獼猴源大腸桿菌藥敏試驗(yàn)與高致病性毒力島基因的檢測(cè)

韓冬梅，陳柄汛，趙維薇，萬(wàn) 全，鄧 靜，王 喜，張 博，呂龍寶，肖 鵬，高 洪

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，云南 昆明 650201 ；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

獼猴(Macacamulatta)又稱“恒河猴”，具有與人類相似的生理生化和代謝特征，大腦發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，容易馴養(yǎng)繁殖，因此獼猴被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有利于科研工作的順利進(jìn)行，但是在獼猴的飼養(yǎng)繁育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其腹瀉發(fā)病率較高，不利于養(yǎng)猴業(yè)持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展[1]。引起獼猴腹瀉的原因有很多，其中大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是溫血?jiǎng)游锬c道中廣泛存在的共生細(xì)菌，在一定條件下也是引起腸道疾病的常見(jiàn)病原體[2]。E.coli大量存在于人和動(dòng)物中，一旦產(chǎn)生致病性E.coli對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)是致命打擊，并且有些飼養(yǎng)管理者會(huì)使用抗菌藥對(duì)猴群進(jìn)行集體治療和預(yù)防，這導(dǎo)致E.coli耐藥菌株增加，大大提高了飼養(yǎng)成本。

高致病性毒力島(High pathogenicity island,HPI)最初于耶爾森菌中發(fā)現(xiàn)，是耶爾森菌中1個(gè)35～45 kb 的基因組，攜帶的基因與鐵載體耶爾森桿菌素合成、調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[3]。具有毒力島的基本特征：(1)載有耶爾森菌素與毒力相關(guān)的編碼基因； (2)僅存在于強(qiáng)毒株； (3)G+C mol%與耶爾森菌染色體有明顯差異； (4)染色體片段一般大于35 kb； (5)為一緊密、明確的遺傳學(xué)單位； (6)一側(cè)外緣與酰胺-轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(Asparagine-transfer ribonucleic acid,asn-tRNA)基因相連; (7)載有“可移動(dòng)”的基因[4-5]。HPI主要含有與攝取鐵有關(guān)的毒力基因簇，編碼參與攝取及合成鐵載體耶爾森桿菌素的鐵抑制蛋白基因及其調(diào)節(jié)基因，來(lái)行使“鐵的攝取功能”[6]。其中鐵調(diào)節(jié)蛋白2(Iron regulatory protein 2, irp2)基因?yàn)殍F調(diào)節(jié)基因并且核苷酸序列具有高度保守性[7]，是HPI的標(biāo)志基因[8]。大量的研究表明，HPI能介導(dǎo)細(xì)菌的致病性，HPI+菌株致病性強(qiáng)于HPI-菌株[9-10]。大量文獻(xiàn)證明，HPI可以通過(guò)噬菌體介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移存在于不同腸道菌(如大腸埃希菌、構(gòu)株酸桿菌、克雷伯菌和沙門(mén)菌等)[11-13]和不同種屬中，嚴(yán)重影響著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，使養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益變差。因此，不可忽略E.coliHPI+對(duì)獼猴養(yǎng)殖業(yè)的影響。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)采集的23份腹瀉獼猴糞便進(jìn)行E.coli分離鑒定、HPI全基因組攜帶情況檢測(cè)、紙片擴(kuò)散法檢測(cè)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，探索HPI基因攜帶率與耐藥性和致病率之間的關(guān)系，為研究E.coli引起獼猴腹瀉的致病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，并為昆明動(dòng)物研究所靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖基地的飼養(yǎng)管理和疾病預(yù)防提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 于2020年10月在中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)繁殖基地采集了23只腹瀉獼猴的糞便，離心管收集，冰袋保存運(yùn)輸。

