• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    馬立克氏病病毒RLORF1編碼蛋白通過抑制宿主IFN-β表達(dá)促進(jìn)病毒復(fù)制

    2022-12-09 11:25:18蔡云虹曹夢瑤劉文曉李永清
    中國獸醫(yī)雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:皰疹病毒宿主質(zhì)粒

    江 波,蔡云虹,曹夢瑤,2,劉文曉,程 晶,許 健,3,李永清

    (1. 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,北京 海淀 100097;2. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 昌平 102206;3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅 蘭州 730046)

    馬立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)屬于α皰疹病毒亞科,是雞馬立克氏病的病原,是一種雞高度易感的細(xì)胞結(jié)合型病毒,雞感染后表現(xiàn)為臟器的多發(fā)性腫瘤、神經(jīng)麻痹以及免疫系統(tǒng)損傷,常誘發(fā)其他病原體的合并感染[1]。目前,弱毒疫苗很大程度上控制了雞馬立克氏病的大規(guī)模暴發(fā),但不能清除雞群中潛伏的致病性MDV,也無法阻止在免疫壓力下田間MDV的毒力增強(qiáng)[2]。

    病毒感染宿主細(xì)胞后,宿主細(xì)胞通過模式識別受體識別病原相關(guān)分子模式后,通過調(diào)節(jié)干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor,IRF)、核轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(Nuclear transcription factor activator protein-1,AP-1)和核因子NF-κB等激活I(lǐng)型干擾素(Type I interferon,IFN-I)的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抗病毒免疫作用[3]。MDV感染后,宿主通過模式識別受體介導(dǎo)IFN-I產(chǎn)生來抵抗病毒感染的同時(shí),MDV也可以通過Meq、pp38、RLORF4等基因抑制宿主細(xì)胞IFN-I信號通路的激活,實(shí)現(xiàn)其在宿主體內(nèi)的復(fù)制[4-5]。α皰疹病毒的早期轉(zhuǎn)錄因子在病毒感染過程中可抑制宿主IFN-I信號通路激活,是α皰疹病毒抵抗宿主天然免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)感染的新途徑[6-7]。感染細(xì)胞蛋白0(Infected cell protein 0,ICP0)作為α皰疹病毒的早期轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白,可以通過多種途徑抑制宿主細(xì)胞IFN-I抗感染免疫作用。單純皰疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)可通過ICP0抑制人上皮成纖維細(xì)胞DNA中受體干擾素誘導(dǎo)蛋白16(Interferon gamma inducible protein 16,IFI16)活性,進(jìn)而阻斷干擾素調(diào)節(jié)因子3(IFN regulatory factor 3,IRF3)的活化,抑制干擾素-β(Interferon-β,IFN-β)的表達(dá)與分泌,增強(qiáng)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[8]。牛皰疹病毒I型(Bovine herpes virus 1,BoHV-1)的ICP0通過直接降解宿主IRF3抑制IFN-β抗感染免疫反應(yīng)[9]。偽狂犬病毒(Pseudorabies,PRV)的ICP0與P65蛋白互作后限制P65磷酸化,進(jìn)而抑制NF-κB信號通路的活化[10]。水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoste virus,VZV)的ORF61編碼蛋白利用其E3泛素連接酶活性阻斷NF-κB亞基入核,抑制IFN-β的抗感染作用[11]。

