全懸浮馴化MDBK細胞應用于牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎二聯(lián)滅活疫苗的效果評估

楊青春，徐 凌，劉國英，范秀麗，王秉昆，王 凱，李曉燕 ，李 超，田志輝，陳 堅，趙麗霞，宋慶慶

(1.金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea,BVD)和牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是嚴重危害牛群健康的病毒性傳染病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來很大危害[1-6]。研究發(fā)現(xiàn)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)共同感染健康細胞與只感染1種病毒相比會加劇細胞凋亡速度，因此，研發(fā)一種新型牛病毒性腹瀉和牛傳染性鼻氣管炎(Bovine viral diarrhea and bovine rhinotracheitis，BVDV-IBRV)二聯(lián)苗非常重要[7-8]。

傳統(tǒng)貼壁細胞規(guī)?；囵B(yǎng)病毒主要采用轉(zhuǎn)瓶、細胞工廠或者微載體細胞培養(yǎng)方法，但是轉(zhuǎn)瓶和細胞工廠存在工藝復雜、容易污染、批間差大、生產(chǎn)成本高、效率低下等諸多問題[9]，微載體技術(shù)雖然提高了單位面積的細胞密度，但是也存在逐級放大困難、生產(chǎn)成本高等局限性[10]。所以能夠馴化出1株全懸浮培養(yǎng)牛腎細胞(Madin-Darby bovine kidney cell,MDBK)，在反應器中實現(xiàn)規(guī)?；囵B(yǎng)BVDV和IBRV，不僅解決上述傳統(tǒng)工藝中的諸多技術(shù)難題，而且能夠節(jié)約成本、提高細胞飼養(yǎng)密度和病毒滴度，通過反應器逐級放大的工藝技術(shù)，實現(xiàn)病毒抗原生產(chǎn)的自動化，而且該技術(shù)也是目前規(guī)模化疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的前沿技術(shù)[11-12]。

本試驗旨在馴化1株全懸浮無血清培養(yǎng)MDBK細胞株，在此基礎(chǔ)上，采用反應器逐級放大模式生產(chǎn)BVDV和IBRV，制備BVDV-IBRV二聯(lián)滅活苗，并通過免疫不同年齡階段的黑白花奶牛，檢測血清中BVDV和IBRV中和抗體效價，評價疫苗的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與種毒 MDBK細胞、BVDV(NMG株)和IBRV(LY株)，均購自金宇保靈生物藥品有限公司。

1.1.2 主要試劑 新生牛血清(NBS)，購自金源康生物科技有限公司；DMEM干粉培養(yǎng)基和胰酶，均購自Gibco公司；低血清和無血清CD干粉培養(yǎng)基，均購自建順生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 B2-生物安全柜，香港力申發(fā)展有限公司產(chǎn)品；IC1000自動細胞計數(shù)儀，Countstar公司產(chǎn)品；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；ISF1-XC恒溫振蕩培養(yǎng)箱，德國阿道夫科耐公司產(chǎn)品；XDS-1B倒置顯微鏡，卡薩帝公司產(chǎn)品；DASGIP四聯(lián)平行反應器(5 L)，Eppendorf(德國)公司產(chǎn)品；60 L和500 L生物反應器，均為北京清大天一科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 MDBK低血清全懸浮細胞馴化

1.2.1 MDBK貼壁細胞降血清馴化 取對數(shù)生長期的MDBK貼壁細胞，按照常規(guī)方法連續(xù)傳代，并將正常的MDBK貼壁細胞培養(yǎng)基(含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基)逐步按照低血清培養(yǎng)液(含3% 新生牛血清的CD培養(yǎng)基)含量占30%、50%和80%進行替換，期間觀察細胞的生長情況，待細胞適應該密度后，才能再次提高低血清培養(yǎng)液的含量，直至最終全部替換為低血清培養(yǎng)液，并且保證細胞能連續(xù)穩(wěn)定傳代。

1.2.2 MDBK低血清細胞懸浮馴化 將1.2.1中馴化的貼壁細胞，經(jīng)胰酶消化為單細胞懸液，用低血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，于37 ℃、5%CO2恒溫搖床100～110 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中會有細胞死亡，需要將1.2.1中馴化的細胞再次富集，直到懸浮細胞能夠連續(xù)穩(wěn)定傳代，該細胞株即為MDBK低血清懸浮細胞。