1.1.2 主要試劑 2×TaqPCR Master Mix,購(gòu)自北京百泰克生物有限公司；DL2 000 DNA Marker,購(gòu)自博邁生物科技有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB(Luria-Bertani)瓊脂和LB肉湯，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)革蘭染色液，購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)小鼠品種為昆明小鼠，雌性，體重約為30 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滇)K2020—0004]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 將采集的腹瀉獼猴源糞便樣品分別用5 mL生理鹽水稀釋，用無(wú)菌挑菌環(huán)挑取稀釋后的糞便樣品在麥康凱培養(yǎng)基平板上劃線，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱隔夜培養(yǎng)。待第2天早上用挑菌環(huán)挑取麥康凱平板上的粉紅色單菌落在LB平板上劃線,放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)后取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，至OD600值達(dá)0.6～0.8，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)菌革蘭染色及生化鑒定 取LB平板上的單菌落，根據(jù)革蘭染色液說(shuō)明書(shū)的方法分別進(jìn)行涂片固定、初染、水洗、媒染、脫色、復(fù)染6個(gè)步驟，最后在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。E.coli生化鑒定按照說(shuō)明書(shū)的方法取LB液體純培養(yǎng)物分別接種于麥芽糖、乳糖、蛋白胨、硫化氫、甘露醇、尿素、葡萄糖共7個(gè)微量生化鑒定管。

1.2.3 分離菌株HPI基因檢測(cè) 在 NCBI 網(wǎng)站 GenBank 中檢索E.coliHPI 中 12 個(gè)基因的序列，通過(guò) BLAST 得到各基因編碼區(qū)(Coding sequence,CDS)的保守區(qū)，使用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物由碩擎生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

取純化菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，去離子水7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(退火溫度見(jiàn)表1)30 s，72 ℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以 2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，最后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)推薦的紙片法(Kirby-Baure)將分離純化的E.coli菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，?200 μL菌液均勻致密地涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基上，取阿米卡星、多黏菌素、氯霉素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮、頭孢噻肟、苯唑西林、四環(huán)素、頭孢唑林、頭孢曲松等藥敏片均勻貼到培養(yǎng)基表面，為防止藥敏紙片掉落先平置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱1 h后，再倒置培養(yǎng)18～24 h觀察藥敏結(jié)果。按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷。

1.2.5 致病性試驗(yàn) 取12只健康的小鼠隨機(jī)分為3個(gè)組：HPI陽(yáng)性(HPI+)組、HPI陰性(HPI-)組和空白組，每組4只。將篩選出的攜帶HPI全基因組的E.coli感染豬小腸上皮細(xì)胞，觀察出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)最明顯的菌株選定為HPI+菌株，從HPI基因攜帶率為0的E.coli菌株中隨機(jī)選出1株作為HPI-菌。隨后將HPI+和HPI-菌液都稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，分別腹腔注射0.5 mL菌液于對(duì)應(yīng)分組的小鼠，空白組腹腔注射0.5 mL LB液體培養(yǎng)基。3個(gè)組小鼠分別飼養(yǎng)并觀察，記錄各組小鼠臨床表現(xiàn)及死亡情況，剖檢死亡小鼠，取腸道組織分離細(xì)菌并鑒定。

1.2.6E.coliHPI全基因組測(cè)序 將篩選出攜帶HPI全基因組的E.coli感染豬小腸上皮細(xì)胞，觀察出現(xiàn)CPE最明顯的2株菌株(H-7和H-23)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，委托北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。為了更加直觀地了解基因在正、反義鏈上的分布情況、基因組序列信息、基因組序列的GC含量等，構(gòu)建H-7、H-23菌株基因組圈圖并進(jìn)行基因功能注釋，包括蛋白相鄰類的聚簇(Clusters of Orthologous Groups,COG)、基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes,KEGG)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與鑒定 本試驗(yàn)從23份腹瀉樣品中成功分離獲得23株分離菌，分離率為 100%。分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上為桃紅色的單菌落(圖1A)，在LB平板上為突起、光滑、圓形的單菌落(圖1B)，革蘭染色呈紅色短桿狀，成對(duì)或單個(gè)出現(xiàn)(圖1C)。

圖1 細(xì)菌分離結(jié)果

將分離菌株接種于細(xì)菌微量生化管,鑒定結(jié)果如表2所示，分離菌均能利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蛋白胨，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，硫化氫試驗(yàn)和尿素試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，符合E.coli特性。