    MDV基因組中不具備典型的ICP0編碼基因,但其RLORF1基因與α皰疹病毒的ICP0編碼基因部分同源[12-13],提示了RLORF1可能在MDV感染過程中也發(fā)揮抑制天然免疫的作用。本試驗(yàn)利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)制備了缺失RLORF1基因的重組MDV(CVI988△RLORF1和RB1B△RLORF1),利用基因缺失毒和真核過表達(dá)質(zhì)粒,檢測RLORF1基因?qū)DV復(fù)制和宿主IFN-β應(yīng)答的影響,進(jìn)而研究RLORF1編碼蛋白在MDV抑制I型干擾素信號通路過程中的作用方式,以期為探明MDV致病機(jī)制提供新的線索。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒 雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblast,CEF):按常規(guī)方法取9~11日齡SPF雞胚制備單層CEF[14];DF-1細(xì)胞、馬立克氏病病毒MDV疫苗株CVI988/Risepens株、雞MDV疫苗株CVI988株及超強(qiáng)毒株RB1B株的細(xì)菌人工染色體(Bacteria artificial chromosome,BAC)系統(tǒng)及其拯救毒株、含有半乳糖激酶Galk基因(GenBank 登錄號:945358)的質(zhì)粒pSK-Galk,均由本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)雞MDVRLORF1基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGF-N1-RLORF1,由本實(shí)驗(yàn)室采用pEGF-N1(英濰捷基上海貿(mào)易有限公司)真核表達(dá)載體構(gòu)建并保存。

    1.2 主要試劑 DL2 000 DNA Marker,購自大連TaKaRa生物工程公司;質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化試劑盒,均購自天根生化科技有限公司;DMEM、MEM和轉(zhuǎn)染用營養(yǎng)液opti-MEM,均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;脂質(zhì)體LipofectamineTM3000,購自英濰捷基上海貿(mào)易有限公司;Poly(I∶C)、環(huán)鳥苷單磷酸腺苷(Cyclic GMP-AMPs,cGAMPs),均購自Selleck公司;Maxiprep質(zhì)粒提取試劑盒,購自QIAGEN公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動物 SFP級雞胚,購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

    1.4RLORF1基因缺失MDV的構(gòu)建 設(shè)計(jì)同源重組引物RLORF1-G-FP和RLORF1-G-RP,以pSK-Galk載體為模板,通過PCR擴(kuò)增攜帶MDVRLORF1基因同源臂的Galk基因片段。PCR程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。將獲得攜帶MDVRLORF1基因同源臂的Galk基因片段電轉(zhuǎn)化至含有MDV BAC的EL250大腸桿菌感受態(tài)中(電轉(zhuǎn)化條件:1 850 V,25 μF,100 Ω,1 mm),置于32 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5 d,挑取單克隆用Galk鑒定引物Galk PF和Galk PR進(jìn)行PCR鑒定。PCR程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。利用Galk平板將鑒定陽性的細(xì)菌單克隆劃線純化1次,提取質(zhì)粒后使用MDVRLORF1基因特異性引物RLORF1 PF和RLORF1 PR進(jìn)行PCR鑒定。PCR程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。選定Galk基因鑒定為陽性,同時(shí)RLORF1基因鑒定為陰性的重組EL250菌,提取MDV BAC質(zhì)粒。將重組MDV BAC DNA轉(zhuǎn)染含CEF的6孔板中(1 μg/孔,參照LipofectamineTM3000說明書)以用來拯救重組MDV。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后,將轉(zhuǎn)染的CEF進(jìn)行100倍稀釋后重新接種到新制備的CEF中繼續(xù)培養(yǎng)5 d,可以觀察到典型的MDV細(xì)胞病變效應(yīng),即為制備的RLORF1基因缺失MDV,擴(kuò)增后置液氮中保存,用于研究RLORF1基因在MDV復(fù)制和激活I(lǐng)FN-β反應(yīng)過程中的作用。本試驗(yàn)中所用引物信息見表1。

    表1 PCR引物信息

    1.5RLORF1基因缺失對MDV復(fù)制的影響 為研究RLORF1基因缺失對MDV復(fù)制的影響,將MDV(CVI988、CVI988ΔRLORF1、RB1B、RB1BΔRLORF1)接種CEF(6孔板,200 PFU/孔),置37 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),分別在24、48、72、96 h和120 h收取細(xì)胞,提取細(xì)胞總DNA,稀釋至50 ng/μL。采用SYBR Green熒光定量PCR方法,以 MDVMeq基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物(Meq PF:5′-CCCAACAGCCCCTCCAAACAC-3′,Meq PR:5′-CTTCATGGAGTTTGTCTACA-3′),10倍倍比稀釋CVI988 BAC和RB1B BAC質(zhì)粒并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測MDV的絕對含量。PCR程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,58.6 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。