1.2.3 MDBK無血清細胞懸浮馴化 將1.2.2中的細胞1 000 r/min 離心5 min，棄上清，按照1.2.1中方法對低血清懸浮細胞進行無血清懸浮培養(yǎng)，替換培養(yǎng)期間保證細胞能連續(xù)穩(wěn)定傳代，最終全部替換為無血清CD培養(yǎng)基，然后將細胞懸液通過70 μm濾膜截留細胞團塊，繼續(xù)培養(yǎng)，反復過濾培養(yǎng)，直到細胞結(jié)團緩解后再更換為40 μm濾膜，重復上述步驟，直至得到MDBK無血清全懸浮培養(yǎng)細胞株。

1.3 MDBK無血清懸浮株初始接種密度的確定 將1.2.3中獲得的MDBK無血清懸浮細胞株離心，使用無血清CD培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為0.25×106、0.50×106、0.75×106個/mL 和1.00×106個/mL，置于37 ℃、5% CO2恒溫搖床，100～110 r/min培養(yǎng)，每天記錄細胞數(shù)量和細胞活力，直到細胞活力顯著下降，確定細胞初始接種密度。

1.4 MDBK無血清全懸浮細胞連續(xù)傳代 將1.2.3中獲得的MDBK無血清懸浮細胞株離心后，使用無血清CD培養(yǎng)基調(diào)整初始密度為1.3中確定的密度，置于37 ℃、5%CO2恒溫搖床，100～110 r/min培養(yǎng)48 h后，連續(xù)傳代，每次傳代初始密度均相同，記錄細胞數(shù)量和細胞活力。

1.5 MDBK擴大培養(yǎng)與BVDV和IBRV的產(chǎn)毒

1.5.1 MDBK細胞逐級放大培養(yǎng) 將MDBK無血清懸浮細胞株用無血清CD培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.0×106個/mL，共8 L懸液，分別打入2個5 L反應器中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，溶氧40%～60%，pH 7.0～7.2，轉(zhuǎn)速40～60 r/min，每天取樣觀察細胞數(shù)量和細胞活力，待細胞密度為8.0×106～8.2×106個/mL，活力為95%以上時，將培養(yǎng)細胞逐級放大于60～500 L反應器中。

1.5.2 BVDV和IBRV的接毒 (1)MDBK懸浮細胞接毒：取培養(yǎng)好的懸浮細胞加入到60 L反應器中，調(diào)整細胞密度為2×106個/mL，終體積為50 L，按照1%濃度分別接入BVDV和IBRV病毒液，培養(yǎng)條件同1.5.1，按照相同的方法將細胞擴大培養(yǎng)到500 L，接入BVDV和IBRV病毒液，取培養(yǎng)液加入4%的臺盼藍染色，觀察并計算細胞活力，待細胞活力下降到60%～70%后，收獲病毒液。(2)MDBK貼壁細胞接毒：將培養(yǎng)48 h的長成單層的MDBK細胞棄掉培養(yǎng)液后，更換含有2%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，分別按照1.5%和2.0%的濃度分別接入BVDV和IBRV病毒液，待細胞病變達到80%以上時收獲病毒液。

1.5.3 MDBK貼壁細胞和懸浮細胞培養(yǎng)BVDV和IBRV病毒滴度的測定 將收獲的所有病毒樣品用無血清DMEM培養(yǎng)基進行10倍梯度(1×10-1～1×10-7)稀釋，將1×10-4～1×10-7稀釋度的樣品按0.1 mL/孔加入96孔板中，每個濃度做8個重復，同時設(shè)置對照組，即只加無血清DMEM培養(yǎng)基。將上述加入液體的孔均同步鋪入MDBK貼壁細胞懸液0.1 mL，細胞密度為2×106個/mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察，記錄有細胞病變的孔，按照Reed-Muench方法[13]計算BVDV和IBRV病毒滴度。