表2 菌株生化鑒定結(jié)果

2.2 分離菌株HPI基因檢測(cè)E.coliHPI 12個(gè)全島基因檢測(cè)的凝膠電泳成像結(jié)果見(jiàn)圖2，HPI基因攜帶情況為23株E.coli中21株含HPI基因，攜帶率為91.30%，其中共11株E.coli檢測(cè)出含irp2基因，陽(yáng)性率為47.83%；15株E.coli檢測(cè)出含irp1基因，陽(yáng)性率為65.22%；8株E.coli檢測(cè)出含irp3基因，陽(yáng)性率為34.78%；11株E.coli檢測(cè)出含irp4基因，陽(yáng)性率為47.83%，16株E.coli檢測(cè)出含irp5基因，陽(yáng)性率為69.57%；13株E.coli檢測(cè)出含irp6基因，陽(yáng)性率為56.62%；10株E.coli檢測(cè)出含irp7基因，陽(yáng)性率為43.48%；9株E.coli檢測(cè)出含irp8基因，陽(yáng)性率為39.13%；10株E.coli檢測(cè)出含irp9基因，陽(yáng)性率為43.48%；8株E.coli檢測(cè)出含fyuA基因，陽(yáng)性率為34.78%，這8株菌株同時(shí)也檢出全部含irp2基因，陽(yáng)性率為100%；15株E.coli檢測(cè)出含intB基因，陽(yáng)性率為65.22%;6株E.coli檢測(cè)出含ybtA基因，陽(yáng)性率為26.09%。該批樣品ybtA基因攜帶率最低，為26.09%，irp5基因攜帶率最高，為69.57%，其中攜帶HPI全島基因的E.coli共有5株，占樣品總量的21.74%。

圖2 HPI基因的PCR擴(kuò)增

2.3 藥敏試驗(yàn) 5株攜帶HPI全島基因的E.coli對(duì)試驗(yàn)藥物多數(shù)呈耐藥狀態(tài)，對(duì)頭孢類藥物中頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢唑林具有耐藥性的分別有4、4、4株和5株；對(duì)氯霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、苯唑西林和四環(huán)素具有耐藥性的分別有1、3、3、5株和5株；這5株E.coliHPI+對(duì)多黏菌素的耐藥性都處于中介(表3)。5株攜帶HPI全島的E.coli都表現(xiàn)為多重耐藥，全部耐3種以上抗菌藥。

表3 5株攜帶HPI全島基因大腸桿菌分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 致病性試驗(yàn) 小鼠感染細(xì)菌后12 h的存活情況如圖3所示，HPI+組小鼠感染HPI+菌株在8 h內(nèi)全部死亡，占100%，而HPI-組感染HPI-菌株的小鼠在12 h內(nèi)有1只小鼠死亡，占25%，空白組小鼠始終保持正常。死亡小鼠被毛粗亂無(wú)光澤，肛門(mén)附近沾有糞便，剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)肝淤血呈黑褐色，胃膨大，內(nèi)含黃白色物體，小腸菲薄，腸內(nèi)充滿氣體和淡黃色稀薄內(nèi)容物，黏膜充血呈淡紅色(圖4)。取HPI+組死亡的小鼠腸道進(jìn)行組織涂板后，分離獲得的菌株與攻毒菌一樣，均為E.coli，且從HPI+組死亡小鼠中分離出的E.coli攜帶HPI的陽(yáng)性率為100%。