    1.6RLORF1基因過表達(dá)對MDV復(fù)制的影響 將表達(dá)RLORF1基因的pEGF-N1-RLORF1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CEF(6孔板,2.5 μg/孔),以pEGF-N1空載體為對照,培養(yǎng)24 h后,將MDV(CVI988、RB1B)分別以相同劑量接種轉(zhuǎn)染了真核表達(dá)質(zhì)粒的CEF(6孔板,200 PFU/孔),在感染后的24、48、72、96 h和120 h收取細(xì)胞,提取總DNA檢測病毒復(fù)制水平,方法同1.5。

    1.7RLORF1基因?qū)DV誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN-β的影響 以野生型MDV(CVI988和RB1B)為對照,將MDV病毒(CVI988、CVI988ΔRLORF1、RB1B、RB1BΔRLORF1)接種CEF(6孔板,200 PFU/孔),置37 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),分別在24、48、72、96 h和120 h收取細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以雞GAPDH為內(nèi)參,采用SYBR Green熒光定量PCR方法檢測IFN-β的轉(zhuǎn)錄情況。PCR程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,58.6 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。

    1.8RLORF1基因?qū)F-1細(xì)胞表達(dá)IFN-β的影響 將表達(dá)RLORF1基因的pEGF-N1-RLORF1真核表達(dá)載體按照每孔0.25、0.50 μg和1.00 μg轉(zhuǎn)染12孔細(xì)胞板中的DF-1細(xì)胞,以1.00 μg pEGF-N1空載體為對照按照操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)24 h后分別用免疫刺激劑Poly(I ∶C)、cGAMPs處理細(xì)胞(1 μg/孔),12 h后收取細(xì)胞,提取RNA反轉(zhuǎn)錄后檢測IFN-β的轉(zhuǎn)錄情況,方法同1.7。

    2 結(jié)果

    2.1RLORF1基因缺失MDV的構(gòu)建 利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)拯救后分別利用MDVRLORF1特異性引物和Galk特異性引物對RLORF1基因缺失的重組MDV(CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1)進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn),CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1均無法擴(kuò)增出RLORF1基因(717 bp,GenBank登錄號:ADA83408.1),野生型MDV(CVI988和RB1B)能夠擴(kuò)增出RLORF1基因(圖1A),CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1能夠擴(kuò)增出標(biāo)記基因Galk(1 381 bp),而野生型CVI988和RB1B不能夠擴(kuò)增出Galk基因片段(圖1B),表明CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1病毒基因組DNA構(gòu)建成功。重組病毒轉(zhuǎn)染CEF后,均產(chǎn)生典型的MDV空斑,且重組病毒在形態(tài)上與野生型MDV具有相似的致細(xì)胞堆積的特點(diǎn)(圖2),表明重組RLORF1基因缺失MDV拯救成功。但CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1在CEF中復(fù)制時(shí)形成的MDV空斑面積明顯小于野生型MDV(圖2)。

    圖1 RLORF1基因缺失的重組MDV的PCR鑒定

    圖2 RLORF1基因缺失的重組MDV的細(xì)胞病變

    2.2RLORF1基因缺失抑制MDV的復(fù)制 CVI988ΔRLORF1重組病毒復(fù)制水平在24~120 h內(nèi)均顯著低于野生型CVI988病毒(P<0.001)(圖3A),同時(shí)RB1BΔRLORF1重組病毒復(fù)制水平在48~120 h內(nèi)均顯著低于其母本病毒RB1B(P<0.001)(圖3B)。結(jié)果表明,缺失RLORF1基因后MDV仍然可以進(jìn)行增殖,但缺失RLORF1基因可抑制MDV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

    圖3 RLORF1基因缺失對MDV復(fù)制的影響

    2.3RLORF1過表達(dá)增強(qiáng)MDV的復(fù)制 表達(dá)MDVRLORF1編碼蛋白的真核表達(dá)載體pEGF-N1-RLORF1可以在感染后的48~120 h顯著增強(qiáng)MDV CVI988的復(fù)制(P<0.001) (圖4A),表達(dá)MDVRLORF1編碼蛋白的真核表達(dá)載體pEGF-N1-RLORF1可以在感染后的24~120 h顯著增強(qiáng)MDV RB1B的復(fù)制水平(P<0.001)(圖4B)。結(jié)果表明,RLORF1編碼蛋白可以增強(qiáng)MDV的復(fù)制。

