，RIPA蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑混合物、BeyoGelTMSDS-PAGE預制膠(碧云天生物技術公司)，10×SDS-PAGE電泳緩沖液(普利萊基因技術有限公司)，化學發(fā)光HRP底物試劑盒(Immobilon)；Actin抗體、Collagen Ⅰ抗體、LOXL-2抗體、Fibronectin抗體(Servicebio)，Collagen Ⅲ、MMP2抗體(武漢三鷹)，HRP標記山羊抗小鼠抗體和HRP標記山羊抗兔抗體(Servicebio)。

1.2 方法

1.2.1 陰道壁成纖維細胞分離和培養(yǎng) 取患者術后陰道壁組織，用PBS清洗3次，碘酒消毒15s，PBS清洗3次。剔除黏膜臍帶等非結締組織，無菌剪剪碎組織至1～2mm大，部分組織貼壁30min，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，剩余組織以0.1% Ⅰ型膠原酶37℃分次消化共2h。加0.5mL胎牛血清終止消化，1000r/min離心5min,棄上清，添加完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每隔2d換一次液，顯微鏡下拍照記錄細胞形態(tài)和生長狀況。待瓶底長滿細胞后，2.5mg/mL胰酶消化傳代，擴大培養(yǎng)至2～3代后使用。

1.2.2 間充質干細胞外泌體(MSC-exosomes)提取和鑒定 MSC擴大培養(yǎng)至第4代，細胞融合度約85%～95%時，PBS洗滌3次，換無血清基礎培養(yǎng)基H-DMEM培養(yǎng)48h。將無血清培養(yǎng)上清轉移至50mL離心管，3000g離心20min。將上清轉至圓底50mL離心管，低溫超速離心機10000g離心30min。將上清轉至低溫超速離心機配備的離心管，110000g低溫超速離心70～90min，重復2次。用1～2mL PBS重懸沉淀并收集，0.22μm濾器過濾除菌，BCA法測exosome蛋白濃度，分裝保存于-80℃冰箱。取新鮮提取的exosome，用PBS做不同梯度的稀釋，用電鏡觀察exosome的雙層膜囊泡樣形態(tài)，Western blot法檢測外泌體表面的HSP90、CD63蛋白及TSG101蛋白表達。

1.2.3 PKH-67外泌體標記染色和細胞攝取實驗 實驗步驟參照試劑盒操作說明書(實驗全程避光操作)，配置PKH-67染色工作液，將50μL染色液加至50～100μg外泌體中，蓋緊離心管蓋，渦旋振蕩混勻1min，靜置孵育10min。加10mL PBS混勻，按外泌體提取方法再次提取外泌體以除去多余染料，收集的沉淀即為染色后的外泌體。

將100μg/mL終濃度的PKH-67標記外泌體添加到MSC中，避光培養(yǎng)細胞12h或24h，去除含外泌體的培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加細胞固定液室溫固定10min，清洗避光，加Hochest染色液，室溫固定5min，PBS清洗3次，避光保存或熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 實驗設計和分組 MTS增殖實驗中，將第3代的MSC配置成1×105細胞/mL濃度的細胞懸液，取5塊96孔板，每孔加2×104個細胞，均勻鋪于96孔板，分別加終濃度為50μg/mL、100μg/mL的MSC-exosomes，對照孔中加相應體積的PBS，分別在加外泌體12、24、36、48、60h和72h時，MTS法檢測細胞增殖情況。將第3代的MSC配置成2×105細胞/mL濃度的細胞懸液，每孔加4×105個細胞，均勻鋪布于6孔板，分別加終濃度為50μg/mL、100μg/mL的MSC-exosomes，對照孔加相應體積的PBS緩沖液，分別在加入外泌體24h和48h后，收集蛋白，用于后續(xù)Western blot檢測。

1.2.5 MTS細胞增殖檢測 MTS溶液可被新陳代謝活躍的活細胞內(nèi)的脫氫酶類轉化成液態(tài)可溶的甲臢化合物，這種甲臢化合物在490nm具有最大吸收值，且測量值所表示的甲臢產(chǎn)物的數(shù)量與培養(yǎng)物中活性細胞的數(shù)量成正比。96孔板中的MSC細胞約在3h后即可貼壁，以此作為0h時間點，可進行MTS顯色。棄96孔板中細胞培養(yǎng)液，避光，每孔加20μL MTS溶液(5mg/mL)+100μL無FBS工作液，37℃避光培養(yǎng)2～3h。反應結束后于酶標儀中測定490nm處吸光值，進行數(shù)據(jù)處理及MTS增殖曲線繪制。