1.6 BVDV和IBRV二聯(lián)苗免疫攻毒保護 將反應器收獲的BVDV和IBRV病毒液制備成二聯(lián)苗，按照2.00、1.00、0.50 mL/頭和0.25 mL/頭共4個劑量免疫健康易感牛，每個劑量組各頸部肌內(nèi)免疫10頭牛，一免后21 d以相同劑量進行二免，間隔14 d采血后攻毒，設(shè)置10頭牛作為攻毒對照組(BVDV和IBRV分別攻毒，各攻5頭)，攻毒使用BVDV的病毒含量為3.00 lgTCID50/mL，IBRV的病毒含量為7.50 lgTCID50/mL，每種病毒分別按照10 mL滴鼻，攻毒結(jié)束后連續(xù)觀察14 d，每日測定體溫并采集鼻拭子檢測排毒情況，按照1.6.1和1.6.2中BVD和IBR發(fā)病標準、評價動物發(fā)病情況。

1.6.1 BVD發(fā)病判定標準 體溫升高到40 ℃以上，持續(xù)至少2 d；取攻毒后8～10 d的鼻拭子進行PCR檢測，至少1 d的鼻拭子呈現(xiàn)BVDV核酸陽性，滿足以上情況判定為發(fā)??；否則判定為未發(fā)病。

1.6.2 IBR發(fā)病判定標準 體溫升高到40 ℃以上，持續(xù)至少2 d；取攻毒后8～10 d的鼻拭子進行PCR檢測，至少1 d的鼻拭子呈現(xiàn)IBRV核酸陽性，滿足以上情況判定為發(fā)??；否則判定為未發(fā)病。

1.7 BVDV和IBRV二聯(lián)苗臨床免疫效果評價 將反應器收獲的BVDV和IBRV病毒液制備成二聯(lián)苗，選擇不同日齡階段的牛只，包括犢牛(1～6月齡)、后備母牛(6～24月齡)和成年母牛(24月齡以上)各30頭，分別作為犢牛免疫組、后備母牛免疫組和成年母牛免疫組，將以上各組動物首次免疫，每頭牛2 mL，首免21 d后進行二免，間隔14 d后采集血清，另外隨機選擇不同日齡內(nèi)未免疫牛，共采集30頭牛血清作為空白對照組，根據(jù)參考文獻[14]檢測上述血清的BVDV和IBRV中和抗體效價。

1.8 統(tǒng)計分析 試驗結(jié)果以“平均值±標準差”方式表示。采用 SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用方差分析法進行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 MDBK低血清全懸浮細胞馴化 MDBK貼壁細胞由血清濃度為10%逐步降低為3%，再通過含3%血清的CD培養(yǎng)基馴化為1株能夠穩(wěn)定傳代的低血清MDBK懸浮株，細胞狀態(tài)如圖1A所示，說明該細胞適應了低血清CD培養(yǎng)基，雖然結(jié)團率比較高，但是細胞生長速度較快，細胞狀態(tài)較好。為了獲得MDBK無血清懸浮株，由低血清培養(yǎng)液逐步替換為無血清懸浮培養(yǎng)液，再通過層層過濾篩選出了結(jié)團率低并能穩(wěn)定傳代的MDBK無血清懸浮株，其對數(shù)期細胞狀態(tài)如圖1B所示，該細胞株為分散的單個細胞，形態(tài)近似圓形、大小均一，胞質(zhì)均勻透明，細胞邊界明顯，結(jié)團率明顯降低。

圖1 MDBK細胞逐步降血清馴化過程中細胞生長情況

2.2 MDBK無血清懸浮株初始接種密度的確定 MDBK無血清懸浮細胞4種起始密度相關(guān)的生長曲線如圖2所示，若初始接種密度為0.25×106個/mL，細胞無法快速進入對數(shù)生長期，影響后期細胞生長速度；若初始接種密度為0.50×106個/mL和0.75×106個/mL，細胞均能正常進入對數(shù)期，而且細胞活力保持在90%并且可維持144 h以上；若起始接種密度為1.00×106個/mL，細胞培養(yǎng)至4 d后活力開始大幅下降，所以綜合考慮，細胞最適接種密度在0.50×106～0.75×106個/mL,不得低于0.50×106個/mL。