    圖4 RLORF1編碼蛋白對MDV復(fù)制的影響

    2.4RLORF1基因缺失MDV刺激宿主表達(dá)IFN-β的能力增強(qiáng) 在感染后的72~120 h內(nèi)CVI988ΔRLORF1誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于野生型MDV CVI988(P<0.05或P<0.001)(圖5A),在感染后的72~120 h內(nèi)RB1BΔRLORF1誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平也明顯高于野生型MDV RB1B(P<0.05或P<0.001)(圖5B)。結(jié)果表明,缺失RLORF1基因的MDV誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN-β的能力比野生型MDV強(qiáng),RLORF1編碼蛋白可能是MDV抑制宿主IFN-β產(chǎn)生的蛋白因子。

    圖5 RLORF1基因缺失對MDV誘導(dǎo)宿主細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生的影響

    2.5RLORF1基因編碼蛋白抑制宿主細(xì)胞IFN-β的轉(zhuǎn)錄 空白CEF和轉(zhuǎn)染pEGF-N1空載體的CEF在受到Poly(I∶C)和cGAMPs刺激時(shí)IFN-β轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào),且兩者之間無顯著差異(P>0.05)。然而,轉(zhuǎn)染pEGF-N1-RLORF1質(zhì)粒的CEF在受到Poly(I∶C)和cGAMPs刺激時(shí)IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于轉(zhuǎn)染pEGF-N1空載體的CEF(P<0.001)(圖6),說明MDVRLORF1基因在過表達(dá)情況下可以顯著抑制宿主細(xì)胞表達(dá)IFN-β的能力。

    圖6 過表達(dá)RLORF1基因?qū)Υ碳┱T導(dǎo)DF-1細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生的影響

    3 討論

    近年來,以MDV CVI988/Rispens株及MDV 814中國分離株為代表的弱毒活疫苗的大規(guī)模接種初步控制了馬立克氏病大規(guī)模暴發(fā)[15-17]。然而,鑒于MDV特殊的“潛伏-再活化”感染機(jī)制,弱毒疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)不能徹底清除潛伏感染的MDV病毒粒子,在雞T細(xì)胞中潛伏感染的MDV會在雞免疫低下或應(yīng)激時(shí)再次被激活,并經(jīng)羽毛皮屑等向環(huán)境排毒,導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境中持續(xù)存在MDV強(qiáng)毒粒子,使得養(yǎng)雞業(yè)仍然面臨巨大風(fēng)險(xiǎn)[18-19]。免疫抑制導(dǎo)致的混合感染和繼發(fā)感染是MDV給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失的重要原因,需要進(jìn)一步揭示宿主抗MDV感染免疫機(jī)制,解決免疫抑制導(dǎo)致的混合感染和繼發(fā)感染問題。本試驗(yàn)以MDV抑制先天性免疫反應(yīng)為切入點(diǎn),首次發(fā)現(xiàn)了MDVRLORF1編碼蛋白可以抑制宿主IFN-β的表達(dá)進(jìn)而有利于病毒復(fù)制這一現(xiàn)象。