圖3 小鼠存活情況

圖4 小鼠剖檢結(jié)果

2.5 菌株H-7和H-23基因組圈圖和基因功能注釋

2.5.1 菌株H-7和H-23基因組圈圖 通過(guò) Prokka(1.13)軟件對(duì)菌株H-7和H-23的高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，H-7預(yù) 測(cè) 到5 300個(gè)編碼基因，其總長(zhǎng)4 728 917 bp，平均長(zhǎng)度892 bp。非編碼核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)預(yù)測(cè)中，核糖體核糖核酸(Ribosomal ribonucleic acid,rRNA)有24個(gè)、轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(Transfer ribonucleic acid，tRNA)有96個(gè)、轉(zhuǎn)運(yùn)-信使核糖核酸(Transfer-messenger ribonucleic acid,tmRNA)有1個(gè)、其他核糖核酸(Miscellaneous ribonucleic acid,misRNA)有236個(gè)；H-23預(yù)測(cè)到5 460個(gè)編碼基因，其總長(zhǎng)4 811 637 bp，平均長(zhǎng)度881 bp。非編碼RNA預(yù)測(cè)中，rRNA有24個(gè)、tRNA有89個(gè)、tmRNA有1個(gè)、miscRNA有212個(gè)。利用預(yù)測(cè)得到的基因組信息用Circlize繪制H-7、H-23基因組圈圖(圖5)，H-7基因組全長(zhǎng)5 273 592 bp，G+C mol%為50.45%；H-23基因組全長(zhǎng)5 415 449 bp，G+C mol%為50.32%。菌株H-7和H-23的基因圈圖由外到內(nèi)第1圈為基因組序列信息；第2圈為基因組序列的GC含量曲線，可見(jiàn)該菌株在全基因組平均GC含量線中上下波動(dòng)頻繁，但波動(dòng)幅度不大；第3圈為基因組序列的GC skew曲線以2 000 bp為一滑窗在基因組上滑動(dòng)，統(tǒng)計(jì)的平均GC含量；虛線展示了GC skew為0的參考線；第4圈為二代測(cè)序深度及覆蓋度信息以2 000 bp為一滑窗在基因組上滑動(dòng)，統(tǒng)計(jì)的平均測(cè)序深度，反應(yīng)出不同區(qū)域的Reads覆蓋情況；虛線展示了整體水平的平均Reads覆蓋度；第5圈為三代測(cè)序深度及覆蓋度信息以2 000 bp為一滑窗在基因組上滑動(dòng)，統(tǒng)計(jì)的平均測(cè)序深度，反應(yīng)出不同區(qū)域的Reads覆蓋情況；虛線展示了整體水平的平均Reads覆蓋度；第6圈展示了參考基因組中的基因編碼區(qū)(CDS)以及非編碼RNA區(qū)(rRNA、tRNA)，以內(nèi)外兩層表示，外層代表正鏈，內(nèi)層代表負(fù)鏈。

圖5 H-7(A)和H-23(B)基因組圈圖

2.5.2 菌株H-7和H-23的COG 注釋 將H-7、H-23菌株預(yù)測(cè)得到的基因序列與 COG功能數(shù)據(jù)庫(kù)做 BLAST+(2.9.0+)比對(duì)，得到的基因功能注釋結(jié)果如圖6所示，H-7和H-23分離株基因通過(guò)COG分析，分別得到2 870個(gè)和2 782個(gè)基因信息分到22類COG中，主要與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(G)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(E)、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化(C)有關(guān)。

圖6 H-7(A)和H-23(B) COG 結(jié)果分類

2.5.3 菌株H-7和H-23的GO注釋 將H-7和H-23分離株基因組數(shù)據(jù)通過(guò)GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果，如圖7所示，分別共有7 563個(gè)和7 651個(gè)基因，分為生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能三大類，大部分基因富集在細(xì)胞成分。

圖7 H-7(A)和H-23(B)GO注釋結(jié)果分類

2.5.4 菌株H-7和H-23的KEGG 注釋 使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)H-7菌株的2 818個(gè)基因和H-23菌株的2 846個(gè)基因進(jìn)行注釋，并將基因分為五大類，主要分布為細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和生物系統(tǒng)。其大部分基因主要富集在碳代謝過(guò)程，如圖8所示。