1.2.6 Western blot檢測 采用含PMSF的RIPA裂解液,每(5～6)×105個細胞加入約50～100μL裂解液,冰上裂解并收集蛋白，細胞裂解液于4℃離心機12000r/min離心20～30min，吸取上清至新的EP管中，BCA法測定蛋白濃度，煮沸蛋白待用。將SDS-PAGE預制膠安裝在電泳槽中，加滿1×SDS-PAGE電泳緩沖液，每泳道加等質量等體積的蛋白樣品或marker，以恒定電壓80V跑膠30min，后改為110V，繼續(xù)電泳至溴酚藍條帶到達分離膠底部時，停止電泳。濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜。5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1h，清洗后行一抗4℃孵育過夜，用TBST溶液清洗PVDF膜5次后加二抗溶液，室溫孵育1h，清洗5次，采用ECL發(fā)光試劑進行顯色。

2 結 果

2.1 MSC-exosomes的提取和鑒定結果 從分離得到的人臍帶間充質干細胞上清中提取得到exosome，Western blot檢測其表達exosome的標志蛋白HSP90和CD63，不表達內(nèi)質網(wǎng)蛋白TSG101(圖1A)。透射電鏡下可見exosome是具有雙層脂膜結構的圓形囊泡小體，其最長直徑約90nm(圖1B)，符合外泌體囊泡的粒徑大小。表明成功從間充質干細胞中分離得到了外泌體囊泡。

圖1 MSCs來源exosome的鑒定結果(Scale bar：200nm)

2.2 陰道壁成纖維細胞的分離和培養(yǎng) 采用組織爬塊法結合膠原酶消化法，成功培養(yǎng)得到陰道壁成纖維細胞。原代的成纖維細胞形態(tài)不規(guī)則，大多呈長梭形、扁平星形，部分呈三角形，原代中的細胞有許多沒有伸展的圓型細胞，細胞主要分布于組織塊周圍。經(jīng)一次消化和傳代后，第一代細胞多呈飽滿的長梭型或紡錘形，細胞排列成簇狀，在培養(yǎng)瓶中分布更均勻。第二代細胞較第一代細胞形態(tài)更瘦長，細胞排列更緊密，呈現(xiàn)渦旋狀態(tài)，部分交叉重疊生長。第三代細胞可見到部分細胞拉絲，細胞間排列欠規(guī)整(圖2)。

圖2 人陰道壁成纖維細胞形態(tài)圖(100×，Scale bar：100μm)

2.3 陰道壁成纖維細胞可有效攝取MSC-exosomes 用PKH-67親脂性染料對分離得到的外泌體進行熒光染色，重新提純后加至成纖維細胞培養(yǎng)基。其中PKH-67標記的exosome在熒光顯微鏡下可發(fā)出綠色熒光，藍色為Hochest標記的細胞核，MSC-exosomes的孵育濃度為100μg/mL。熒光顯微鏡下可見，12h時有少量綠色熒光的MSC-exosomes進入成纖維細胞胞漿內(nèi)，24h時幾乎所有細胞中均可見豐富的綠色熒光信號，表明MSC-exosomes可被陰道壁成纖維細胞有效大量攝取(圖3)。

圖3 MSC-exosome被陰道壁成纖維細胞攝取情況(Scale bar：100μm)

2.4 MSC-exosomes促進陰道壁成纖維細胞增殖 將50、100μg/mL終濃度的exosome添加到陰道壁成纖維細胞，MTS檢測到成纖維細胞在24h即出現(xiàn)增殖加快，36、48、60、72h時均觀察MSC-exosomes添加組細胞增殖明顯加快的現(xiàn)象，且各組差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)(圖4)，提示MSC-exosomes可有效促進陰道壁成纖維細胞的增殖。

圖4 MTS法檢測MSC-exosome對成纖維細胞增殖的調(diào)節(jié)作用

2.5 MSC-exosomes促進陰道壁成纖維細胞胞外基質的生成 Western blot檢測結果顯示，外源添加50μg/mL或100μg/mL終濃度的MSC-exosomes作用24h后，Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、LOXL-2、Fibronectin表達增加，其中Fibronectin表達升高最顯著，100μg/mL exosome添加組較50μg/mL添加組促進作用更明顯。Exosome持續(xù)添加48h和24h作用效果類似，但Collagen Ⅰ在48h時較24h時升高作用更明顯。MMP-2在exosome添加后均出現(xiàn)蛋白表達下降，表明細胞外基質降解減少。見圖5。