    為研究MDVRLORF1基因在病毒感染過程中的作用,本試驗(yàn)利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)將MDV超強(qiáng)毒株RB1B和疫苗毒株CVI988的RLORF1基因進(jìn)行缺失。MDV缺失毒CVI988ΔRLORF1和RB1BΔRLORF1均可以在CEF中復(fù)制并產(chǎn)生MDV典型細(xì)胞堆積樣空斑,說明在MDV超強(qiáng)毒株和弱毒株中RLORF1基因均為病毒復(fù)制的必需基因。HSV-1的RLORF1基因編碼蛋白ICP0缺失后,病毒同樣可以復(fù)制,但致病性和復(fù)制能力明顯減弱[20]。在本試驗(yàn)中MDVΔRLORF1在CEF中形成的空斑形態(tài)典型,但空斑面積較野生型MDV明顯變小,且缺失RLORF1之后MDV復(fù)制能力比野生型MDV明顯減弱,說明RLORF1基因盡管不是MDV復(fù)制的必需基因,但在病毒復(fù)制中發(fā)揮著正向調(diào)控的作用,從功能上與α皰疹病毒的ICP0相似[21]。轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pEGF-N1-RLORF1過表達(dá)RLORF1基因時(shí),MDV的復(fù)制能力明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染空表達(dá)載體pEGF-N1時(shí)的MDV,可見RLORF1基因過表達(dá)可以促進(jìn)MDV在CEF中的復(fù)制。研究發(fā)現(xiàn),α皰疹病毒多通過抑制IFN-I的抗病毒反應(yīng)來增強(qiáng)病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[22]。本試驗(yàn)后繼檢測了RLORF1基因缺失以及過表達(dá)對病毒誘導(dǎo)的宿主IFN-I通路激活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MDVRLORF1基因缺失毒復(fù)制能力弱于野生型母本毒,但誘導(dǎo)IFN-β的能力明顯強(qiáng)于野生型母本毒,說明MDVRLORF1編碼蛋白在其感染過程中發(fā)揮了抑制宿主INF-β表達(dá)的作用。在病毒模擬物誘導(dǎo)IFN-I激活的試驗(yàn)中也得到了相同的結(jié)果。病毒RNA模擬物Poly(I∶C)和cGAS激活劑cGAMPs可以用來激活CEF中的IFN-I信號通路進(jìn)而上調(diào)IFN-β的轉(zhuǎn)錄[23-24]。在DF-1細(xì)胞中過表達(dá)RLORF1可以破壞Poly(I∶C)和cGAMPs對CEF IFN-I信號通路的激活,這進(jìn)一步說明了MDVRLORF1基因表達(dá)產(chǎn)物可以抑制宿主IFN-I信號通路。盡管轉(zhuǎn)錄蛋白RLORF1抑制宿主細(xì)胞IFN-I信號通路激活的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,但綜上結(jié)果表明,MDV感染過程中可通過RLORF1編碼蛋白抑制宿主IFN-I信號通路,從而有利于病毒的復(fù)制。

    本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)了MDV的RLORF1轉(zhuǎn)錄蛋白具備通過抑制IFN-β表達(dá)以增強(qiáng)自身復(fù)制的能力,為探明MDV感染導(dǎo)致宿主免疫抑制的發(fā)生機(jī)理提供參考,也為研究MDV感染機(jī)制提供了新的線索。