圖2 MDBK細胞連續(xù)培養(yǎng)細胞活力和細胞密度

2.3 MDBK無血清全懸浮細胞連續(xù)傳代 在MDBK無血清懸浮細胞接種密度為0.50×106個/mL基礎(chǔ)上，培養(yǎng)2 d后傳代，并連續(xù)傳代10代以上，培養(yǎng)過程中細胞密度和活力如圖3所示，呈現(xiàn)非常規(guī)律的細胞密度曲線，細胞活力維持在較高水平，并且每次傳代后，細胞都能很快恢復生長速度，說明該MDBK無血清細胞懸浮株在初始密度為0.50×106個/mL時能夠穩(wěn)定連續(xù)傳代。

圖3 MDBK連續(xù)傳代細胞密度和細胞活力

在連續(xù)放大培養(yǎng)過程中，細胞大小均一、形態(tài)近圓形、細胞透亮、狀態(tài)良好，如圖4所示，反應器中的細胞生長狀態(tài)要好于搖瓶，主要由于反應器對于O2、CO2濃度和pH控制精度較高，能為細胞提供非常穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。

圖4 MDBK細胞擴大培養(yǎng)前后細胞狀態(tài)對比

2.4 MDBK擴大培養(yǎng)與BVDV和IBRV的產(chǎn)毒

2.4.1 MDBK擴大培養(yǎng)及BVDV和IBRV接毒 將狀態(tài)良好的500 L MDBK懸浮細胞分別接種1% 的IBRV和BVDV病毒，培養(yǎng)3 d和5 d后，于顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，如圖5所示，可以看出細胞界限模糊，透光度下降，臺盼藍染色后，死亡細胞增多，細胞活力明顯下降，下降原因是病毒在細胞中大量增殖，造成細胞病變甚至死亡，說明這2種病毒能夠侵染MDBK懸浮細胞。

圖5 MDBK細胞擴大培養(yǎng)接毒后細胞狀態(tài)

2.4.2 MDBK貼壁細胞和懸浮細胞培養(yǎng)BVDV和IBRV病毒滴度的測定 向貼壁MDBK細胞、60 L MDBK懸浮細胞以及擴大培養(yǎng)的500 L MDBK懸浮細胞分別接種BVDV和IBRV，測定收獲病毒液的病毒滴度，結(jié)果如表1所示，60 L懸浮細胞產(chǎn)毒量幾乎與貼壁細胞相同，而500 L擴大培養(yǎng)的病毒含量略微下降，主要原因可能是擴大細胞培養(yǎng)規(guī)模時，反應器控制精密度下降導致細胞活力略微下降。綜上所述，MDBK懸浮細胞可以適應BVDV和IBRV病毒增殖。

表1 BVDV和IBRV在MDBK貼壁和懸浮細胞病毒滴度

2.5 BVDV和IBRV二聯(lián)苗免疫攻毒保護 結(jié)果如表2所示，攻毒對照組中牛只BVDV和IBRV抗體水平均低于1∶2，攻毒后每頭牛均出現(xiàn)了IBR和BVD的癥狀，發(fā)病率達100%，說明分別使用病毒含量為3.00 lgTCID50/mL BVDV和7.50 lgTCID50/mL IBRV的活病毒液10 mL感染牛能致其個體發(fā)病。免疫劑量為1.00 mL/頭組中，BVDV攻毒結(jié)果顯示僅有1頭牛發(fā)病，4頭牛未發(fā)病，免疫保護率為80%；IBRV攻毒結(jié)果顯示，5頭牛均未發(fā)病，免疫保護率為100%。所有免疫攻毒牛中和抗體結(jié)果顯示，BVDV中和抗體效價≥1∶128的共有13頭，攻毒后均未發(fā)病，免疫保護率為100%；IBRV中和抗體效價≥1∶64的共有14頭，攻毒后均未發(fā)病，免疫保護率為100%，說明BVDV和IBRV二聯(lián)苗攻毒保護和中和抗體滴度存在線性關(guān)系，臨床可以應用抗體水平檢測評價疫苗的免疫效果。