圖8 H-7(A)和H-23(B) KEGG pathway結(jié)果分類

3 討論

獼猴作為我國(guó)使用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，我國(guó)共有6個(gè)亞種，分別為海南亞種、指名亞種、川西亞種、西藏亞種、福建亞種和河北亞種，均為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[14]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康問(wèn)題影響著試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，而獼猴腹瀉在靈長(zhǎng)類動(dòng)物飼養(yǎng)基地是較為常見(jiàn)的一種疾病，發(fā)病后會(huì)使獼猴營(yíng)養(yǎng)不良、繁殖率降低，甚至?xí)?dǎo)致仔猴死亡[15]，嚴(yán)重危害靈長(zhǎng)類動(dòng)物的飼養(yǎng)管理，不利于高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的產(chǎn)出，應(yīng)該引起高度重視。本試驗(yàn)采集的23份腹瀉獼猴糞便，經(jīng)革蘭染色、生化鑒定分離得到23株E.coli，分離率為100%。在23株E.coli中HPI各基因攜帶率由高到低為irp5(69.57%)>irp1(65.22%)=intB(65.22%)>irp6(56.62%)>irp2(47.83%)=irp4(47.83%)>irp7(43.48%)=irp9(43.48%)>irp8(39.13%)>irp3(34.78%)=fyuA(34.78%)>ybtA(26.09%),說(shuō)明HPI各基因攜帶率具有差異。其中fyuA攜帶率比irp2低，可能是由于fyuA處于毒力島功能核心區(qū)的邊緣,HIP的不穩(wěn)定性使其在不斷進(jìn)化的過(guò)程中,更易于被破壞和改變[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示從獼猴腹瀉糞便中分離出來(lái)的E.coli存在HPI，耶爾森菌素 (Yersiniabactin,Ybt)鐵載體介導(dǎo)的鐵獲取是HPI的主要功能，E.coli中存在HPI可增強(qiáng)E.coli的環(huán)境適應(yīng)力和感染力。其次，雖然E.coli中存在多種鐵獲取系統(tǒng)，但Ybt鐵載體對(duì)Fe3+具有較高的親和力，有研究表明鐵載體不僅在鐵運(yùn)輸中起作用，還可能抑制宿主免疫應(yīng)答[17-18]。HPI不僅是豬源、禽源、兔源等常見(jiàn)動(dòng)物E.coli的重要毒力因子[19-20]，還存在于日常生活不常見(jiàn)的動(dòng)物中。如史秋梅等[21]報(bào)道在腹瀉水貂源性E.coli中檢測(cè)出HPI基因irp2和fyuA；高平光等[22]報(bào)道在腹瀉的6只狐貍中有4只狐貍的E.coli檢測(cè)出含有HPI基因irp2和fyuA;徐繼英等[23]報(bào)道在奶牛源E.coli也檢測(cè)出含HPI基因irp2和fyuA;宋曉莉等[24]通過(guò)對(duì)10份腹瀉羔羊源糞便進(jìn)行增菌培養(yǎng),制備DNA模板,并用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中攜帶HPI的E.coli占樣品的一半，表明HPI已經(jīng)通過(guò)質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移[25]，在不同種屬間廣泛存在，嚴(yán)重危害公共安全，其潛在的流行病學(xué)意義不容忽視。本試驗(yàn)成功分離出的獼猴源致病性E.coliHPI+菌株為耶爾森菌HPI在不同種屬間水平轉(zhuǎn)移提供了重要依據(jù)。本試驗(yàn)分離攜帶HPI全基因組的5株E.coli對(duì)10種常用獸用抗菌藥的耐藥率都較高，其中5株E.coliHPI+分離株對(duì)苯唑西林、四環(huán)素和頭孢唑林均能產(chǎn)生耐藥性，只有對(duì)氯霉素和多黏菌素耐藥性較低，故在獼猴飼養(yǎng)管理實(shí)際生產(chǎn)中可以聯(lián)合使用氯霉素和多黏菌素進(jìn)行治療。在致病性試驗(yàn)中小鼠腹部注射E.coliHPI+菌后在8 h內(nèi)4只全部死亡，而接種E.coliHPI-菌的小鼠在12 h內(nèi)僅死亡1只。說(shuō)明含HPI強(qiáng)毒力島會(huì)增強(qiáng)E.coli的致病性。本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序獲得了H-7、H-23基因組圖譜、GO、COG和KEGG注釋，通過(guò)GO、COG、KEGG注釋進(jìn)一步清楚了解E.coliHPI+菌株中編碼基因的作用方式、特征以及所參與的代謝通路，為E.coliHPI+分子致病機(jī)制研究提供了初步線索。

綜上所述，23份獼猴源性腹瀉樣品中分離鑒定得到23株E.coli，分離率為100%，其中攜帶HPI基因有21株，占91.30%，攜帶HPI全島菌株有5株，占21.74%。HPI通過(guò)水平轉(zhuǎn)移存在于不同源性的E.coli中，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全,后續(xù)可以深入研究獼猴源E.coliHPI+菌株的致病機(jī)理，為預(yù)防獼猴腹瀉病提供科學(xué)依據(jù)。藥敏試驗(yàn)說(shuō)明攜帶HPI全島基因的E.coli耐藥性極高，提示可以進(jìn)一步研究高耐藥性是否與攜帶HPI有關(guān)。通過(guò)高通量測(cè)序獲得了基因組圖譜、GO、COG和KEGG注釋，得到了大量的生物學(xué)信息，可為更好地了解E.coliHPI的發(fā)病機(jī)制提供參考。