    猜你喜歡
    皰疹病毒宿主質(zhì)粒
    病原體與自然宿主和人的生態(tài)關(guān)系
    科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:22
    龜鱉類不可能是新冠病毒的中間宿主
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    荔枝草提取物體外抗單純皰疹病毒Ⅰ型的研究
    中成藥(2018年4期)2018-04-26 07:13:03
    溶瘤單純皰疹病毒治療腫瘤的研究進(jìn)展
    表現(xiàn)為扁平苔蘚樣的慢性移植物抗宿主病一例
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    人乳頭瘤病毒感染與宿主免疫機(jī)制
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    久久亚洲国产成人精品v| 777米奇影视久久| 国产综合精华液| 婷婷色综合www| 亚洲国产成人一精品久久久| 内射极品少妇av片p| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 91久久精品国产一区二区三区| 97热精品久久久久久| 日本黄色片子视频| 高清视频免费观看一区二区 | 久久人人爽人人爽人人片va| 久久久色成人| 日日啪夜夜爽| 99视频精品全部免费 在线| 日韩伦理黄色片| 乱人视频在线观看| 午夜精品在线福利| 99热这里只有是精品50| av在线蜜桃| 丰满人妻一区二区三区视频av| 男女视频在线观看网站免费| av线在线观看网站| 国产av码专区亚洲av| ponron亚洲| av国产免费在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人性生交大片免费视频hd| 少妇的逼水好多| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美精品国产亚洲| 久久久久九九精品影院| 日韩视频在线欧美| 日韩人妻高清精品专区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 最近的中文字幕免费完整| 青春草视频在线免费观看| av.在线天堂| 99热网站在线观看| 春色校园在线视频观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 高清午夜精品一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 性色avwww在线观看| 内地一区二区视频在线| 国产精品1区2区在线观看.| av国产免费在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 人妻系列 视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 中文欧美无线码| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产麻豆成人av免费视频| 日韩一区二区视频免费看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲国产欧美在线一区| 成年人午夜在线观看视频 | av免费观看日本| 舔av片在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 黄色欧美视频在线观看| 22中文网久久字幕| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 韩国av在线不卡| 国产又色又爽无遮挡免| 日日啪夜夜撸| 搡老妇女老女人老熟妇| 内地一区二区视频在线| 亚洲第一区二区三区不卡| 97超视频在线观看视频| 能在线免费观看的黄片| 久久久久久久久久成人| 亚洲国产av新网站| 精品一区二区三区视频在线| 久久亚洲国产成人精品v| 2021天堂中文幕一二区在线观| 乱人视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 在线天堂最新版资源| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 毛片一级片免费看久久久久| 成人综合一区亚洲| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产色婷婷99| 我的老师免费观看完整版| 国产成年人精品一区二区| 日韩亚洲欧美综合| 午夜视频国产福利| 精品久久久久久久久亚洲| 久久6这里有精品| 成年av动漫网址| 免费av不卡在线播放| 日日撸夜夜添| 国内精品宾馆在线| 国产伦精品一区二区三区四那| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 男女国产视频网站| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产精品综合久久久久久久免费| 一夜夜www| 婷婷色av中文字幕| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品人妻久久久影院| 99久久精品国产国产毛片| 可以在线观看毛片的网站| 国产黄a三级三级三级人| a级毛片免费高清观看在线播放| 美女主播在线视频| 亚洲国产欧美人成| videossex国产| 国内精品宾馆在线| 国产一级毛片在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 成人亚洲精品一区在线观看 | 免费观看的影片在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 少妇高潮的动态图| 在线观看一区二区三区| 久久97久久精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产伦理片在线播放av一区| 国产黄色免费在线视频| 18禁在线播放成人免费| 国产精品一二三区在线看| 18+在线观看网站| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产麻豆成人av免费视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产有黄有色有爽视频| 七月丁香在线播放| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产 一区 欧美 日韩| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产 一区精品| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 一区二区三区高清视频在线| 欧美一区二区亚洲| 国产一区有黄有色的免费视频 | 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 成人性生交大片免费视频hd| 久久久久免费精品人妻一区二区| 97超视频在线观看视频| 免费看日本二区| 免费av不卡在线播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久久久性生活片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 99热6这里只有精品| 99re6热这里在线精品视频| 久久这里只有精品中国| 久久精品夜色国产| 精品酒店卫生间| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品一区www在线观看| 伦精品一区二区三区| 99久久精品热视频| 国产成人aa在线观看| 国产探花极品一区二区| 高清av免费在线| 天堂俺去俺来也www色官网 | 天天躁日日操中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品久久久久久久久亚洲| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日日撸夜夜添| 亚洲精品456在线播放app| 欧美日韩综合久久久久久| 一级a做视频免费观看| 如何舔出高潮| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲国产精品成人综合色| 免费少妇av软件| 亚洲真实伦在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产男人的电影天堂91| 99久国产av精品| 