表2 BVDV和IBRV血清學與免疫攻毒保護的相關(guān)性

2.6 BVDV-IBRV 二聯(lián)苗臨床免疫效果評價 免疫組牛群二免后14 d，對不同年齡段的牛采集血清，并對樣本中BVDV和IBRV中和抗體進行檢測，中和抗體效價的平均值如表3所示，后備母牛免疫組和成年母牛免疫組IBRV中和抗體效價高于空白對照組，差異極顯著(P<0.01)，犢牛免疫組IBRV抗體效價顯著高于空白對照組(P<0.05)；各免疫組中BVDV中和抗體效價均極顯著高于空白對照組(P<0.01)，所以由BVDV-IBRV二聯(lián)苗行業(yè)標準確定BVDV和IBRV中和抗體效價均能夠達到免疫保護效果，IBRV免疫保護效果與奶牛的日齡有關(guān)，日齡較小的奶牛其免疫保護效果較差；而BVDV免疫保護效果與奶牛日齡關(guān)系不大。

表3 二免后奶牛群BVDV和IBRV的中和抗體效價

3 討論

通過懸浮培養(yǎng)工藝制備抗原是未來生產(chǎn)獸用滅活疫苗主要的工藝流程，也是能夠制備出優(yōu)質(zhì)、高滴度病毒抗原的主要工藝手段。但是，目前尚未找到1株能夠適應BVDV和IBRV增殖的敏感懸浮細胞[15-16]，故本試驗通過貼壁-貼壁降血清-懸浮降血清-懸浮無血清3個過程[14]，將對病毒敏感的MDBK貼壁細胞逐步適應無血清懸浮培養(yǎng)環(huán)境，最終獲得了1株MDBK無血清懸浮細胞株，該細胞株生長速度非常快，在細胞密度為0.50×106個/mL的基礎(chǔ)上，MDBK細胞傳代時間為48 h，而且在漫長馴化過程中依舊沒有改變細胞對BVDV和IBRV敏感的遺傳特性，該細胞為大規(guī)模生產(chǎn)BVDV和IBRV提供了有利條件，實現(xiàn)抗原生產(chǎn)自動化，也對防控牛群中BVDV和IBRV隱形感染具有非常重大的意義。

MDBK懸浮株在由搖瓶逐級放大到500 L反應器過程中，生長穩(wěn)定。按照1%的接毒劑量接入病毒后，能夠穩(wěn)定收獲病毒液，但病毒收獲時間需要摸索，收獲太早病毒產(chǎn)生量未達到峰值，太晚病毒外殼會裂解、病毒失活，可以通過檢測不同時間段病毒滴度，確認收獲時間和收獲時細胞活力[12]。另外，細胞狀態(tài)好壞也與病毒滴度呈正相關(guān)，由于反應器自動化調(diào)節(jié)精度高，所以通過反應器制備抗原滴度明顯比搖瓶高5～10倍[17]。另外懸浮培養(yǎng)的病毒滴度與傳統(tǒng)貼壁工藝差距不大，而且反應器具有操作工藝簡單、批間差異小、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)效率高、污染概率低等優(yōu)點，所以反應器規(guī)模化制備病毒抗原可以替代傳統(tǒng)貼壁工藝，也是未來疫苗工藝的重要發(fā)展趨勢[18]。

綜合BVDV-IBRV二聯(lián)滅活疫苗的血清學和攻毒保護試驗結(jié)果分析顯示，對80%牛起到保護作用的BVDV中和抗體效價應不低于1∶128，對80%的牛起到保護作用的IBRV抗體效價應不低于1∶64，所以牛群BVDV和IBRV中和抗體分別≥1∶128和≥1∶64就可以保證免疫后動物能夠有效地抵抗強毒攻擊，這也可以為今后免疫持續(xù)期研究及疫苗免疫效果評價提供重要的數(shù)據(jù)參考。另外，相關(guān)研究也表明，高滴度的BVDV中和抗體能夠起到有效保護效果[19]。但是不同年齡段奶牛在接種BVDV-IBRV二聯(lián)滅活苗后，BVDV中和抗體效價水平一致，均達到較高的抗體滴度，對于IBRV抗體效價，犢?？贵w水平為1∶68，明顯低于后備母牛和成年母牛，但也可以起到有一定的免疫保護作用，為了保證犢牛免疫保護效果，需要犢牛群多次接種以提高中和抗體效價。

本試驗制備的BVDV-IBRV二聯(lián)滅活疫苗能夠有效防控我國BVD和IBR的傳播和流行，為更好促進養(yǎng)牛業(yè)健康和快速發(fā)展提供了有力的技術(shù)支持。