圖5 Western blot法檢測成纖維細胞胞外基質相關蛋白的表達

3 討 論

3.1 陰道壁成纖維細胞胞外基質減少是POP的重要原因 POP的發(fā)病機制復雜，盆底結締組織異常改變是其主要發(fā)病機制之一，細胞外基質作為結締組織的主要成分，在維持盆底結締組織彈性和韌性中起著重要作用，主要包括膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白等。以往研究均證實，POP患者的韌帶和陰道壁支持力度減弱均與細胞外基質減少相關[2,8]。陰道壁中成纖維細胞是細胞外基質合成分泌的重要來源，其功能失調(diào)與陰道壁膨出、子宮脫垂、尿頻和尿失禁等密切相關。研究表明，POP女性陰道壁中膠原蛋白、彈性蛋白及成纖維細胞形態(tài)特征均有顯著變化[9-10]。本研究從POP患者的陰道壁組織中分離得到了成纖維細胞，對其功能進行深入研究。前期實驗結果顯示，相較于POP-Ⅰ患者的陰道壁組織，POP-Ⅲ患者的陰道壁成纖維細胞生長更緩慢，且細胞外基質相關蛋白表達發(fā)生了明顯變化的現(xiàn)象。

盆底結締組織細胞外基質的主要成分是彈性纖維蛋白和膠原纖維蛋白。膠原蛋白對維持盆底結締組織的張力和強度起關鍵作用。在陰道及其支持組織內(nèi)主要為Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)和Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)，I型膠原直徑較粗，具有很高的抗張強度，Ⅲ型膠原具有柔韌性，可增加組織折疊性和伸展性。研究證實，POP患者陰道壁組織總膠原含量及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ含量都降低，且Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ發(fā)生失衡[11-12]。結締組織的彈力和韌性主要依賴于彈性纖維蛋白，而賴氨酰氧化酶家族(lysyl oxidase，LOX)是彈性纖維發(fā)育成熟和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關鍵酶。已有研究表明，LOX基因在POP患者的陰道壁、子宮主韌帶、骶韌帶中的表達下降，而類賴氨酰氧化酶1(lysyl oxidase-like 1，LOXL1)缺陷的小鼠則表現(xiàn)為盆底組織松弛以及肺容積增大，且成功建立了POP小鼠模型[13-14]?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)與組織重塑和細胞外基質的降解密切相關，結締組織間膠原纖維先在MMP-1、MMP-8等作用下裂解為大小不一的片段，再經(jīng)MMP-2、MMP-9消化進一步降解為氨基酸。此外，MMP-2、MMP-9還可直接降解彈性蛋白。以往研究均表明POP患者中子宮韌帶及陰道組織中MMP-2、MMP-8、MMP-9等表達上調(diào)，提示POP患者的膠原纖維和彈性纖維分解代謝增加[15]。

3.2 MSC-exosomes在調(diào)節(jié)成纖維細胞功能中的主要作用 MSC已被廣泛應用于治療組織損傷修復、自身免疫性疾病、退行性疾病等[16]，并可通過多種免疫調(diào)節(jié)機制改善COVID-19患者預后[17]。隨著對MSC研究的深入，現(xiàn)在普遍認為MSC發(fā)揮促進組織損傷作用不是通過細胞替代，而主要通過旁分泌作用參與組織損傷的修復[18]。

外泌體(exosomes)是直徑在30～160nm的微膜泡，是MSC旁分泌的一種重要的生物活性物質，已成為近年來的基礎醫(yī)學和臨床研究熱點。MSC-exosomes中含有大量且種類繁多的蛋白質、脂質、DNA、mRNA、miRNA和lncRNA等生物活性物質[19-20]。MSC-exosomes可減少損傷部位的纖維化面積，增加再生肌纖維數(shù)量，從而顯著改善肌肉再生[21]。文獻報道，人源骨髓間充質干細胞來源的CD63+外泌體可協(xié)助將外部Wnt3a信號傳遞給受體細胞，以促進真皮成纖維細胞增殖遷移和內(nèi)皮血管形成功能[22]。近期，有研究表明臍帶間充質干細胞來源的外泌體可通過PI3K/Akt信號通路促進表皮成纖維細胞的b-FGF和TGF-β1表達，以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成，從而進一步促進創(chuàng)面愈合，減少疤痕形成[23]。