免费观看在线日韩| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 人人妻人人看人人澡| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲精品国产成人久久av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美精品一区二区大全| 69av精品久久久久久| 免费观看精品视频网站| 亚洲av成人精品一二三区| 午夜爱爱视频在线播放| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 直男gayav资源| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲欧美清纯卡通| 看十八女毛片水多多多| av在线天堂中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲真实伦在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 免费看不卡的av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 51国产日韩欧美| 女人久久www免费人成看片| 亚洲无线观看免费| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久久久久久久丰满| 日韩精品青青久久久久久| 97热精品久久久久久| 久久久久免费精品人妻一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美精品一区二区大全| 美女cb高潮喷水在线观看| 麻豆成人av视频| 亚洲自偷自拍三级| av黄色大香蕉| 少妇丰满av| 熟女人妻精品中文字幕| 成年女人看的毛片在线观看| 色播亚洲综合网| 欧美潮喷喷水| 亚洲美女视频黄频| 91精品国产九色| 国产爱豆传媒在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 搡老乐熟女国产| 观看免费一级毛片| 日本wwww免费看| 少妇人妻精品综合一区二区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 婷婷色综合www| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 欧美日韩综合久久久久久| 偷拍熟女少妇极品色| 国产免费又黄又爽又色| 精品一区二区免费观看| 欧美 日韩 精品 国产| av网站免费在线观看视频 | 亚洲在久久综合| 麻豆国产97在线/欧美| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲四区av| 国产精品.久久久| 色综合站精品国产| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品一区www在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产综合精华液| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产伦精品一区二区三区视频9| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲国产精品专区欧美| 欧美极品一区二区三区四区| 91av网一区二区| 最近2019中文字幕mv第一页| 1000部很黄的大片| 大香蕉97超碰在线| 全区人妻精品视频| 丰满少妇做爰视频| 黄色配什么色好看| 校园人妻丝袜中文字幕| 麻豆成人av视频| 久久久久久国产a免费观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 直男gayav资源| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成年免费大片在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 成人性生交大片免费视频hd| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产黄色小视频在线观看| a级一级毛片免费在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 街头女战士在线观看网站| 成年人午夜在线观看视频 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲最大成人中文| 日日干狠狠操夜夜爽| av在线亚洲专区| 色综合站精品国产| 亚洲人成网站在线观看播放| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲怡红院男人天堂| 午夜福利成人在线免费观看| av播播在线观看一区| 水蜜桃什么品种好| 国产爱豆传媒在线观看| 国产成人aa在线观看| 国产精品一区二区性色av| 国产在视频线精品| 在线天堂最新版资源| 亚洲高清免费不卡视频| 一个人看的www免费观看视频| 一个人免费在线观看电影| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 激情 狠狠 欧美| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产av不卡久久| 日本一本二区三区精品| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品国内亚洲2022精品成人| 少妇的逼好多水| 国产高清三级在线| 亚洲av免费在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲综合色惰| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 草草在线视频免费看| 欧美 日韩 精品 国产| 深夜a级毛片| 人妻系列 视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 免费看av在线观看网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲精品国产av蜜桃| av免费观看日本| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品国产三级专区第一集| 国产精品一区www在线观看| 身体一侧抽搐| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 久久97久久精品| 不卡视频在线观看欧美| 嫩草影院新地址| 亚洲性久久影院| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| or卡值多少钱| 内射极品少妇av片p| 天美传媒精品一区二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 看十八女毛片水多多多| 精品久久久精品久久久| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲欧美一区二区三区国产| 男女边摸边吃奶| 麻豆成人午夜福利视频| 在线观看av片永久免费下载| 免费在线观看成人毛片| 亚洲欧美精品专区久久| 国产精品久久久久久久久免| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品久久久久久久久久久久久| 久久久久久伊人网av| 国产综合懂色| 亚洲内射少妇av| 秋霞伦理黄片| 嫩草影院精品99| 国产午夜精品论理片| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美人与善性xxx| 日韩成人av中文字幕在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美成人a在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 在现免费观看毛片| 日韩一区二区视频免费看| 久久久久久久午夜电影| 欧美日本视频| 久久99热这里只频精品6学生| 九草在线视频观看| 日韩欧美精品免费久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 老司机影院成人| 欧美精品一区二区大全| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 美女高潮的动态| 亚洲精品日韩av片在线观看| 日本三级黄在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 