本研究中，從人源間充質干細胞中提取得到exosome，其形態(tài)和大小符合外泌體形態(tài)，且高度表達外泌體特異的標志蛋白CD63和HSP90。MSC-exosomes可成功被陰道壁成纖維細胞攝取，促進成纖維細胞的增殖以及細胞外基質合成相關基因Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和LOXL-2的表達，并降低膠原分解代謝相關基因MMP-2的表達，從而減緩陰道壁組織的細胞外基質降解。纖維粘連蛋白(Fibronectin)是細胞外基質和基底膜中的主要非膠原性糖蛋白，在傷口的修復和愈合中起著十分重要的作用，是促進傷口愈合的關鍵物質[24]。本研究觀察到MSC-exosomes可明顯上調(diào)Fibronectin蛋白表達，提示MSC-exosomes可能有益于POP經(jīng)陰道修復患者的術后傷口愈合和恢復。

3.3 MSC-exosomes應用于POP患者陰道壁修復的可能性 POP的手術治療主要有傳統(tǒng)的自體組織修補手術以及應用網(wǎng)片的盆底重建手術。POP患者的陰道組織厚度和結締組織強度均明顯降低，在已受損或有異常膠原生成的薄弱陰道壁組織上進行手術修補，很難建立起一個強健穩(wěn)固的盆底以對抗腹壓，而臨床上陰道植入網(wǎng)片也常發(fā)生暴露和組織排異的并發(fā)癥[25]。因此通過增強陰道組織厚度及生物學強度，減少陰道植入聚丙烯網(wǎng)片并發(fā)癥，達到真正意義的盆底解剖和功能恢復，是臨床亟待解決的重要問題。

朱蘭等證明，臍帶來源間充質干細胞對卵巢摘除大鼠脆弱的陰道壁具有修復作用，干細胞治療后組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量變化明顯，且非血管肌層平滑肌比例顯著增加，血管生成因子表達增加[26]。該團隊隨后利用恒河猴模型，證實了陰道間充質干細胞移植可促進細胞外基質合成和新生血管肌形成，從而修復陰道薄弱組織，改善陰道生物力學性能，且提示這種修復作用可能是通過旁分泌作用實現(xiàn)的[27]。近期一項研究結果表明，血液來源外泌體促進了約克郡豬陰道網(wǎng)片暴露的愈合，減少了縫合關閉后網(wǎng)片再次暴露的發(fā)生率，促進了陰道組織的新生[28]。有研究比較了單次和多次外泌體治療在急性和慢性網(wǎng)片暴露中的作用，發(fā)現(xiàn)急性單次外泌體治療即可促進陰道上皮厚度增加，上皮細胞增殖增加，再生毛細密度提高1.5倍[29]。這些結果均證明外泌體在盆底疾病中的實用性。

目前關于MSC治療POP尤其是壓力性尿失禁已有多項臨床前和臨床試驗開展[30]。Yamamoto成功將自體臍帶組織來源的間充質干細胞，經(jīng)尿道注入尿道橫紋肌括約肌和黏膜下間隙，患者尿失禁在注射2周至6個月后逐漸改善，漏尿量及尿失禁次數(shù)均減少[31]。作為MSC的主要活性物質，MSC旁分泌的exosome不僅能模擬MSC的生物學功能，且與MSC相比，不存在栓塞、免疫排斥和致瘤的風險，且便于批量化生產(chǎn)、存儲，利用MSC-exosomes代替MSC進行移植治療可規(guī)避直接移植MSC帶來的局限性和安全性問題[32]。

目前尚無關于MSC-exosomes在盆底脫垂患者術后修復方面的臨床研究報道，但將MSC-exosomes應用于治療腎損傷、肝臟再生及下肢缺血等的臨床前動物實驗和臨床試驗在大量開展[33]。本研究從基礎實驗表明MSC-exosomes通過增強陰道壁成纖維細胞增殖，促進胞外基質中膠原蛋白、彈性蛋白以及纖維粘連蛋白合成，減少相關降解，從而增強陰道壁功能修復的可能性。

由于exosome中含有種類繁多的大分子，其治療作用的具體成分和治療機制尚需大量研究探索。MSC-exosomes調(diào)控陰道壁成纖維細胞功能的具體機制有待進一步明確，并在動物實驗開展相關治療性研究，為MSC-exosomes應用于盆底修復提供更多理論支持。