成人美女网站在线观看视频| av一本久久久久| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产精品成人综合色| 国产男女超爽视频在线观看| 五月天丁香电影| 男的添女的下面高潮视频| 三级毛片av免费| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品伦人一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 午夜久久久久精精品| 亚州av有码| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 三级经典国产精品| 日本一二三区视频观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 成人二区视频| 美女国产视频在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 激情 狠狠 欧美| 国产探花极品一区二区| 能在线免费看毛片的网站| 国产免费福利视频在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久99精品国语久久久| 免费黄网站久久成人精品| 久久99热这里只有精品18| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| av免费在线看不卡| 国产淫语在线视频| 青青草视频在线视频观看| 99久久九九国产精品国产免费| 午夜福利在线观看吧| 三级国产精品欧美在线观看| 日韩一区二区三区影片| 日韩精品有码人妻一区| 在线观看人妻少妇| 丰满乱子伦码专区| 岛国毛片在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 日本黄色片子视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲在线自拍视频| 舔av片在线| 99久久九九国产精品国产免费| 午夜免费激情av| 久久久亚洲精品成人影院| 婷婷色av中文字幕| 我的女老师完整版在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 一夜夜www| 色网站视频免费| 好男人在线观看高清免费视频| 日韩精品青青久久久久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲av.av天堂| 日韩电影二区| 嫩草影院新地址| 人体艺术视频欧美日本| 国产麻豆成人av免费视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 又爽又黄a免费视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 日韩av在线大香蕉| 我的老师免费观看完整版| 久久99热6这里只有精品| 国产精品av视频在线免费观看| 成人综合一区亚洲| 日韩成人av中文字幕在线观看| av天堂中文字幕网| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 哪个播放器可以免费观看大片| 午夜久久久久精精品| 97在线视频观看| 国产探花极品一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 午夜福利在线在线| 久久久久久久久久久丰满| 精品久久久久久久久av| 亚洲最大成人中文| 在现免费观看毛片| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 18禁在线播放成人免费| 人体艺术视频欧美日本| 韩国av在线不卡| 国产精品av视频在线免费观看| 日韩电影二区| 久久6这里有精品| 日本黄大片高清| 欧美3d第一页| 免费电影在线观看免费观看| 久久久欧美国产精品| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产高潮美女av| 又爽又黄无遮挡网站| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品人妻久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 国产午夜福利久久久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 成年女人在线观看亚洲视频 | 久久久久久久国产电影| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日韩伦理黄色片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久草成人影院| 亚洲自偷自拍三级| 日本熟妇午夜| 久久久久网色| 国产精品无大码| 老女人水多毛片| 嫩草影院精品99| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品第二区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产激情偷乱视频一区二区| 毛片一级片免费看久久久久| 久久精品人妻少妇| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产色片| 最新中文字幕久久久久| a级一级毛片免费在线观看| 午夜福利视频精品| 亚洲精品视频女| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久精品综合一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 99热网站在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 毛片女人毛片| 日韩中字成人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久午夜福利片| 亚洲av国产av综合av卡| 国产综合懂色| 日本av手机在线免费观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久久国产一区二区| 黄色一级大片看看| 能在线免费观看的黄片| 日本wwww免费看| 国产精品不卡视频一区二区| 免费观看的影片在线观看| 免费观看a级毛片全部| 成年女人在线观看亚洲视频 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 中国国产av一级| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品456在线播放app| 高清av免费在线| 一个人看的www免费观看视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品一及| 日本熟妇午夜| 最近的中文字幕免费完整| 国产成人免费观看mmmm| 久久精品国产亚洲av涩爱| 好男人在线观看高清免费视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 人人妻人人看人人澡| 日本一二三区视频观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 可以在线观看毛片的网站| 久久午夜福利片| 中文欧美无线码| 成年女人在线观看亚洲视频 | 在线观看人妻少妇| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 国产综合懂色| 成人午夜高清在线视频| 亚洲精品视频女| 日本一本二区三区精品| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 十八禁国产超污无遮挡网站| 欧美激情在线99| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 国产成人91sexporn| 欧美+日韩+精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 丰满人妻一区二区三区视频av| 免费大片黄手机在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲精品乱久久久久久| 色综合色国产| 少妇熟女欧美另类| xxx大片免费视频| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品一二三区在线看| 高清av免费在线| 精品国产露脸久久av麻豆 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕 |